CN107782836A - 一种uplc‑ms‑ms快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种UPLC‑MS‑MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法，包括：（1）收集待区分的熏硫白芍与非熏硫白芍药材，制成标准汤剂样品；（2）将样品进入UPLC‑MS‑MS系统分析，得到质谱数据；（3）将原始采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，进行数据分析；（4）采用动态规划计算法校正色谱峰漂移，对齐色谱峰，利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物；（5）利用方差分析计算样品间差异性的物质，确定熏硫白芍与非熏硫白芍的差异性。本发明将化合物质谱信息输出为原始文件，不需转换成其他格式，可直接导入至Compound Discoverer2.1库中搜索化合物，该方法能够实现快速锁定中药材样本中存在的差异性化合物，适用于大批量样本快速分析测定。

Description

一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的 方法

技术领域

本发明属于中药成分研究技术领域，具体涉及一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法。

背景技术

白芍是中药处方中常用的一味养肝补血药，有传统加工方法为芍药根经去皮水煮后硫磺熏制再干燥。目前白芍的产地初加工方法主要采用水煮至透心后晒干，但由于煮后不易晒干、且容易发霉，因此药农普遍采用硫磺熏蒸，尤其在安徽亳州等白芍主产区，约50%的白芍均采用硫磺熏蒸方法，而且至少要熏蒸2~3次，这样处理后白芍不易霉变，晒干后易于储存。在调配时常发现白芍饮片有一股刺激性气味，市场白芍饮片抽检常出现含硫量超标现象。

硫磺熏蒸中药材是我国中药材的传统加工方法之一，通过适量的硫磺熏蒸，可以达到防霉、防虫、防潮、延长药材储存时间的目的。但是，大量研究表明，硫熏通常会使中药材的有效成分明显降低, 更重要的是硫熏后残留在中药饮片的硫化合物对人体健康有害，甚至在人体内转化为致癌物亚硝胺。熏硫白芍与非熏硫白芍，由于经过不同的炮制过程，也会存在化学成分的差异。因此，对不同炮制方法的同种药材进行筛选，对于提升中药品质具有重要的实际意义。

目前对中药分析物质准确提取分析，进而用于筛查不同基源之间具有差异化化学成分的方法非常少，当前能够完成这一工作的方法有HPLC、IR、NIR、TLC等。但这些方法中存在大量的假阳性和假阴性问题，导致利用这些方法进行分析时，可能漏掉重要的物质信息，进而导致所筛选出的差异性物质无法有效表征组别差异，对确定不同炮制方法的同种中药材鉴别带来困难。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的在于提供一种快速、准确度高的UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法。

本发明是通过以下技术方案实现：

一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法，包括以下步骤：

（1）收集待区分的熏硫白芍与非熏硫白芍药材，按采收加工过程中是否熏硫，将不同批次的熏硫白芍与非熏硫白芍药材各分为一组，将每组熏硫白芍与非熏硫白芍药材制成相应的熏硫白芍标准汤剂样品和非熏硫白芍标准汤剂样品，粉碎，过60目筛，于-20℃下避光保存；

（2）取步骤（1）的熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品各0.4g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，随后进入UPLC-MS-MS系统进行分析，得到每个熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品对应的质谱数据；

（3）将步骤（2）采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，然后进行数据分析，针对每个样品进行色谱峰提取和质谱信息表征；

（4）选择物质色谱峰数量最多的样品作为参照样品，采用动态规划计算法校正样品间的色谱峰漂移，对齐属于同一物质的色谱峰，然后利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物，最终建立一个样品和色谱峰的注册图表；经过外标校正后，用于后续的分析；

（5）利用方差分析计算样品间差异性的物质，置信水平阈值设定为0.05，将置信水平小于0.05的物质视作差异性化合物，将所有差异性物质的质谱信息的原始文件直接导入到Compound Discoverer2.1库中进行匹配，确定物质结构，从而得到差异性物质；然后通过色谱的峰面积和出峰保留时间对应的准分子离子峰的质量数确定熏硫白芍与非熏硫白芍的差异性。

优选的，所述熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品是通过如下方法得到的：分别取熏硫白芍与非熏硫白芍药材，各加水煎煮两次，第一次加8-10倍量水，浸泡30分钟，煎煮30-60分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，第二次加6-8倍量水，煎煮25-40分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，将合并后的滤液在水浴温度50℃、真空度-0.08~-0.1MPa的条件下，浓缩至清膏含固率为10-15%，真空冷冻干燥，即得。

本发明的熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品的制备方法，符合传统中医药理论推崇的中药饮片以汤剂入药的观点，以饮用水作为提取溶媒避免了使用有机溶剂作溶媒带来的安全性风险，能较好的保留熏硫白芍与非熏硫白芍中大部分化合物的信息，更符合中药临床使用习惯，且得到熏硫白芍与非熏硫白芍样品的信息量更大，提高了检测的准确性和重现性。

优选的，步骤（2）中，所述UPLC-MS-MS系统的分析条件为：

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%甲酸溶液进行梯度洗脱；流速：0.3ml/min；柱温为40℃；检测波长为230nm；进样量1μl，理论板数按芍药内酯苷峰计算应不低于6000；

质谱条件：

MS系统: Q Exactive Focus 四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱，离子化模式:ESI^– & ESI⁺，锥孔电压:3500/3200V(+/-)；蒸发器温度：350℃；毛细管温度：320℃；全扫描：扫面范围为分子量100~1500，一级质谱分辨率70000，二级质谱分辨率为17500。

本发明与现有技术相比，具有如下有益效果：

（1）本发明首次利用UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍的差异性，该方法具有快速、准确、稳定等优点；

（2）本发明将化合物质谱信息输出为原始文件，该文件不需转换成其他格式，可直接导入至Compound Discoverer2.1库中搜索化合物，该方法能够实现快速锁定中药材样本中存在的差异性化合物，适用于大批量熏硫白芍与非熏硫白芍样本的快速分析测定；

（3）本发明采用熏硫白芍与非熏硫白芍药材的标准汤剂样品作为供试品，针对水溶性提取物进行研究分析，通过提取工艺的优化考察，研究得出熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂的制备工艺；结合本发明所建立的熏硫白芍与非熏硫白芍的筛查方法，能推广应用在熏硫白芍与非熏硫白芍配方颗粒产品及其相关制剂的原料选择和制备工艺中。

附图说明

图1为非熏硫白芍和熏硫白芍标准汤剂样品的总离子流图；

图2为硫熏白芍与非硫熏白芍标准汤剂样品的PCA图。

具体实施方式

下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明具体的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制。

实施例1

一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法：

（1）收集待区分的熏硫白芍与非熏硫白芍药材，按采收加工过程中是否熏硫，将不同批次的熏硫白芍与非熏硫白芍药材各分为一组，将每组熏硫白芍与非熏硫白芍药材制成相应的熏硫白芍标准汤剂样品和非熏硫白芍标准汤剂样品，粉碎，过60目筛，于-20℃下避光保存；

其中，熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品是通过如下方法得到的：

分别取熏硫白芍与非熏硫白芍药材，各加水煎煮两次，第一次加9倍量水，浸泡30分钟，煎煮30分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，第二次加7倍量水，煎煮25分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，将合并后的滤液在水浴温度50℃、真空度-0.09MPa的条件下，浓缩至清膏含固率为12%，真空冷冻干燥，即得；

（2）取步骤（1）的熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品各0.4g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理 30分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，随后进入UPLC-MS-MS系统进行分析，得到每个熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品对应的质谱数据；

（3）将步骤（2）采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，然后进行数据分析，针对每个样品进行色谱峰提取和质谱信息表征；

（4）选择物质色谱峰数量最多的样品作为参照样品，采用动态规划计算法校正样品间的色谱峰漂移，对齐属于同一物质的色谱峰，然后利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物，最终建立一个样品和色谱峰的注册图表；经过外标校正后，用于后续的分析；如图1示出了非熏硫白芍和熏硫白芍标准汤剂样品的总离子流图；

（5）利用主成分分析（PCA）对不同炮制方法的熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品的总离子流图数据进行分析，结果显示（如图2），每组数据聚集在各自的95%的置信限椭圆图内，且两组数据能够完全分离，说明熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品可以得到完全的分离。利用方差分析计算样品间差异性的物质，置信水平阈值设定为0.05，将置信水平小于0.05的物质视作差异性化合物，将所有差异性物质的质谱信息的原始文件直接导入到Compound Discoverer2.1库中进行匹配，确定物质结构，从而得到差异性物质，然后通过色谱的峰面积和出峰保留时间对应的准分子离子峰的质量数确定熏硫白芍与非熏硫白芍的差异性。

结果显示，熏硫白芍与非熏硫白芍均含有没食子酸、儿茶素、芍药内酯苷、芍药苷、1,2,3,4,6-五没食子酰葡萄糖和苯甲酰芍药苷，但熏硫白芍具有芍药苷亚硫酸酯特征峰，具有如下结构，分子量为544.53；而非熏硫白芍不具有该化学成分，因此，可以将芍药苷亚硫酸酯作为特征标记物。

芍药苷亚硫酸酯。

Claims (3)

1.一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）收集待区分的熏硫白芍与非熏硫白芍药材，按采收加工过程中是否熏硫，将不同批次熏硫白芍与非熏硫白芍药材各分为一组，将每组熏硫白芍与非熏硫白芍药材制成相应的熏硫白芍标准汤剂样品和非熏硫白芍标准汤剂样品，粉碎，过60目筛，于-20℃下避光保存；

（2）取步骤（1）的熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品各0.4g，精密称定，分别置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50ml，称定重量，超声处理20-40分钟，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，得到供试品溶液，随后进入UPLC-MS-MS系统进行分析，分别得到每个熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品对应的质谱数据；

（3）将步骤（2）采集的数据直接导入至Compound Discoverer2.1，然后进行数据分析，针对每个样品进行色谱峰提取和质谱信息表征；

（4）选择物质色谱峰数量最多的样品作为参照样品，采用动态规划计算法校正样品间的色谱峰漂移，对齐属于同一物质的色谱峰，然后利用最邻近聚类方法将保留时间较为接近的物质注册成为一个化合物，最终建立一个样品和色谱峰的注册图表；经过外标校正后，用于后续的分析；

（5）利用方差分析计算样品间差异性的物质，置信水平阈值设定为0.05，将置信水平小于0.05的物质视作差异性化合物，将所有差异性物质的质谱信息的原始文件直接导入到Compound Discoverer2.1库中进行匹配，确定物质结构，从而得到差异性物质；然后通过色谱的峰面积和出峰保留时间对应的准分子离子峰的质量数确定熏硫白芍与非熏硫白芍的差异性。

2.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法，其特征在于，所述熏硫白芍与非熏硫白芍标准汤剂样品是通过如下方法得到的：分别取熏硫白芍与非熏硫白芍药材，各加水煎煮两次，第一次加8-10倍量水，浸泡30分钟，煎煮30-60分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速用冷水冷却，第二次加6-8倍量水，煎煮25-40分钟，用325目筛网趁热过滤，滤液迅速冷水冷却，合并两次滤液，将合并后的滤液在水浴温度50℃、真空度-0.08~-0.1MPa的条件下，浓缩至清膏含固率为10-15%，真空冷冻干燥，即得。

3.根据权利要求1所述的一种UPLC-MS-MS快速筛查熏硫白芍与非熏硫白芍差异性的方法，其特征在于，步骤（2）中，所述UPLC-MS-MS系统的分析条件为：

色谱条件：以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以乙腈和0.1%甲酸溶液进行梯度洗脱；流速：0.3ml/min；柱温为40℃；检测波长为230nm；进样量1μl，理论板数按芍药内酯苷峰计算应不低于6000；

质谱条件：

MS系统: Q Exactive Focus 四极杆-静电场轨道阱高分辨串联质谱，离子化模式:ESI^– & ESI⁺，锥孔电压:3500/3200V(+/-)；蒸发器温度：350℃；毛细管温度：320℃；全扫描：扫面范围为分子量100~1500，一级质谱分辨率70000，二级质谱分辨率为17500。