CN114544829A - 蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，属于食品安全检测技术领域。本发明针对目前采用高效液相法基质干扰大，灵敏度低，检出限高等问题，无法满足蜂蜜这类基质复杂样品对该类化合物检测的要求。本发明中采用乙酸乙酯提取蜂蜜中雷公藤甲素，经N‑丙基乙二胺固相萃取柱净化，用液相色谱‑串联质谱测定，外标法定量。本发明方法具有专属性强，分辨率高的特点，可以进行蜂蜜中雷公藤甲素的定性、定量检测。

Description

蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法
技术领域
本发明属于食品安全检测技术领域。
背景技术
GB 14963-2011《食品安全国家标准蜂蜜》中明确指出，蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露应安全无毒，不得来源于雷公藤、博落回等有毒蜜源植物。然而，近几年食用蜂蜜中毒事件仍频有发生，且多数为有毒蜜源植物雷公藤。因此，迫切需要制定蜂蜜中雷公藤甲素的补充检验方法，提高蜂蜜的食品安全监管靶向性，提早发现问题和风险，以避免雷公藤毒蜜源中毒事件再次发生。
目前国内还没有关于蜂蜜中雷公藤甲素的检测方法标准，而且只有极少几篇对雷公藤甲素检测方法的报道。对蜂蜜中雷公藤甲素的测定主要为高效液相法(HPLC)和超高效液相色谱法等方法，上述方法存在基质干扰大，灵敏度低，检出限高等问题，无法满足蜂蜜这类基质复杂样品对该类化合物检测的要求。
液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)作为目前报道较多的方法，其具有专属性强，分辨率高的特点，山东农业大学硕士论文《雷公藤甲素和雷公藤红素在蜂蜜中的含量测定及其降解特征研究》公开了一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，但是其前处理步骤需要加入磁性纳米颗粒，在外加磁场下进行富集，才能结合液相色谱-串联质谱法检测。
发明内容
本发明的目的是，提出一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，方法更加简单，蜂蜜中雷公藤甲素(雷公藤内酯醇)经乙酸乙酯提取，N-丙基乙二胺固相萃取柱净化，用液相色谱-串联质谱测定，外标法定量。
本发明中所采用的测定方法具体步骤如下：
1)试样的制备与保存：对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀。对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。装入洁净容器，密封，标明标记。
2)试样的提取：称取蜂蜜试样2.000g置于50mL离心管中，加入4mL水与蜂蜜充分混匀，加入乙酸乙酯15mL，经涡旋震荡和超声处理后，离心分离取上清液，沉淀再加入乙酸乙酯15mL，重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至干。
3)试样的净化：残渣用2mL乙酸乙酯溶解，过N-丙基乙二胺固相萃取柱，用乙酸乙酯5ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。准确量取甲醇溶液1mL溶解残余物，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
5)系列基质标准工作溶液的制备：准确量取雷公藤甲素标准中间液，用空白样品提取液溶解稀释，配制成雷公藤甲素的系列基质标准工作溶液；
所述的雷公藤甲素标准中间液为1μg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
准确量取雷公藤甲素标准储备液100μL，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1μg/mL的雷公藤甲素标准中间液。
所述的雷公藤甲素标准储备液为1mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
准确称取雷公藤甲素标准品20.0mg于10mL烧杯中，用甲醇溶解后转移到20mL容量瓶中，并用甲醇定容。
空白样品提取液，不加试样重复步骤2)和步骤3)获得。
6)液相色谱-串联质谱测定
A、液相色谱条件：色谱柱：C18柱，柱长75mm以上，粒径2.7μm；流动相：A为0.1wt％的甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序如下：0～4min 90％A和10％B，4～6min 5％A和95％B，6～7min 3％A和97％B，7～10min 90％A和10％B；流速：300μL/min；柱温：室温；进样量：5μL。
B、质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应模式(MRM)；扫描方式：正离子模式扫描(ESI+)；电喷雾电压(IS)：5500V；气帘气(CUR)：20L/min；雾化气压力(GS1)：55L/min；辅助气压力(GS2)：40L/min；离子源温度(TEM)：500℃。定性离子对为361.1/141.2或361.1/104.9、定量离子对为361.1/128.0、去簇电压(DP)100V、碰撞能量(CE)定量测定为80eV、定性测定为80或60eV、碰撞室入口电压(EP)10V、碰撞室出口电压(CXP)13V。
C、定性测定
通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准色谱峰的特征离子相对照定性；雷公藤甲素的参考保留时间为4.81min，试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5％；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，允许的偏差如下：
相对离子丰度>50时，允许的相对偏差为±20；相对离子丰度20～50时，允许的相对偏差±25；相对离子丰度10～20时，允许的相对偏差±30；相对离子丰度≤10时，允许的相对偏差±50；
D、定量测定
按上述条件设定仪器条件，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线，按外标法计算试样中雷公藤甲素的含量；样品中雷公藤甲素质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超出标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样。
E、空白试验
用空白样品提取液进样，均按试样同法操作。
7)结果计算
结果按式(1)计算：
Figure BDA0003470402920000031
式(1)中：
X—试样中各待测组分的含量，μg/kg；
C—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，ng/mL；
V—试样溶液最终定容体积，mL；
f—试样制备过程中的稀释倍数；
m—试样质量，g。
计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
优选的，步骤2)中涡旋震荡5min，超声10min，以10000r/min离心5min。
优选的，步骤3)中甲醇溶液中甲醇和水体积比为1:1。
本发明的有益效果：
本发明方法具有专属性强，分辨率高的特点，可以进行蜂蜜中雷公藤甲素的定性、定量检测。
附图说明
图1雷公藤甲素定量离子对质量色谱图(m/z 361.1/128.0)；
图2雷公藤甲素定性离子对质量色谱图(m/z 361.1/104.9)；
图3雷公藤甲素定性离子对质量色谱图(m/z 361.1/141.2)。
具体实施方式
下面具体实施例的形式对本发明技术方案做进一步解释和说明。
1)试样的制备与保存：对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀。对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发。装入洁净容器，密封，标明标记。
储备液及中间液稳定性考察：研究数据表明，雷公藤甲素标准储备液、中间液在4℃、避光条件下储存1个月含量基本稳定。
2)试样的提取：称取蜂蜜试样2.000g置于50mL离心管中，加入4mL水与蜂蜜充分混匀，加入乙酸乙酯15mL，涡旋震荡5min，超声10min，以10000r/min离心5min，取上清液，沉淀再加入乙酸乙酯15mL，重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至干。
考察六种提取溶剂进行加标回收实验，结果表明，水+乙酸乙酯(4+15)为提取溶剂，提取2次每次乙酸乙酯15ml达到最大提取效率。
考察涡旋震荡、超声萃取、离心时间对萃取效率的影响，结果表明，涡旋震荡5min，超声萃取10min、以10000r/min离心，离心时间为5min时，萃取效率高。
3)试样的净化：残渣用2mL乙酸乙酯溶解，过N-丙基乙二胺固相萃取柱，用乙酸乙酯5ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干。准确量取甲醇溶液1mL溶解残余物，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
净化条件的考察：考察三种固相萃取小柱，结果表明N-丙基乙二胺(PSA)固相萃取柱可去除样品中的干扰物，使雷公藤甲素不易被吸附，效果最佳。
采用5种复溶上机溶液，确定甲醇:水(1:1)作为复溶溶剂效果最佳。
5)基质标准工作曲线的制备：准确量取雷公藤甲素标准中间液(1μg/mL)适量，用空白样品提取液溶解稀释，配制成雷公藤甲素浓度为0ng/mL、5ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL的系列基质标准工作溶液，或根据需要配制适当浓度的基质标准工作溶液；现配现用。以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线。
所述的雷公藤甲素标准中间液为1μg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
准确量取雷公藤甲素标准储备液100μL，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1μg/mL的雷公藤甲素标准中间液。4℃避光保存，有效期1个月。
所述的雷公藤甲素标准储备液为1mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液，配制方法如下：
准确称取雷公藤甲素标准品20.0mg于10mL烧杯中，用甲醇溶解后转移到20mL容量瓶中，并用甲醇定容。4℃避光保存，有效期1个月。
空白样品提取液，不加试样重复步骤2)和步骤3)获得。
(6)液相色谱-串联质谱测定
液相色谱条件：色谱柱：C18柱，75mm×3.0mm，粒径2.7μm，或性能相当者；流动相：A为0.1wt％甲酸溶液，B为甲醇。梯度洗脱程序见表1。
表1
Figure BDA0003470402920000041
Figure BDA0003470402920000051
流速：300μL/min；柱温：室温；进样量：5μL。
质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源(ESI)；检测方式：多反应模式(MRM)；扫描方式：正离子模式扫描(ESI+)；电喷雾电压(IS)：5500V；气帘气(CUR)：20L/min；雾化气压力(GS1)：55L/min；辅助气压力(GS2)：40L/min；离子源温度(TEM)：500℃。
定性离子对、定量离子对、去簇电压(DP)、碰撞能量(CE)、碰撞室入口电压(EP)、碰撞室出口电压(CXP)等参数见表2。
表2
Figure BDA0003470402920000052
*定量离子对。所列参数是在SCIEX QTRAP 4500质谱仪完成的，仅供参考。
注：表2所列参考质谱条件仅供参考，当采用不同质谱仪器时，仪器参数可能存在差异，测定前应将质谱参数优化到最佳。
(7)定性测定
通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准色谱峰的特征离子相对照定性。试样与标准品保留时间的相对偏差不大于2.5％；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，允许的偏差见表3。
表3
相对离子丰度/％ >50 >20～50 >10～20 ≤10
允许的相对偏差/％ ±20 ±25 ±30 ±50
雷公藤甲素的参考保留时间约为4.81min，质量色谱图参见附图1～图3。
(8)定量测定
按步骤(6)设定仪器条件，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线，按外标法计算试样中雷公藤甲素的含量。样品中雷公藤甲素质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超出标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样。
(9)空白试验
除不加试样外，均按试样同法操作。
(10)结果计算
结果按式(1)计算：
Figure BDA0003470402920000061
式中：
X—试样中雷公藤甲素的含量，μg/kg；
C—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，ng/mL；
V—试样溶液最终定容体积，mL；
f—试样制备过程中的稀释倍数；
m—试样质量，g。
计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
目标物电离方式和扫描模式的选择：对雷公藤甲素进行了ESI(+)(-)、APCI(+)(-)两种离子源的两种扫描模式，结果表明在ESI(+)模式检测效果最佳。
目标物子离子和质谱参数的优化：雷公藤甲素定性离子为361.3/141.2、361.3/104.9、定量离子为361.3/128.0，去簇电压100V、入口电压10V、出口电压13V、碰撞电压定量离子361.3/128.0为80eV、定性离子361.3/141.2、361.3/104.9分别为80eV、60eV，保留时间为5.32min。
流动相条件的优化：考察了6种流动相，确定测定雷公藤甲素流动相选择0.1wt％甲酸水－甲醇。
柱温的考察：不同柱温对雷公藤甲素的保留时间影响较小。
色谱柱的考察：对比三种不同色谱柱，结果表明使用柱长75mm或100mm的色谱柱均满足雷公藤甲素的峰形、响应、出峰时间。
基质效应对质谱离子化干扰的评估：基质效应评估结果表明样品定量需采用基质加标校止曲线来进行计算。

Claims (5)

1.一种蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，该方法的步骤如下：
1)试样的制备与保存：对无结晶的蜂蜜样品将其搅拌均匀；对有结晶析出的蜂蜜样品，在密闭情况下，将样品瓶置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，迅速冷却至室温，在融化时必须注意防止水分挥发；装入洁净容器，密封，标明标记；
2)试样的提取：称取蜂蜜试样2.000g置于50mL离心管中，加入4mL水与蜂蜜充分混匀，加入乙酸乙酯15mL，经涡旋震荡和超声处理后，离心分离取上清液，沉淀再加入乙酸乙酯15mL，重复提取1次，合并上清液，旋转蒸发至干；
3)试样的净化：残渣用2mL乙酸乙酯溶解，过N-丙基乙二胺固相萃取柱，用乙酸乙酯5ml洗脱，收集洗脱液，氮气吹干；准确量取甲醇溶液1mL溶解残余物，经0.22μm微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定；
5)系列基质标准工作溶液的制备：准确量取雷公藤甲素标准中间液，用空白样品提取液溶解稀释，配制成雷公藤甲素的系列基质标准工作溶液；所述的雷公藤甲素标准中间液为1μg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液；所述的空白样品提取液，不加试样重复步骤2)和步骤3)获得；
6)液相色谱-串联质谱测定
A、液相色谱条件：色谱柱：C18柱，柱长75mm以上，粒径2.7μm；流动相：A为0.1wt％的甲酸溶液，B为甲醇；梯度洗脱程序如下：0～4min 90％A和10％B，4～6min 5％A和95％B，6～7min 3％A和97％B，7～10min 90％A和10％B；流速：300μL/min；柱温：室温；进样量：5μL；
B、质谱参考条件：离子源：电喷雾离子源；检测方式：多反应模式；扫描方式：正离子模式扫描；电喷雾电压：5500V；气帘气：20L/min；雾化气压力：55L/min；辅助气压力：40L/min；离子源温度：500℃；
定性离子对为361.1/141.2或361.1/104.9、定量离子对为361.1/128.0、去簇电压100V、碰撞能量定量测定为80eV、定性测定为80或60eV、碰撞室入口电压10V、碰撞室出口电压13V；
C、定性测定
通过试样色谱图的保留时间与相应标准品的保留时间、色谱峰的特征离子与相应浓度标准色谱峰的特征离子相对照定性；雷公藤甲素的参考保留时间为4.81min，试样与其保留时间的相对偏差不大于2.5％；试样特征离子的相对丰度与浓度相当标准溶液的相对丰度一致，允许的偏差如下：
相对离子丰度>50时，允许的相对偏差为±20；相对离子丰度20～50时，允许的相对偏差±25；相对离子丰度10～20时，允许的相对偏差±30；相对离子丰度≤10时，允许的相对偏差±50；
D、定量测定
按上述条件设定仪器条件，以基质标准工作溶液浓度为横坐标，以峰面积为纵坐标，绘制基质标准工作曲线，按外标法计算试样中雷公藤甲素的含量；样品中雷公藤甲素质量浓度应在标准工作曲线质量浓度范围内，超出标准工作曲线质量浓度上限的样品应稀释后进样；
E、空白试验
用空白样品提取液进样，均按试样同法操作；
7)结果计算
结果按式(1)计算：
Figure FDA0003470402910000021
式(1)中：
X—试样中各待测组分的含量，μg/kg；
C—从标准工作曲线得到的被测组分溶液浓度，ng/mL；
V—试样溶液最终定容体积，mL；
f—试样制备过程中的稀释倍数；
m—试样质量，g；
计算结果需扣除空白值，测定结果用2次平行测定结果的算术平均值表示，结果保留3位有效数字。
2.根据权利要求1所述的蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，步骤2)中涡旋震荡5min，超声10min，以10000r/min离心5min。
3.根据权利要求1所述的蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，步骤3)中甲醇溶液中甲醇和水体积比为1:1。
4.根据权利要求1所述的蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，所述的雷公藤甲素标准中间液配制方法如下：
准确量取雷公藤甲素标准储备液100μL，置于100mL容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，制成质量浓度为1μg/mL的雷公藤甲素标准中间液；所述的雷公藤甲素标准储备液为1mg/mL的雷公藤甲素甲醇溶液。
5.根据权利要求1所述的蜂蜜中雷公藤甲素的测定方法，其特征在于，雷公藤甲素标准储备液配制方法如下：
准确称取雷公藤甲素标准品20.0mg于10mL烧杯中，用甲醇溶解后转移到20mL容量瓶中，并用甲醇定容。
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