CN108008056B - 钩吻生物碱作为有毒蜂蜜的生物标志物的应用 - Google Patents

钩吻生物碱作为有毒蜂蜜的生物标志物的应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及食品安全领域，具体公开了钩吻生物碱(钩吻素甲和/或钩吻素己)作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用。本发明经过研究发现，钩吻生物碱尤其适用于有毒蜂蜜的识别和鉴定，以及蜂蜜中毒人群的早期诊断。在此基础上，本发明进一步提出了两种钩吻生物碱的UHPLC‑Q Exactive plus或者LC‑MS/MS检测方法，并对蜂蜜样本的前处理条件和检测参数进行了优化。本发明所提供的有毒蜂蜜的生物标志物和检测方法，对保护蜂蜜消费者的生命健康和维护蜂蜜消费行业健康发展具有重要现实意义。

Description

钩吻生物碱作为有毒蜂蜜的生物标志物的应用
技术领域
本发明涉及食品安全领域，具体地说，涉及钩吻生物碱作为有毒蜂蜜的生物标志物及其在鉴别有毒蜂蜜中应用。
背景技术
蜂蜜是由蜜蜂采集植物的花蜜、分泌物或蜜露，与自身分泌物结合后，经充分酿造而成的天然甜物质。由于蜂蜜具有极高的营养价值，深受消费者青睐，其销售量也呈逐年上升趋势。然而，近年来我国南方多个地区陆续爆发了多起因食用“有毒蜂蜜”致人中毒，甚至死亡的群体性事件，如2016年广州13人中毒，1儿童死亡；2016年广西昭平4人中毒，1人死亡、2016年重庆忠县2人死亡、2016年云南维西1人死亡、2015年湖北恩施11人中毒，4人死亡、2014年福建泰宁19人中毒，3人死亡。上述事件经媒体报道，使人们对蜂蜜这一天然绿色产品的安全性存在一定的质疑。
依据可查的文献，发现蜂蜜中毒事件多是发生在我国的南方地区，主要是以云南、广西、福建、湖北、江西、重庆、四川和湖南等地区为主。蜂蜜中毒主要是因为蜜蜂采集了有毒蜜粉源植物的花蜜或者花粉，将有毒植物体中的剧毒物质迁移至蜂蜜中，人食用之后导致中毒事件的发生。在我国南方地区分布着大量的有毒蜜粉源植物，如卫矛科的雷公藤、昆明山海棠；马钱科的钩吻；毛莨科的乌头；罂粟科的博落回以及杜鹃花科的羊踟蹰等。在蜜源充足的情况下，蜜蜂能够有效地区分有毒蜜源和非有毒蜜源，一般不会采集有毒蜜源的花蜜；但是在干旱年份，或者其他蜜源植物花蜜相对匮乏时，蜜蜂便会采集有毒蜜粉源植物的花蜜。为了鉴别有毒蜂蜜来源，可以通过研究有毒蜂蜜中有毒植物的花粉形态结构，来推断蜜蜂采集哪一种有毒蜜源植物的花蜜。正是基于有毒蜂蜜中花粉形态鉴定法和有毒蜜源植物的花期，我国养蜂科研人员大致判断出了以下7起蜂蜜中毒事件来源于蜜蜂采集了钩吻(大茶药)酿制的蜂蜜，如：1977年广西横县(4人中毒，1人死亡)；1990年广西灵山县石塘乡镇安村(9人中毒，1日死亡)；2006年广西环江县长美乡(7人中毒，2人死亡)；2006年广西环江县大才乡(4人中毒)；2007年广西环江县川山镇都川村(5人中毒，1人死亡)；2007年广西环江县城南社区(5人中毒，1人死亡)；2016年广东韶关(13人中毒，1儿童死亡)。
可见，在我国南方地区，因食用钩吻蜂蜜导致的中毒致死问题十分严重。鉴于我国蜂蜜的生产加工方式，这些含有钩吻的有毒蜂蜜有可能混到以其他蜂蜜中，流入市场，从而给蜂蜜消费者的安全造成潜在风险。目前，有关钩吻蜂蜜的识别和鉴定方法，在国内和国际上并无相关报道，有关钩吻蜂蜜中毒性物质的类型亦不清楚。尽管已经意识钩吻有毒蜂蜜中含有钩吻生物碱，但是生物碱的类型和化学结构并未阐明。因此，急需探究钩吻蜂蜜中含有的钩吻生物碱的类型，找出钩吻蜂蜜的生物标志物，并建立鉴别和检测钩吻蜂蜜的检测方法。这对保障蜂蜜消费者的生命健康和维护蜂产业的健康发展具有重大的现实意义。
发明内容
本发明针对当前采用花粉形态鉴定法识别和鉴定钩吻蜂蜜的缺陷和不足，基于现代分析化学技术，采用液相串联高分辨质谱等手段识别和鉴定出钩吻蜂蜜的致毒的物质基础，指出其确切化学结构，并筛选出钩吻蜂蜜的特征性标志物。基于筛选出的生物标志物，建立起钩吻蜂蜜的识别和鉴定方法。
本发明的技术方案之一是：钩吻素甲和钩吻素己作为特征性标志物在识别和鉴定有毒蜂蜜中是否含有钩吻蜂蜜中的应用。
本发明的技术方案之二是：一种利用钩吻素甲和钩吻素己作为特征性标志物鉴别蜂蜜中是否含有钩吻蜂蜜的方法，该方法采用UHPLC-Q Exative Plus(超高效液相色谱-四级杆串联高分辨静电轨道阱)和LC-MS/MS仪器检测待测蜂蜜样本。采用LC-HRMS时采集的数据中应含有钩吻素甲和钩吻素己的色谱峰，其对应的精确分子离子峰分别为m/z323.17595和m/z 327.17087，两者测的m/z值与理论m/z值的允许偏差应小于5ppm。此外，钩吻素甲和钩吻素己的色谱峰的保留时间分别为4.170min和4.830min，保留时间允许的偏差应小于0.3min。当蜂蜜样本中含有上述两种钩吻生物碱的任何一种时，则可初步的判定蜂蜜中污染了来源于钩吻的有毒蜂蜜。反之，上述两种生物碱均未检出时，则可判定蜂蜜中不含有钩吻蜂蜜。
此外，为了提高钩吻有毒蜂蜜的鉴别能力，钩吻素甲和钩吻素己的精确质量数和保留时间除了满足上述条件之外，两者的MS/MS图谱(子离子图谱)中应该分别含有其主要的碎片离子。比如，钩吻素甲的MS/MS图谱中应含有特征碎片离子m/z 70.06589(C4H8N+)、86.06054(C4H8ON+)、159.08033(C11H11O2 +)、236.10679(C16H14ON+)和262.12221(C18H16ON+)。而钩吻素己的MS/MS图谱中含有以下主要碎片离子m/z 71.07370(C4H9N+)、143.07291(C10H9N+)、225.10174(C14H13ON2 +)、265.13335(C17H17ON2 +)和296.15195(C18H20O2N2 +)。上述碎片离子m/z值的偏差应小于5ppm。基于上述MS/MS图谱中提供的主要碎片离子，即便是在无钩吻素甲和钩吻素己对照品的情况，依然可以判定蜂蜜样本中含有钩吻蜂蜜，并可将其归为有毒的蜂蜜样本。
在蜂蜜样本进行检测时，其前处理方法优先采用如下步骤：将蜂蜜1g至于10mL的离心管中，加入1mL的水溶解，涡动1min，使蜂蜜充分化开，然后加入3mL的乙腈，涡动提取1min，15000g高速离心10min，取上清1mL转移至进样小瓶中，待上机分析。
采用UHPLC-Q Exactive plus对蜂蜜样本进行检测时，所述的液相主要条件如下：化合物的分离采用C18色谱柱，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.0min，5％的B；1.0-2.0min，5-20％的B；2.0-6.5min，20-50％的B；6.5-7.0min，50-80％的B；7.0-7.1min，80-100％的B；7.1-8.5min，100％B；8.5-8.6min，100-5％的B；8.6-10min，95％的B。液相的流速为0.30mL/min；进样量为3.0uL。
UHPLC-Q Exactive plus的质谱条件如下：
离子源参数：鞘气的流速45；辅助气的流速10；挡锥气的流速0；电喷雾电压3.5kV；离子导管的温度320℃；S-lens RF level设为60；离子源的温度350℃。
采集的模式为正离子模式下的Full MS-ddMS2：其中Full MS的具体参数设置如下：分辨率：70000；AGC Target：3e6；Maximum IT：100ms；Scan range：200-800Da；Spectrumdata：Centroid。其中dd-MS2的具体参数设置如下：分辨率：15000；AGC Target：1.6e5；Maximum IT：50ms；Loop count：1；Isolation window：2.0Da；NCE：42；Spectrum data：Centroid。而dd settings中，Minimum AGC：8.0e3；Apex trigger：2-6s；Exclude isotope：on；Dynamic exclus：8.0s。
为了准确定量蜂蜜中两种钩吻生物碱，本发明除了公布了采用LC-MS/MS定量检测分析蜂蜜中钩吻素甲和钩吻素己的方法。LC-MS/MS的方法中MRM关键参数的设置如下：钩吻素甲323.2>70.2，36eV(定量离子)，323.2>236.2，28eV(定性离子)；钩吻素己327.2>296.2，16eV(定量离子)，327.2>281.2，26eV(定性离子)。LC-MS/MS中蜂蜜样本前处理方法与LC-HRMS是一致的。由于检测仪器的不同，LC-MS/MS的液相和质谱设置条件与LC-HRMS差异较大，其中主要参数设置如下：液相条件中采用较短的C18色谱柱分离，依然是以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为B，采用较短的梯度洗脱程序分离：0-1.0min，10％的B；1.0-2.0min，10-25％的B；2.0-4.0min，25-50％的B；4.0-5.0min，50-70％的B；5.0-5.1min，70-100％的B；5.1-5.5min，100％的B；5.5-5.6min，100-10％的B；5.6-7.0min，10％的B。液相的流速为0.30mL/min；进样量为3.0uL。
LC-MS/MS的质谱条件如下：电喷雾离子源(ESI)；扫描方式：正离子扫描；监测方式：多反应监测(MRM)；离子喷雾电压：4000V；雾化气压力：0.31MPa；干燥气温度：400℃；干燥气流速：10L/min；鞘气温度：350℃；鞘气流速：11L/min。
两种钩吻生物碱详细MRM参数设置参见表1。
表1 LC-MS/MS在定量分析检测蜂蜜中两种钩吻生物碱的MRM关键参数设置
Figure BDA0001443211980000051
为验证建立的LC-MS/MS方法科学合理性，本发明考察了该方法的准确度和精密度，两者的变异系数均小于10％，完全符合残留检测分析的要求。
本发明的有益效果在于：
本发明首次公布了钩吻素甲和钩吻素己可作为钩吻有毒蜂蜜的生物标志物，并提出了采用UHPLC-Q Exactive plus仪器检测蜂蜜中两种钩吻生物碱的检测方法。基于高分辨质谱提供的精确质量数，该方法具有较高的特异性和灵敏度，钩吻素甲和钩吻素己的检出限分别可以达到0.5μg/kg和0.2μg/kg。
此外，为了准确定量蜂蜜中两种钩吻生物碱含量，本发明还公布了两者的LC-MS/MS检测方法和关键的检测参数。基于本方法采用的仪器和公布的参数，不同分析实验室和检测机构可以依据液相串联高分辨质谱或者液相串联三重四极杆质谱技术的相关知识，对其中的参数进行一定调整。而且，即便是在缺乏两种钩吻生物碱对照品的情况下，依然可以通过采用HRMS查看钩吻素甲和钩吻素己的精确质量及其特征性的碎片离子来确定蜂蜜样本中是否含有钩吻生物碱。钩吻素甲和钩吻素己作为钩吻有毒蜂蜜的特征性化合物，通过检测蜂蜜中是否含有两种钩吻生物碱来鉴别蜂蜜是否含有钩吻有毒蜂蜜。
本发明涉及到的试剂和标准品在市场上均可获得。
因此，本发明至少具有以下优点：
1、首次探明了钩吻蜂蜜致毒的物质基础，指出了其主要毒性成分的化学结构，分别是钩吻素甲和钩吻素己。
2、钩吻素甲和钩吻素己可以作为钩吻蜂蜜的特征性标志物。
3、在确定了钩吻蜂蜜的特征标志物的基础上，采用UHPLC-Q Exative Plus和LC-MS/MS建立了蜂蜜中钩吻素甲和钩吻素己的检测方法，用于钩吻蜂蜜的识别和鉴定。
4、建立了钩吻有毒蜂蜜的两种LC-MS识别和鉴定方法，其样本的前处理方法具有简单、高效，易于操作和推广等优点。
本发明涉及到的原料或试剂均为普通市售产品，涉及到的操作如无特殊说明均为本领域常规操作。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以相互组合，得到具体实施方式。
附图说明
图1为钩吻有毒蜂蜜中生物标志物(钩吻素甲和钩吻素己)的化学结构。
图2为钩吻素甲(a)和钩吻素己(b)精确质量数的full mass和MS/MS质谱图。
图3为钩吻素甲(a)和钩吻素己(b)分别在空白蜂蜜(A)、钩吻花蜜(B)和钩吻蜂蜜(C)样本中的精确提取粒子流色谱图，其中提取的质量窗口为5mDa。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明的优选实施方式进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出仅是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本发明进行各种修改和替换。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1
试验案例：
1、试验材料：钩吻的花蜜、钩吻有毒蜂蜜和常见的蜂蜜样本(鸭脚木蜂蜜、乌桕蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、油菜蜂蜜、荔枝蜂蜜、枣花蜂蜜、龙眼蜂蜜和百花蜂蜜)；其中，钩吻的花蜜及有毒蜂蜜是于2016年12月份在广东韶关发生蜂蜜中毒的地区获得，在蜂蜜中毒事发地3km处的山坡中发现了大片的钩吻群落。12月份恰是钩吻的盛花期，此时，用玻璃毛细管可以吸取到少量的钩吻花蜜。在山下1.5km处发现了一家中蜂养殖户，收集了其蜂蜜样本，作为钩吻蜂蜜的阳性样本。通过对采集钩吻蜂蜜样本进行花粉形态鉴定，确定了蜂蜜中含有钩吻的花粉，因此推断采集的此蜂蜜中应含有钩吻生物碱。鉴于钩吻蜂蜜的危害性，建议蜜蜂养殖户销毁了储存在巢脾中多余的蜂蜜。
空白对照的蜂蜜样本多是市场上常见的蜂蜜，共获取多种不同品种的蜂蜜样本，如鸭脚木蜂蜜、乌桕蜂蜜、洋槐蜂蜜、荆条蜂蜜、油菜蜂蜜、荔枝蜂蜜、枣花蜂蜜、龙眼蜂蜜和百花蜂蜜。
2、在2016年12月-和2017年1月份的钩吻的花期，在广东省的粤北、粤东、粤中和粤西的确共采集了20余个疑似有毒的钩吻蜂蜜样本，如梅州丰顺、河源、惠州、阳江、韶关、广州和揭阳等地区。
上述采集的疑似有毒蜂蜜样本采用如下前处理方法进行处理，然后采用UHPLC-QExative Plus和LC-MS/MS仪器进样分析。前处理方法具体为：将蜂蜜1g至于10mL的离心管中，加入1mL的水溶解，涡动1min，使蜂蜜充分化开，然后加入3mL的乙腈，涡动提取1min，15000g高速离心10min，取上清1mL转移至进样小瓶中，待上机分析。钩吻花蜜的收集量较少，未进行提取净化等措施，仅仅是将100μL的钩吻花蜜用900μL的20％甲醇水稀释后，待上机分析。
采用UHPLC-Q Exactive plus和LC-MS/MS进行检测时，液相条件和质谱条件如本发明前述技术方案所述。
通过对比钩吻素甲和钩吻素己在色谱上的保留时间(分别为4.170min和4.830min)、精确质量数分别为m/z 323.17595和m/z327.17087(见图2)以及精确MS/MS图谱(见图2)中主要碎片离子，确定钩吻的花蜜和钩吻有毒蜂蜜中含有大量的两种钩吻生物碱。图3详细的展示了钩吻花蜜及钩吻阳性蜂蜜样本中含有钩吻素甲和钩吻素己，而正常蜂蜜样本中则不含有相应的色谱峰。因此，可以推断有毒蜜源植物钩吻中的毒性物质钩吻素甲和钩吻素己通过蜜蜂的采蜜行为将其转移并富集在蜂蜜中。
为验证两种钩吻生物碱的可靠性，本发明将来自不同地区20余份不同品种的蜂蜜样本作为空白对照，结果在采集的所有蜂蜜样本中均未检测到了钩吻生物碱。而且，本发明在广东省的粤北、粤东、粤中和粤西的确共采集了20余个疑似有毒的钩吻蜂蜜样本。通过检测分析，其中9个样本中检测了钩吻素甲和钩吻素己。为准确定量9个钩吻生物碱阳性蜂蜜样本，进一步采用LC-MS/MS对其进行了检测。通过定量分析发现，阳性样本中钩吻素甲的含量往往比钩吻素己含量高10倍以上(见表2)。
表2 2016年12月-2017年1月在广州省不同地区采集9个钩吻蜂蜜阳性样本中钩吻素甲和钩吻素己的含量
Figure BDA0001443211980000091
通过查阅文献发现，钩吻素甲和钩吻素己在小鼠中里LD50分别为58.2mg/kg b.w.和0.21mg/kg b.w.。可见两者都属于高毒的化合物，尤其是钩吻素己属于剧毒性化合物。尽管两者的含量在阳性蜂蜜样本中的含量并不是很高，但是鉴于两者的高毒性，和在钩吻花期采集蜂蜜中的高阳性率，这对蜂蜜消费者的健康具有一定风险。因此，及时监控蜂蜜中的钩吻生物碱十分必要和迫切。针对近年来钩吻有毒蜂蜜导致的中毒事件多发，而又无有效的监控依据和方法，本发明提供的方案较好的解决了这一问题。
应当理解的是，对上述实施例所用试剂或原料的用量进行等比例扩大或者缩小后的技术方案，与上述实施例的实质相同。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (1)

1.一种检测蜂蜜中是否含有钩吻有毒蜂蜜的方法，其特征在于，
蜂蜜样本在检测前，进行前处理：取蜂蜜样本加入水中溶解，混匀使蜂蜜完全溶解，利用乙腈提取有机相；
采用UHPLC-HRMS检测蜂蜜样本，通过查看其图谱中是否含有钩吻素甲和钩吻素己的特征峰，判定蜂蜜是否为有毒蜂蜜；
钩吻素甲在UHPLC-HRMS的精确提取粒子流色谱图中含有m/z323.17595([M+H]+)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；钩吻素己在UHPLC-HRMS的精确提取粒子流色谱图中含有m/z327.17087([M+H]+)准分子离子峰，其精确质量数的误差应当小于5ppm；
此外，钩吻素甲的MS/MS图谱中应含有碎片离子m/z 70.06589、m/z 86.06054、m/z159.08033、m/z 236.10679和m/z 262.12221；钩吻素己的MS/MS图谱中应含有碎片离子m/z71.07370、m/z 143.07291、m/z 225.10174、m/z 265.13335和m/z 296.15195；上述MS/MS图谱中碎片离子的精确质量数误差应当小于5ppm；
采用UHPLC-Q Exactive plus对蜂蜜样本进行检测时的液相条件如下：化合物的分离采用C18色谱柱，以0.1％的甲酸水为流动相A，0.1％的甲酸乙腈为B，采用梯度洗脱程序分离：0-1.0min，5％的B；1.0-2.0min，5-20％的B；2.0-6.5min，20-50％的B；6.5-7.0min，50-80％的B；7.0-7.1min，80-100％的B；7.1-8.5min，100％B；8.5-8.6min，100-5％的B；8.6-10min，95％的B；液相的流速为0.30mL/min；进样量为3.0uL。
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