CN105467019B - 维生素a、e的测定方法和相应的在线固相萃取分析系统 - Google Patents

Abstract

本发明的目的是提供一种对动物源食品中的维生素A、E进行测定的方法。具体而言，本发明采用固相萃取与高效液相色谱联用技术，建立了一种在线固相萃取‑高效液相色谱同时测定动物源食品中维生素A、E的分析方法。此外，本发明还提供了用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统。

Description

维生素A、E的测定方法和相应的在线固相萃取分析系统

技术领域

本发明涉及一种对动物源食品中的维生素A、E进行测定的方法。具体而言，本发明采用固相萃取与高效液相色谱联用技术，建立了一种在线固相萃取-高效液相色谱同时测定动物源食品中维生素A、E的分析方法。此外，本发明还提供了用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统。

背景技术

维生素A和维生素E是机体维持正常生理功能和物质能量代谢必需的微量营养成分，具有调节生长、维持视觉、促进生殖和延缓衰老等生物效应，但是它们在体内不能合成或合成量不足以满足身体需要，必须通过食物进行补充。肝脏、蛋类和乳品等动物源食品含有丰富的维生素A、E，是人体所需脂溶性维生素的重要来源。由于脂溶性维生素化学性质不稳定，易受光照、空气和温度影响导致氧化分解，而且动物源食品蛋白脂肪含量高，干扰因素多，高效提取和测定复杂基质食品中维生素A、E仍然是维生素分析技术的难点。目前维生素A和维生素E的分析方法主要有层析法、比色法、荧光法、电化学法、气相色谱法和高效液相色谱法，其中以高效液相色谱法最为常用。

现行食品检验标准在内的大多数脂溶性维生素分析方法的样品前处理主要包括皂化、萃取、浓缩、净化等步骤。对于萃取步骤而言，目前动物源食品中脂溶性维生素的测定方法大多采用液液萃取净化样品，并被维生素A、E国家标准检验方法所采用。虽然该方法净化效果好，杂质干扰少，但是存在操作耗时，有机溶剂消耗量大，待测组分易损失等不足。由于涉及多次萃取、浓缩和溶解等步骤，操作繁琐、费时，容易造成待测组分损失，数据准确性与操作人员实验技能密切相关，样品测定结果误差较大且重现性不好。

因此，本领域中迫切需要新的技术手段来提高复杂基质样品的分析效率。

发明内容

为解决上述课题，本研究利用在线固相萃取净化技术结合高效液相色谱，建立了一种简便、快捷测定动物源食品中维生素A、E的分析方法，实现了复杂基质样品的萃取净化与浓缩全程自动化，显著缩短了样品处理时间，改善了测定结果的准确性和重现性。

本发明提供了一种对维生素A、E进行测定的方法，该方法包括将经过预处理的待测样品进行在线固相萃取分析，其中，该预处理包括在碱的存在下对样品进行皂化，该在线固相萃取分析包括如下步骤：

(a)将该经过预处理的待测样品泵入固相萃取柱，通过洗脱除去杂质，将待测的维生素A、E保留在该固相萃取柱上；

(b)通过切换六通阀，将该固相萃取柱与分析柱在流路上串联，进行维生素A、E的分离；

(c)使该分析柱的流出液进入检测器进行检测。

此外，本发明还提供了用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统，该系统包含第一泵、进样器、六通阀、固相萃取柱、第二泵、分析柱和检测器，该进样器在流路上串联于该第一泵的下游，该检测器在流路上串联于该分析柱的下游，该六通阀用于切换该系统的两种工作状态：在第一工作状态下，该固相萃取柱在流路上串联于该进样器的下游，该分析柱在流路上串联于该第二泵的下游；在第二工作状态下，该固相萃取柱在流路上串联于该第二泵的下游，该分析柱在流路上串联于该固相萃取柱的下游。

本研究利用固相萃取柱配合切换阀取代传统的前处理过程，建立了一种在线固相萃取与高效液相色谱联用方法用于同时测定动物源食品中的维生素A和维生素E。皂化处理的样品经固相萃取柱净化浓缩后在线转移至分析柱进行检测，极大减少了前处理过程中维生素A、E的损失。该方法可实现复杂基质样品的自动在线净化，具有分析效率高，溶剂消耗少，测定结果准确且重现性好等特点，为动物源食品中维生素A、E的测定提供了更为简便、灵敏、可靠的分析方法。

附图说明

图1为本发明一个实施方式所述在线固相萃取分析工作流程示意图，图1A和图1B分别示出通过六通阀进行切换的两种流路工作状态。

图2为示出萃取溶剂在不同的柱上对维生素A、E回收率的影响的柱状图。

图3为示出不同的固相萃取柱对配方乳粉样品杂质净化的影响的曲线图。

图4示出了配方乳粉样品未使用在线固相萃取净化(色谱条件采用国标方法)和使用在线固相萃取净化(本发明的方法)的色谱图比较，其中图4A为未使用在线固相萃取净化方法的结果，图4B为采用本发明所述方法的结果。

图5示出了采用本发明的方法对不同样品进行测定的色谱图，其中a对应猪肝样品，b对应鸡蛋样品，c对应配方乳粉样品。

具体实施方式

图1为本发明一个实施方式所述的在线固相萃取分析工作流程示意图，其中采用了包含第一泵和第二泵的双梯度泵。具体而言，在图1A所示的工作状态下，将六通阀按照1-2、3-4、5-6的方式连通，利用第一泵的驱动使得待测样品由自动进样器进入固相萃取柱(优选采用C8作为填料)，用洗脱溶液(例如甲醇-水溶液、特别是体积比为60:40的甲醇-水溶液)去除杂质，并使得维生素A、E富集在固相萃取柱上。随后切换六通阀按照1-6、2-3、4-5的方式连通，使其进入图1B所示的工作状态。利用第二泵的驱动，采用合适的流动相(例如体积比为98:2的甲醇-水溶液)使得富集于固相萃取柱上的维生素A、E转移至分析柱(优选采用C18作为填料)，随后直接在图1B所示的工作状态下使用同样的流动相进行分离和检测。

在一个替代的实施方式中，通过设置合适的在线转移时间，使得在完成在线转移后立即将六通阀切换回图1A所示的工作状态，从而保证在第二泵的驱动下进行分离和检测的同时，在第一泵的驱动下进行下一个周期的进样和固相萃取，如此循环往复。在需要对多组样品进行测定的场合中，采用这种替代的实施方式可以更进一步地节约总体测定时间。

在本发明中，采用双梯度泵可以使得整套系统的布局更加紧凑。作为一个替代的实施方式，本领域技术人员同样可以容易地采用两个独立的泵进行工作。

动物源性食品中的脂溶性维生素大多是以酯类形式存在，极少数为游离状态，并且共存的类脂化合物会干扰脂溶性维生素的测定，因此需要对样品进行皂化处理，将维生素A、E由结合态转化为游离态。在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的皂化条件对待测样品者前处理。为了获得更好的皂化效果，可以对皂化剂浓度、皂化温度和时间等参数进行适当地调整。优选的皂化条件是使用50％氢氧化钾溶液作为皂化剂，在80℃下皂化反应30min，从而使待测样品尽可能皂化完全。此外，由于皂化后的维生素A、E转化为不稳定的醇类，对光照和氧气敏感，因此优选对预处理过程进行避光处理和氮气保护，从而减少误差。

在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的固定相填料作为固相萃取柱填料，并相应地选择合适的流动相来洗脱杂质。在一个优选的实施方式中，选取C8作为在线固相萃取柱填料，体积比为60％的甲醇-水溶液作为洗脱溶液，既能实现维生素A、E在固相萃取柱上的有效富集，又能对样品基质起到良好的净化作用。在进一步优选的实施方式中，依次使用pH7.5和pH3.5的60％甲醇水溶液来洗脱萃取柱，从而实现更佳的样品基质净化效果。

在本发明中，本领域技术人员可选用本领域中合适的色谱分析条件。由于本发明采用在线固相萃取方法净化样品，基本消除了基质的干扰，因而在一个优选的实施方式中，选用较短的C18分析柱(例如柱长15cm)，从而在20min内即可完成维生素A、ɑ-维生素E、(β+γ)-维生素E和δ-维生素E四组脂溶性维生素组分的分析，并且色谱柱分离度和检测灵敏度均能满足实际样品测定需要。

在本发明中，检测器可以是本领域中通常用于检测维生素A、E的任何检测器，优选紫外检测器。在一个优选的实施方式中，检测波长设定为325nm和300nm。

实施例

接下来，通过实施例对本发明进行进一步详细地说明，但本发明不仅限于这些实施例。

实施例1

(1)仪器与试剂

Ultimate3000双三元液相色谱系统(Thermo Scientific公司)，配置双三元梯度泵，自动进样器，柱温箱带一个六通阀，二极管阵列检测器，变色龙色谱管理软件；Milli-Q超纯水机(Millipore公司)；台式高速冷冻离心机(Thermo Scientific公司)。

维生素A(视黄醇)、ɑ-维生素E、β-维生素E、γ-维生素E和δ-维生素E标准品(Sigma公司)；氢氧化钾、抗坏血酸(分析纯，国药集团北京化学试剂有限公司)；无水乙醇、甲醇(色谱级，Fisher公司)；其它试剂均为分析纯；无水乙醇经脱醛处理后使用；猪肝、鸡蛋和婴幼儿配方乳粉购自本地超市。

(2)色谱条件

分析柱为Zorbax Extend-C18(4.6mm×150mm，5μm)；固相萃取柱为Zorbax SB-C18(4.6mm×12.5mm，5μm)；进样量为100μL；柱温为30℃；在线净化流动相为甲醇-水溶液(60:40，V/V)，洗脱条件为使用pH7.5甲醇-水溶液，以1mL/min流速上样并清洗萃取柱5min，再使用pH3.5甲醇-水溶液清洗萃取柱5min；分析测定流动相为甲醇-水溶液(98:2，V/V)，流速为1.7mL/min；紫外检测波长设为325nm和300nm。流路设置和工作状态的切换参见图1A和图1B及前文的相应说明。

(3)标准溶液配制

准确称取维生素A标准品10.0mg，ɑ-维生素E、β-维生素E、γ-维生素E和δ-维生素E各50.0mg，用脱醛乙醇溶解并定容于100mL棕色容量瓶中，配制成浓度分别为100mg/L维生素A和500mg/Lɑ、β、γ和δ维生素E标准储备液，保存于-20℃冰箱。测定前用紫外分光光度法标定标准储备液准确浓度，再用脱醛乙醇稀释标准储备液，配制成浓度分别为0.2、2.0、2.5、5.0、10.0、20.0mg/L维生素A、E混合标准溶液。

(4)样品预处理

准确称取2.0-5.0g(精确至0.01g)样品于50mL离心管中，加入15mL脱醛乙醇，5mL10％抗坏血酸水溶液和5mL50％氢氧化钾溶液，充氮，摇匀。避光80℃水浴中加热30min，不时摇匀，使皂化完全。皂化后立即放入冰水浴中冷却，加入5mL乙酸调节pH至中性，转移至50mL容量瓶中定容。移取其中30mL皂化液至离心管中，以10,000r/min转速离心10min，取上清液经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

(5)线性范围、检出限和精密度

分别取适量经过浓度校准的维生素A、E标准储备液在棕色容量瓶中混合、稀释、定容配制成系列混合标准溶液，每种浓度进样100μL，以峰面积对浓度作图绘制标准曲线，以3倍信噪比(S/N)计算检出限(LOD)。结果见表1。各组分在线性范围内峰面积与浓度呈现良好的线性关系，相关系数不低于0.9998。

表1方法的线性回归方程、线性范围及检出限

取10mg/L维生素A、E混合标准溶液连续进样6次，测得维生素保留时间的相对标准偏差(RSD)≤0.1％，峰面积的相对标准偏差(RSD)≤2.6％，表明方法精密度良好。

(6)回收率和实际样品测定

分别称取猪肝、配方乳粉和鸡蛋三种动物源食品样品各6份，其中3份用于本底值测定，另外三份加入一定浓度的维生素A、E混合标准溶液，经相同条件提取、在线固相萃取净化后测定维生素A、E总量。计算得到猪肝、配方乳粉和鸡蛋中维生素A、E的平均回收率在85.5％-114.1％，相对标准偏差(RSD)在1.8％-4.6％。实际样品色谱图见图5，测定结果参见表2。所建方法各项性能参数符合检测要求，在保证良好回收率的同时同时实现了维生素A、α-维生素E、(β+γ)-维生素E和δ-维生素E的分别测定，并且测定结果与国标方法结果相当接近。具体结果参见表2和图4A-4B。

表2样品含量测定与加标回收率结果

*ND表示未检出

对比例1

参照《GB/T5009.82-2003食品中维生素A和维生素E的测定》样品前处理和测定条件，对比了质量浓度为30％、50％和70％氢氧化钾溶液对猪肝、鸡蛋和配方乳粉中维生素A、E的转化效率。猪肝样品采用30％、50％和70％的氢氧化钾溶液沸水浴皂化30min，测得维生素A含量分别为86.2μg/g、148.6μg/g和134.3μg/g，维生素E总量分别为4.5μg/g、8.9μg/g和7.6μg/g；鸡蛋样品采用30％、50％和70％的氢氧化钾溶液沸水浴皂化30min，测得维生素A含量分别为1.1μg/g、1.8μg/g和1.9μg/g，维生素E总量分别为14.7μg/g、20.7μg/g和18.5μg/g；配方乳粉样品采用30％、50％和70％的氢氧化钾溶液沸水浴皂化30min，测得维生素A含量分别为3.2μg/g、6.3μg/g和5.1μg/g，维生素E总量分别为123.2μg/g、167.5μg/g和174.5μg/g。结果表明50％氢氧化钾溶液可以更好地满足样品皂化需要。

对比例2

参照《GB/T5009.82-2003食品中维生素A和维生素E的测定》样品前处理和测定条件，对比了50℃、80℃和100℃的皂化温度对皂化的影响。猪肝样品分别在50℃、80℃和100℃的50％氢氧化钾溶液中皂化30min，测得维生素A含量分别为136.2μg/g、155.2μg/g和148.6μg/g，维生素E总量分别为7.5μg/g、8.7μg/g和8.9μg/g；鸡蛋样品分别在50℃、80℃和100℃的50％氢氧化钾溶液中皂化30min，测得维生素A含量分别为1.4μg/g、2.2μg/g和1.8μg/g，维生素E总量分别为18.9μg/g、21.5μg/g和20.7μg/g；配方乳粉样品分别在50℃、80℃和100℃的50％氢氧化钾溶液中皂化30min，测得维生素A含量分别为5.7μg/g、7.0μg/g和6.3μg/g，维生素E总量分别为156.5μg/g、173.5μg/g和167.5μg/g。结果表明80℃可以更好地满足样品皂化需要。

对比例3

首先考察了C18、C8和CN三种不同类型填料的固相萃取柱对维生素A、E的富集效果。采用甲醇和水作为萃取流路的流动相，分别测定了10.0mg/L的维生素A和维生素E标准溶液在1.0mL/min流速下经体积比为40％、50％、60％、70％的甲醇溶液洗脱的回收率，如图2A、2B所示，C18和C8固相萃取柱在萃取液中甲醇含量为40％-60％浓度范围内对维生素A、E具有良好的富集作用。接着考察了C18、C8和CN三种不同类型填料的固相萃取柱对动物源食品基质的净化效果。仍以甲醇和水作为萃取流路的流动相，分别测定了2g猪肝、鸡蛋和配方乳粉(如图3所示)皂化液在1.0mL/min流速下经体积比为40％、50％、60％、70％的甲醇-水溶液洗脱并转移至分析柱的残余杂质色谱峰面积，结果表明C18和C8固相萃取柱在萃取液甲醇含量为60％-70％浓度范围内对杂质清洗效果较好，并且C8萃取柱的净化能力要略优于C18萃取柱。

对比例4

虽然60％甲醇溶液能够去除样品中大部分杂质，但是实验发现还有一定量的残余杂质会通过阀切换转移到分析柱上，对保留时间较短的维生素A形成干扰。为此，尝试采用调节萃取液pH值的方法进一步提高在线固相萃取方法的净化能力。比较了萃取液水相在pH3.0-8.0范围内对猪肝、鸡蛋和配方乳粉皂化液基质的洗脱效果，结果发现采用碱性和酸性甲醇溶液清洗固相萃取柱，净化效果较之前的中性洗脱液有明显改善，转移至分析柱上的杂质量显著减少，不再干扰维生素A测定。最优选依次使用pH7.5和pH3.5的60％甲醇水溶液来洗脱萃取柱，从而实现更佳的样品基质净化效果。

Claims (11)

1.一种对维生素A、E进行测定的方法，所述方法包括将经过预处理的待测样品进行在线固相萃取分析，所述预处理包括在碱的存在下对样品进行皂化，其特征在于，所述在线固相萃取分析包括如下步骤：

(a)将所述经过预处理的待测样品泵入固相萃取柱，通过洗脱除去杂质，将待测的维生素A、E保留在所述固相萃取柱上，其中，依次使用pH 7.5和pH 3.5的甲醇水溶液来洗脱所述固相萃取柱；

(b)通过切换六通阀，将所述固相萃取柱与分析柱在流路上串联，进行维生素A、E的分离；

(c)使所述分析柱的流出液进入检测器进行检测。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述固相萃取柱采用C8作为填料；和/或所述分析柱采用C18作为填料；

其特征还在于，所述步骤b和c采用甲醇水溶液作为流动相。

3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤a采用体积比为60:40的甲醇-水溶液；和/或所述步骤b和c采用体积比为98:2的甲醇-水溶液。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，在所述预处理的过程中，使用50％氢氧化钾溶液作为皂化剂，在80℃下皂化反应30min；和/或对预处理过程进行避光处理和氮气保护。

5.如权利要求4所述的方法，其特征在于，在皂化后立即放入冰水浴中冷却，加入乙酸调节pH至中性，以10,000r/min转速离心10min，取上清液经0.45um滤膜过滤后进样分析。

6.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法采用包含第一泵和第二泵的双梯度泵进行实施，所述第一泵用于实施所述步骤a，所述第二泵用于实施所述步骤b和c。

7.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，所述检测器为紫外检测器，检测波长为325nm和300nm。

8.一种用于对维生素A、E进行检测的在线固相萃取分析系统，所述系统包含第一泵、进样器、六通阀、固相萃取柱、第二泵、分析柱和检测器，所述进样器在流路上串联于所述第一泵的下游，所述检测器在流路上串联于所述分析柱的下游，其特征在于，所述六通阀用于切换所述系统的两种工作状态：在第一工作状态下，所述固相萃取柱在流路上串联于所述进样器的下游，所述分析柱在流路上串联于所述第二泵的下游；在第二工作状态下，所述固相萃取柱在流路上串联于所述第二泵的下游，所述分析柱在流路上串联于所述固相萃取柱的下游，其中，在由所述第一泵驱动的流路中，依次采用pH 7.5和pH 3.5的甲醇水溶液作为流动相来洗脱所述固相萃取柱。

9.如权利要求8所述的系统，其特征在于，所述第一泵和所述第二泵被包含在一个双梯度泵中。

10.如权利要求8或9所述的系统，其特征在于，所述固相萃取柱采用C8作为填料；和/或所述分析柱采用C18作为填料；

其特征还在于，由所述第二泵驱动的流路采用甲醇水溶液作为流动相。

11.如权利要求8或9所述的系统，其特征在于，由所述第一泵驱动的流路采用体积比为60:40的甲醇-水溶液；和/或由所述第二泵驱动的流路采用体积比为98:2的甲醇-水溶液。