CN112646191A - 一种稀土-有机框架纳米荧光探针及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物检测技术领域，公开了一种稀土‑有机框架纳米荧光探针及其制备方法和应用。本发明通过配体交换来制备稀土‑有机框架纳米材料的方法，可以控制纳米材料尺寸，避免形成无定形的配位聚合物。本发明以稀土‑有机框架纳米材料Ln‑QPTCA作为荧光探针，利用ATP和ADP对纳米探针的发光具有不同的猝灭效果以及目标检测物激酶作为ATP和ADP的转化酶，实现对激酶活性的检测。本发明不仅可以用于标准液中激酶活性的检测，也可以进一步实现对血清中激酶活性的检测，具备操作简便、抗干扰性好、快速灵敏、经济实用等优点，可为解决复杂体系中激酶活性的实时监测提供理论依据和技术支持，具有良好的临床应用潜力。

Description

一种稀土-有机框架纳米荧光探针及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，具体涉及一种稀土-有机框架纳米荧光探针及其制备方法和应用。
背景技术
近年来，急性心肌梗死(AMI)和心肌炎等心脏疾病已经成为威胁人类生命健康的主要疾病之一。全世界每年约有1.6千万人发生心肌梗死，而且这一数字正在逐年增加，实现AMI的早期准确诊断对降低其死亡率至关重要。研究表明，AMI是冠状动脉急性、持续性缺血缺氧所引起的心肌坏死，临床上常伴有血清中肌酸激酶(CK)活性增高的症状。健康人体血清中CK活性范围为45-174U/L。AMI发病后，人体血清中CK活性值逐渐增加，疼痛出现4小时后，CK活性急剧上升，最高可达到正常值上限的10-20倍。因此，CK作为一种特异性的心脏疾病标志物被广泛用于AMI的早期诊断。目前，CK活性的检测方法主要是分光光度法，该方法存在灵敏度和特异性不够的问题，对CK活性的精准检测还缺乏简便快捷的方法。因此，开发一种可以改善传统分光光度法自身缺陷的CK活性检测方法，具有重要实际意义和临床价值。
金属-有机框架材料(Metal-Organic Frameworks),简称MOFs，是由有机配体和金属离子或团簇通过配位键自组装形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料。MOF材料具有孔隙率高、比表面积大、孔尺寸及成分可调和生物相容性好等优点，在气体存储与分离、传感器、药物缓释、催化反应等领域都有重要的应用。稀土-有机框架材料(Ln-MOFs)结合了稀土离子的发光谱带窄、色纯度高、荧光寿命长、发光稳定性好等优点和上述MOF材料固有的诸多优点，是一类具有重要发展前景的多孔发光材料。由于Ln-MOF材料的发光很容易受到客体分子或离子的影响而发生猝灭或增强，因此Ln-MOF材料可以作为一种荧光探针实现对金属离子、有机小分子和生物大分子的高灵敏检测。借助稀土发光的长荧光寿命特点，Ln-MOF荧光探针在检测过程中可以利用时间分辨技术去除分析物的自荧光干扰，获得接近于零的背景信号，极大地提高检测的灵敏度和信噪比。另外，Ln-MOF材料的孔隙率高、比表面积大等结构特点，促进主体材料与客体分析物的相互作用，加快探针的响应时间，从而保证了检测的快捷性。因此，Ln-MOF材料可以发展为一类优异的荧光探针，在生物医学领域具有广泛的应用前景。但尚未见将Ln-MOF材料应用于肌酸激酶活性检测的报道。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种可用于时间分辨体外分析、高灵敏的稀土-有机框架材料(Ln-MOFs)纳米荧光探针及其制备方法与应用。
本发明的另一个目的在于提供一种基于稀土-有机框架材料纳米荧光探针的激酶活性检测方法。
为了实现上述目的，本发明提供一种稀土-有机框架纳米材料，所述纳米材料为三维框架多孔结构。
根据本发明，所述稀土-有机框架纳米材料的稀土元素选自Eu、Tb或Sm中的一种。
根据本发明，所述稀土-有机框架纳米材料包括Eu-QPTCA、Eu-BDC、Eu-BTC、Eu-BTB、Eu-BPTC、Tb-QPTCA、Tb-BDC、Tb-BTC、Tb-BTB、Tb-BPTC、Sm-QPTCA、Sm-BDC、Sm-BTC、Sm-BTB或Sm-BPTC中的一种，优选为Eu-QPTCA或Tb-QPTCA。
根据本发明，所述纳米材料比表面积为500-2000m2/g，例如1300-1800m2/g；所述纳米材料为多孔球形颗粒；所述纳米材料粒径为75-375nm，例如200-300nm。
本发明还提供上述稀土-有机框架(Ln-MOF)纳米材料的制备方法，先用油酸(OA)作为配体和溶剂与稀土金属盐反应生成Ln-OA前驱体，然后加入有机羧酸配体与所述Ln-OA前驱体进行配体交换，得到球形的Ln-MOF纳米颗粒。
根据本发明，所述稀土金属盐和有机羧酸配体的摩尔比为(1-10):1，优选(2-5):1。
根据本发明，所述稀土金属盐和油酸的摩尔体积比(mmol/mL)为(0.5-5):50，优选(0.5-2):50，例如1:50。
根据本发明，在配体交换反应时加入酸，减缓有机羧酸配体的去质子化过程，降低配体与稀土金属的反应速度，避免两者反应过快而形成非晶态无定形的沉淀物；例如加入醋酸。本领域技术人员可根据反应速率合理调节酸的添加量，例如使反应环境的pH在4.0-6.0范围内。
根据本发明，所述稀土金属盐选自含有Eu、Tb或Sm的醋酸盐、氯化类盐、硫酸盐、高氯酸盐或其盐类水合物中的一种，例如乙酸铕、乙酸铽、乙酸钐、氯化铕、氯化铽、氯化钐、硫酸铕、硫酸铽、硫酸钐、高氯酸铕、高氯酸铽、高氯酸钐等。在本发明的一个实施方案中，所述稀土金属盐为醋酸盐，当所述稀土金属盐为醋酸盐时，所述纳米材料带有醋酸根阴离子。
根据本发明，所述有机羧酸配体选自H4QPTCA、H2BDC、H3BTC、H3BTB或H4BPTC中的一种，优选为H4QPTCA。
根据本发明，所述制备方法包括如下步骤：
(1)取稀土金属盐，加入油酸中，搅拌加热溶解，制备含有Ln-OA前驱体的A溶液；
(2)将有机羧酸配体加入到溶剂中，加入酸，超声溶解，制备B溶液；
(3)A溶液温度降至室温后，将B溶液缓慢滴加到A溶液中，冷凝回流条件下升温至80-100℃，在惰性气体保护和搅拌下，恒温反应5-10小时；
(4)反应溶液冷却至室温后，离心，用N,N-二甲基甲酰胺(DMF)和无水乙醇洗涤。
根据本发明，所述步骤(1)的溶解在惰性气体保护、冷凝回流条件下进行，温度为100-150℃。
根据本发明，所述步骤(2)的溶剂可以为DMF。
在本发明的一个实施方案中，所述稀土金属为Eu，所述Ln-MOF纳米材料的制备方法包括如下步骤：
(1)称取Eu(Ac)3,加入到油酸中，在N2保护、冷凝回流条件下150℃搅拌溶解，Eu(Ac)3充分溶解后，溶液在150℃下搅拌、恒温半个小时，为A溶液；
(2)称取1,1':4',1":4",1'"-四联苯-3,3'",5,5'"-四羧酸(H4QPTCA),加入到DMF溶液中，加入醋酸，室温超声溶解，为B溶液；
(3)A溶液温度降至室温后，用恒压分液漏斗将B溶液缓慢滴加入A溶液中，在冷凝回流条件下升温至90℃，在N2保护和搅拌下，恒温10个小时；
(4)反应溶液冷却至室温后，离心，用DMF和无水乙醇各洗涤3次。
本领域技术人员应当理解，所述稀土-有机框架材料中包括一种或多种阴离子，可以为醋酸根离子、氯离子、高氯酸离子、硫酸根离子，所述阴离子起到平衡电荷的作用。
本发明还提供上述方法制备得到的稀土-有机框架纳米材料，优选为Eu-QPTCA、Tb-QPTCA。
根据本发明的实施方案，所述Eu-QPTCA纳米材料为球形纳米颗粒，尺寸为75-375nm，所述Eu-QPTCA纳米球形颗粒为三维框架多孔结构，比表面积为1000-2000m2g-1。
根据本发明的实施方案，所述Eu-QPTCA纳米材料，具有基本上如图5所示的X射线衍射图。
根据本发明的实施方案，所述Eu-QPTCA纳米材料，具有基本上如图2所示的扫描电镜图。
根据本发明的实施方案，所述Tb-QPTCA纳米材料，具有基本上如图4所示的扫描电镜图。
本发明还提供一种激酶活性检测用荧光探针，所述荧光探针包括如上所述的稀土-有机框架纳米材料。
本发明还提供所述稀土-有机框架纳米材料采用在激酶活性检测中的应用，例如纳米材料作为激酶活性检测的荧光探针，所述激酶是催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶；作为一个示例性方案，所述激酶为肌酸激酶、蛋白激酶A(Protein Kinase A，PKA)、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶。
本发明还提供一种基于稀土-有机框架纳米材料的激酶活性检测方法，包括以所述稀土-有机框架纳米材料作为荧光探针，使待测样品与所述稀土-有机框架纳米材料接触，测定荧光值，所述激酶是催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶；作为一个示例性方案，所述激酶为肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶。
根据本发明，所述检测方法包括：
1.以不同浓度的激酶标准品与所述Ln-MOF纳米材料接触，测定荧光值，构建标准曲线；
2.将待测样品与所述Ln-MOF纳米材料接触，测定荧光值，并根据标准曲线计算得到激酶活性。
根据本发明，所述待测样品可以是含有所述激酶的任何样品，包括但不限于来源于受试对象的全血、血清、血浆、组织液、唾液等。
本发明还提供一种激酶活性的检测试剂盒，包括荧光探针，激酶标准品，缓冲液，所述荧光探针为上述稀土-有机框架纳米材料，所述激酶为催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶。作为一个示例性实施方案，所述激酶选自肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶。
有益效果
(1)本发明提供了一种通过配体交换来制备稀土-有机框架纳米材料的方法，利用油酸作为溶剂和配体与稀土盐反应形成稀土-油酸前驱物，再加入目标有机羧酸配体与配位的油酸缓慢交换，从而达到控制纳米材料尺寸的目的，避免有机羧酸配体与稀土离子直接接触快速反应形成无定形的配位聚合物，通过本方法制备的稀土-有机框架纳米材料具有纳米尺寸和三维多孔结构，水溶性好，分散性佳，且具有良好的荧光特性，满足作为激酶活性检测荧光探针的性能要求。
(2)本发明提供了一种基于稀土-有机框架纳米荧光探针的即时激酶活性检测方法。所使用的稀土-有机框架纳米荧光探针具有三维多孔结构和较大的比表面积，有利于待测目标物与稀土发光中心的接触，从而实现了探针对待检测物的快速响应。稀土离子发光具有较长荧光寿命，因此可以利用时间分辨技术来减少背景荧光的干扰，实现较高的信噪比和检测灵敏度。另外，本发明所述的方法为异相检测方式，与传统的酶联免疫检测方法相比，本发明所述的方法无需进行荧光受体或荧光供体-受体复合物的前期制备，只需将Ln-MOF纳米荧光探针和待检测目标物进行简单混合，通过光谱测试即可精准测定待检测物的活性，操作简易方便、成本低廉、省时省力。
(3)本发明所述的激酶活性检测机理是利用三磷酸腺苷(ATP)和二磷酸腺苷(ADP)与稀土-有机框架纳米荧光探针作用产生不同的荧光猝灭效果，激酶可催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应，引起探针荧光强度的变化，从而实现对待测物的检测。催化磷酸基团由ATP向ADP转移是生物体激酶的共有特性，因此本发明所述方法适用于肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶的活性检测，应用范围广泛，可以为多种疾病标志物的确认提供参考，具备良好的医学应用前景。
术语定义与说明
本文中，术语“稀土-有机框架材料”和“Ln-MOFs”可互换使用，是指由稀土金属离子或金属离子簇与有机配体通过配位键形成的具有分子内孔隙的有机-无机杂化材料；所述稀土金属离子包括镧系元素，所述有机配体为羧酸类配体；本文中Ln-MOF表示基于稀土-有机框架材料所制成的某一具体物质或材料，例如Ln-MOF纳米材料表示基于某种Ln-MOF为主要原料制备的纳米材料。
本文所用的“样本”或“样品”可以包含临床样品，在优选的实施方案中，从生物来源获取样品(即“生物样品”)，所述生物来源如收集自受试者的组织、体液。样品来源包括但不限于、血液、全血、体液、脑脊液(CSF)、尿液、唾液、血浆、血清、或组织(例如活检材料)等。
术语“受试对象”或“受试者”包括是指作为样本来源的生物体，包括但不限于温血哺乳动物，例如人和其他灵长类动物；驯养的家养或农场动物，例如猫、狗、绵羊、山羊、牛、马和猪；实验室动物，例如小鼠、大鼠和豚鼠；动物园动物和野生动物等。
术语“干扰物”指任何非检测目标物的物质，例如是检测样本中含有的任何非激酶类成分；尤其指影响目标物与标记物或探针反应结果呈现的物质，干扰物可能是降低检测目标物与探针或标记物的反应特异性，例如干扰物可以与探针或标记物发生于检测目标物相同或类似的标记反应，或者干扰物是抑制检测目标物与探针或标记物发生特异性反应的物质，造成假阳性或假阴性；例如以激酶活性为检测目标时，干扰物可能是抑制激酶与荧光探针发生荧光猝灭反应的物质，或者干扰物是与激酶一样可与荧光探针发生荧光猝灭反应的物质，使得荧光强度不能准确反应激酶活性，例如所述干扰物是来源于检测样本中存在的PO4 3-、CO3 2-、牛血清白蛋白(BSA)、尿酸、NaCl、葡萄糖、甘油三酯、维生素C、胰蛋白酶等。
本文中部分英文缩写代表如下含义：
“H2BDC”是指化合物对苯二甲酸；“H3BTC”是指化合物均苯三甲酸；“H3BTB”是指化合物1,3,5-三(4-羧基苯基)苯；“H4BPTC”是指化合物3,3′,5,5′-联苯四羧酸；“H4QPTCA”是指化合物1,1':4',1":4",1'"-四联苯-3,3'",5,5'"-四羧酸；相应地，上述化合物作为有机羧酸配体与稀土金属形成的稀土-有机框架材料记为Ln-BDC、Ln-BTC、Ln-BTB、Ln-BPTC、Ln-QPTCA，其中Ln表示稀土金属，例如Eu-QPTCA表示Eu作为稀土金属与H4QPTCA形成的稀土-有机框架材料。
“ATP”是指三磷酸腺苷，“ADP”是指二磷酸腺苷。
附图说明
图1为本发明的基于稀土-有机框架材料的纳米荧光探针检测CK活性的原理示意图。
图2为本发明实施例1制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的扫描电镜图。
图3为本发明实施例1制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的粒径分析图。
图4为本发明实施例2制备的Tb-QPTCA纳米颗粒的扫描电镜图。
图5为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的X射线衍射图。
图6为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的N2吸附图。
图7为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的荧光光谱图。
图8为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA纳米颗粒的荧光衰减曲线图。
图9为实施例1所制备的Eu-QPTCA探针发光强度的ATP浓度依赖型响应曲线图。
图10为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA纳米探针测定不同浓度ATP的光谱图。
图11为本发明实施例1所述制备的Eu-QPTCA纳米探针在CK活性检测中的抗干扰性考察。
图12为实施例1所制备的Eu-QPTCA探针发光强度的CK浓度依赖型响应曲线图。
图13为实施例1所制备的Eu-QPTCA探针发光强度与的CK浓度的线性依赖关系。
图14为本发明实施例1所制备的Eu-QPTCA探针检测血清中的CK活性与商用CK活性测试试剂盒检测结果的相关性对照图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明。应当理解，下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，但不应将这些实施例解释为对本发明保护范围的限制。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
仪器和设备：
本发明实施例产品进行粉末衍射表征使用的仪器型号为Rigaku Dmax-2500，厂家为Rigaku，铜靶辐射波长为λ＝0.154187nm。
本发明实施例产品进行X射线能谱分析使用的仪器型号为Zetasizer Nano ZSZEN3600，厂家为Malvern。
本发明实施例产品进行扫描电镜检测使用的仪器型号为JSM-6700F，厂家为日本电子公司。
本发明实施例产品进行氮气吸脱附测试使用的仪器型号为ASAP 2020，厂家为美国Micromeritics。
本发明实施例产品进行荧光发射光谱、荧光寿命表征使用的仪器型号为FLS980，厂家为Edinburgh，激发光源为氙灯和390nm LD脉冲激光器。
本发明实施例产品进行CK活性检测使用的酶标仪型号为Synergy 4,BioTek，厂家为美国伯腾仪器有限公司。
本发明实施例产品进行血清CK活性检测使用的商用测试试剂盒名称为CK测试盒，厂家为南京建成生物工程研究所。
作为一个实施方案，各试剂可按下述步骤配制：
1.试剂配制
(a)50mM Tris缓冲液(pH＝9.0)：称取Tris 6.05g，用盐酸调节pH至9.0。
(b)Ln-QPTCA探针(0.2mg/mL)配制：称取10mg Ln-QPTCA纳米颗粒，加入到50mLTritonX-100(0.5％)溶液中，超声20分钟。
(c)12mM肌酸溶液：称取89.5mg肌酸，加入50mL pH＝9.0的Tris缓冲液，搅拌使之充分溶解。
(d)5mM ATP溶液配制：称取27.2mg ATP，加入10mL pH＝9.0的Tris缓冲液，搅拌使之充分溶解。
(e)CK标准品配制：取一支10Ku/mL的肌酸激酶，用50mM Tris缓冲液稀释至所需要的浓度。
(f)CK测定缓冲液配制：12mM肌酸溶液、5mM ATP溶液、50mM Tris缓冲液(pH＝9.0)，三者按体积比1：1：1混合。
2.标准品的肌酸激酶活性测定，以Eu-QPTCA探针为例:
(a)在96孔板中加入20μL不同活性浓度的CK标准品溶液和160μL CK测定缓冲液，37℃孵育20分钟。
(b)加入20μL Eu-QPTCA探针(0.2mg/mL)，37℃孵育10分钟后采用时间分辨模式测定荧光值，设置激发波长为365nm，发射波长为615nm，延迟时间为200μs。
3.血清样品的肌酸激酶活性测定
用血清样品取代CK标准品，采用同样方式测定。每个样品独立测定3次，血清中CK的活性，通过标准曲线计算得到。
实施例1：Eu-QPTCA球形纳米颗粒的制备。
称取0.2mmol Eu(Ac)3,加入10mL油酸，通氮气加热至150℃并保温30分钟，形成透明溶液A；称取0.1mmol H4QPTCA,加入10mL DMF和1mL醋酸，室温超声5分钟，形成透明溶液B；待A溶液降温至室温后，用恒压分液漏斗将B溶液缓慢滴加到A溶液中，然后加热至90℃并保温10个小时；反应溶液冷却至室温后，离心并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次，得到粒径为200nm左右的Eu-QPTCA球形纳米颗粒。
扫描电镜和粒径分布图(图2和图3)表明该Eu-QPTCA纳米颗粒分散性好、形貌均一，粒径约为200.6nm；X射线粉末衍射图(图5)表明该Eu-QPTCA纳米颗粒具有良好的结晶性，其衍射峰位置和相对强度与Eu-QPTCA同构单晶材料(ZJU-88)的标准XRD图谱一致，属于单斜晶系；该纳米颗粒的乙醇溶液在365nm紫外灯下表现出强红光光发射；373nm激发下的荧光发射光谱(图7)表明该纳米颗粒在615nm具有强发光；荧光衰减曲线(图8)表明该纳米颗粒具有较长的荧光寿命，有效荧光寿命约为0.41ms；荧光量子产率测试表明该纳米颗粒的绝对荧光量子产率约为48.3％。低温77K氮气吸、脱附测试结果(图6)表明Eu-QPTCA纳米颗粒为多孔材料，其比表面积为1483m2g-1。
实施例2：Tb-QPTCA球形纳米颗粒的制备。
称取0.2mmol Tb(Ac)3,加入10mL油酸，通氮气加热至150℃并保温30分钟，形成透明溶液A；称取0.1mmol H4QPTCA,加入10mL DMF和1mL醋酸，室温超声5分钟，形成透明溶液B；待A溶液降温至室温后，用恒压分液漏斗将B溶液缓慢滴加到A溶液中，然后加热至90℃并保温10个小时；反应溶液冷却至室温后，离心并用DMF和无水乙醇分别洗涤3次，得到粒径为200nm左右的Tb-QPTCA球形纳米颗粒。
扫描电镜(图4)表明该Tb-QPTCA纳米颗粒分散性好、形貌均一，粒径约为200nm。
实施例3：Eu-QPTCA探针发光强度与ATP浓度关系曲线的测定
取ATP标准品，用蒸馏水配制不同浓度的ATP溶液(0，0.0625mM，0.125mM，0.25mM，0.5mM，1.0mM)，在96孔板中加入上述20μL ATP溶液，160μL 50mM Tris缓冲液和20μL Eu-QPTCA探针溶液(0.2mg/mL)，在37℃下反应10分钟后采用时间分辨测定荧光值，激发波长和发射波长分别为365nm，615nm。延迟时间200μs，以所测定的相对荧光强度为纵坐标，以ATP溶液的浓度为横坐标制图，获得Eu-QPTCA探针发光强度与ATP浓度的关系曲线(图9)。
在96孔板中加入上述20μL ATP溶液，160μL 50mM Tris缓冲液和20μL Eu-QPTCA探针(0.2mg/mL)，在37℃下反应10分钟，在365nm激发波长下测得荧光光谱图(图10)。
由图9和图10可以看出，ATP溶液对Eu-QPTCA探针的发光具有猝灭作用，ATP溶液浓度越大猝灭效果越明显，而且探针的发光强度和ATP的浓度成线性关系。
实施例4:对识别待检测物肌酸激酶的抗干扰性考察
(1)本实施例所需Eu-QPTCA探针溶液与实施例3一致。
(2)实验选取血液中常见干扰物：PO4 3-、CO3 2-、牛血清白蛋白(BSA)、尿酸、NaCl、葡萄糖、甘油三酯、维生素C、胰蛋白酶。
(3)各种干扰物用蒸馏水配制浓度为5mM的反应物，CK标准品配制为浓度200U/L的标准品溶液，然后在96孔板中每孔加入20μL反应物或CK标准品溶液，160μL 50mM的Tris缓冲液以及20μL Eu-QPTCA探针(0.2mg/mL)，在37℃下反应10分钟后采用时间分辨模式测定荧光值，激发波长和发射波长分别为365nm，615nm。延迟时间为200μs。将反应后的96孔板放置于酶标仪中测定设定孔中混合溶液的发光强度，其对应的发光猝灭相对强度值见图11。
由图11的柱形图可以看出，只有肌酸激酶能够有效抑制ATP对Eu-QPTCA纳米探针发光的猝灭作用，而其余干扰物对探针发光的猝灭效果影响非常小，因此在实际检测中能够避免这些干扰物的影响。
实施例5：复杂体系样品中肌酸激酶活性检测结果与商用肌酸激酶活性试剂盒的比较
(1)本实施例所需Eu-QPTCA纳米颗粒的水溶液浓度与实施例3一致，在0-10000U/L活性浓度范围内按浓度梯度配制CK标准品溶液。
(2)复杂体系实验所使用的模型基质为人血清，来源于福建省立医院检验科检测用残血，并进行匿名化处理。
本实施例血清样品中肌酸激酶活性的检测，可以利用商业肌酸激酶活性测试试剂盒来验证其检测结果的可靠性，具体操作步骤如下：
肌酸激酶活性在人血清中标准曲线的制备：在96孔板中每孔加入20μL梯度浓度的CK标准品溶液，160μL Tris-HCl缓冲液，在37℃下反应20分钟后，加入20μL Eu-QPTCA探针(0.2mg/mL)，在37℃下反应10分钟后采用时间分辨模式测定荧光值，激发波长和发射波长分别为365nm，615nm。延迟时间为200μs。将96孔板置于酶标仪中测定设定孔的发光强度。以肌酸激酶活性为横坐标，发光强度为纵坐标，制作肌酸激酶活性的标准曲线(图12、图13)。
血清中CK的活性测定：用血清样品替代CK标准品，采用同样方式测定荧光强度。每个血清样品独立测定3次，血清中CK的活性通过标准曲线计算得到。
将上述100份血清分别用商用肌酸激酶活性测试试剂盒检测其活性值。
将Eu-QPTCA纳米颗粒测试出来的值为横坐标，商用试剂盒测出来的值为纵坐标做图，其结果如图14所示。从图可以明显看出本实施例测出人血清中的肌酸激酶活性值与商用测试试剂盒测定的值相关性很好，说明本实施例对复杂体系中肌酸激酶活性检测的可行性。
以上，对本发明的实施方式进行了说明。但是，本发明不限定于上述实施方式。凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种稀土-有机框架纳米材料，其特征在于，所述纳米材料为三维框架多孔结构。
2.根据权利要求1所述的稀土-有机框架纳米材料，所述稀土-有机框架纳米材料中的稀土元素选自Eu、Tb或Sm中的一种；
优选，所述稀土-有机框架纳米材料包括Eu-QPTCA、Eu-BDC、Eu-BTC、Eu-BTB、Eu-BPTC、Tb-QPTCA、Tb-BDC、Tb-BTC、Tb-BTB、Tb-BPTC、Sm-QPTCA、Sm-BDC、Sm-BTC、Sm-BTB或Sm-BPTC中的一种；
优选地，所述纳米材料比表面积为500-2000m2/g，例如1300-1800m2/g；优选地，所述纳米材料为多孔球形颗粒；优选地，所述纳米材料粒径为75-375nm，例如200-300nm；
优选地，所述纳米材料，具有基本上如图5所示的X射线衍射图。
3.如权利要求1-2任一项所述稀土-有机框架(Ln-MOF)纳米材料的制备方法，包括如下步骤：先用油酸(OA)作为配体和溶剂与稀土金属盐反应生成Ln-OA前驱体，然后加入有机羧酸配体与所述Ln-OA前驱体进行配体交换，得到球形的Ln-MOF纳米颗粒。
4.根据权利要求3所述的制备方法，包括如下步骤：
(1)取稀土金属盐，加入油酸中，搅拌加热溶解，制备含有Ln-OA前驱体的A溶液；
(2)将有机羧酸配体加入到溶剂中，加入酸，超声溶解，制备B溶液；
(3)A溶液温度降至室温后，将B溶液缓慢滴加到A溶液中，冷凝回流条件下升温至80-100℃，在惰性气体保护和搅拌下，恒温反应5-10小时；
(4)反应溶液冷却至室温后，离心，用DMF和无水乙醇洗涤。
5.根据权利要求3或4所述的制备方法，所述稀土金属盐和有机羧酸配体的摩尔比为(1-10):1，优选(2-5):1；
优选，在配体交换反应时加入酸，
优选，所述稀土金属盐选自含有Eu、Tb或Sm的醋酸盐、氯化类盐、硫酸盐、高氯酸盐或其盐类水合物中的一种，例如乙酸铕、乙酸铽、乙酸钐、氯化铕、氯化铽、氯化钐、硫酸铕、硫酸铽、硫酸钐、高氯酸铕、高氯酸铽、高氯酸钐；
优选，所述有机羧酸配体选自H4QPTCA、H2BDC、H3BTC、H3BTB或H4BPTC中的一种，优选为H4QPTCA。
6.根据权利要求3-5任一项所述的制备方法，包括如下步骤：
(1)称取Eu(Ac)3,加入到油酸中，在N2保护、冷凝回流条件下100-150℃搅拌溶解，Eu(Ac)3充分溶解后，溶液在100-150℃下搅拌、恒温0.5-1小时，为A溶液；
(2)称取1,1':4',1":4",1'"-四联苯-3,3'",5,5'"-四羧酸(H4QPTCA),加入到N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液中，加入醋酸，室温超声溶解，为B溶液；
(3)A溶液温度降至室温后，用恒压分液漏斗将B溶液缓慢滴加入A溶液中，在冷凝回流条件下升温至80-100℃，在N2保护和搅拌下，恒温5-10个小时；
(4)反应溶液冷却至室温后，离心，用DMF和无水乙醇洗涤。
7.一种激酶活性检测用荧光探针，包括如权利要求1-2任一项所述的稀土-有机框架纳米材料。
8.如权利要求1-2任一项所述稀土-有机框架纳米材料采用在激酶活性检测中的应用，例如所述纳米材料作为激酶活性检测的荧光探针，所述激酶是催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶；优选，所述激酶为肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶。
9.一种基于稀土-有机框架纳米材料的激酶活性检测方法，包括以权利要求1-2任一项所述稀土-有机框架纳米材料作为荧光探针，使待测样品与所述稀土-有机框架纳米材料接触，测定荧光值，所述激酶是催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶；优选地，所述激酶为肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶；
优选地，所述检测方法包括：
(1)以不同浓度的激酶标准品与所述荧光探针接触，测定荧光值，构建标准曲线；
(2.将待测样品与所述荧光探针接触，测定荧光值，并根据标准曲线计算得到激酶活性。
10.一种激酶活性的检测试剂盒，包括如权利要求7所述的荧光探针，激酶标准品，缓冲液，所述激酶为催化ATP与ADP之间的转磷酰基反应的激酶；优选地，所述激酶选自肌酸激酶、蛋白激酶A、酪蛋白激酶和T4多核苷酸激酶。
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