CN104872375B - 一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉及其制备方法，属于乳制品加工技术领域；本方法采用转谷氨酰胺酶的催化特性，以及氨基糖的伯胺活性，通过酶法的糖基化途径将氨基葡萄糖导入到乳清蛋白分子中，达到改善乳清蛋白的致敏性的目的，本发明最终产品特点是将原料乳清分离蛋白的抗原活性降低30％以上的糖基化修饰产物。
Description
技术领域
本发明属于乳制品加工技术领域，主要涉及一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉及其制备方法。
背景技术
乳清蛋白是一种营养价值非常高的蛋白质、容易消化吸收、并且还含有多种人体需要的活性成分和必需氨基酸，因此人们对乳清蛋白的应用逐渐重视起来。乳清蛋白作为牛乳的主要成分提供必要的营养物质的同时，也是引起牛乳过敏症的主要蛋白之一，在婴幼儿中牛乳过敏症发生较为普遍。所以降低牛乳成份的致敏性，是目前婴幼儿配方奶粉一个亟待解决的问题。
目前，降低蛋白质致敏性的方法有物理法、化学法、酶解法。这些方法可能使产品产生不良的颜色和风味，并且破坏蛋白质的结构和功能。由于食品蛋白质的糖基化修饰具有良好的应用前景，使其倍受关注，成为现在研究的热点。通过转谷氨酰胺酶催化的蛋白质糖基化途径，在食品蛋白质中已经被成功应用，并且研究结果表明，转谷氨酰胺酶催化的蛋白质糖基化修饰产物的一些功能性质有很大的改善。
由于糖基化修饰蛋白良好的功能特性，以及蛋白质的功能性质与食品的品质之间高度的相关性。以乳清蛋白和氨基葡萄糖为底物，通过转谷氨酰胺酶将氨基葡萄糖导入到乳清蛋白分子中，制备糖基化乳清蛋白修饰产物。同时分析该糖基化交联反应对乳清蛋白致敏性的影响，开发一种降低乳清蛋白的致敏性的修饰方法，为酶法糖基化制备功能性配料提供技术支持，从而拓宽乳清蛋白在食品工业中的应用范围。
发明内容
本发明的目的是，为了降低乳清蛋白的致敏性，利用转谷氨酰胺酶的催化特性，以及氨基糖的伯胺活性，通过酶法的糖基化途径将氨基葡萄糖导入到乳清蛋白分子中，达到改善乳清蛋白的致敏性的目的。
本发明的产品及制备方法如下：
一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉及其制备方法，该方法包括以下步骤：(1)溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为30～70g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为5～25U·g-1乳清蛋白，pH为6.2～8.0，37℃恒温水浴震荡反应2～6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用；(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量；(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原活性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
所述的转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白质的糖基化交联修饰的参数优化为：乳清蛋白浓度50g·L-1，反应体系pH 7.5，温度37℃，酶添加量10U·g-1乳清蛋白，反应时间为4h。
所述的乳清蛋白为乳清分离蛋白，其蛋白质含量不低于92％。
本发明最终产品内容物特点：将原料乳清分离蛋白的抗原活性降低30％以上的糖基化修饰产物。
附图说明
图1是本发明的工艺流程图；
图2是转谷氨酰胺酶添加量对氨基葡萄糖导入量的影响结果图；
图3是糖基化修饰对乳清蛋白抗原抑制率的影响结果图。
具体实施方式
下面结合附图来对具体实施例来进一步描述。
一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉及其制备方法，该方法包括以下步骤：(1)溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为30～70g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为5～25U·g-1乳清蛋白，pH为6.2～8.0，37℃恒温水浴震荡反应2～6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用；(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量；(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原活性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
所述的转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白质的糖基化交联修饰的参数优化为：乳清蛋白浓度50g·L-1，反应体系pH 7.5，温度37℃，酶添加量10U·g-1乳清蛋白，反应时间为4h。
所述的乳清蛋白为乳清分离蛋白，其蛋白质含量不低于92％。
实施例1
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为30g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为10U·g-1乳清蛋白，pH为7.5，37℃恒温水浴震荡反应4h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例2
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为50g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为15U·g-1乳清蛋白，pH为7.5，37℃恒温水浴震荡反应4h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例3
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为70g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为20U·g-1乳清蛋白，pH为7.0，37℃恒温水浴震荡反应6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例4
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为50g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为25U·g-1乳清蛋白，pH为7.5，37℃恒温水浴震荡反应2h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例5
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为50g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为5U·g-1乳清蛋白，pH为6.2，37℃恒温水浴震荡反应6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例6
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为70g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为20U·g-1乳清蛋白，pH为6.8，37℃恒温水浴震荡反应4h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
实施例7
(1)乳清蛋白的糖基化修饰产物的制备：溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为30g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为25U·g-1乳清蛋白，pH为7.5，37℃恒温水浴震荡反应6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用。
(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量。
(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
Claims (3)
1.一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉的制备方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)溶解乳清蛋白，在反应体系中乳清蛋白浓度为30～70g·L-1，与氨基葡萄糖盐酸盐溶液混合，转谷氨酰胺酶的添加量为5～25U·g-1乳清蛋白，pH为6.2～8.0，37℃恒温水浴震荡反应2～6h，反应结束后，取出样品，置于85℃水浴锅中灭酶5min，冷却，调节溶液pH值至5.0，加入等体积的无水乙醇，8000×g离心10min，收集沉淀，乙醇洗两次，将沉淀溶解并调节pH至7.0，冻干备用；(2)将步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物经盐酸水解后，通过高效液相色谱分析乳清蛋白糖基化修饰产品的水解物中释放的氨基葡萄糖的量，以此表示糖基的导入量；(3)通过间接酶联免疫吸附测定法分析步骤(1)得到的乳清蛋白糖基化交联修饰产物的抗原活性，以乳清蛋白中两种主要成份α-乳白蛋白和β-乳球蛋白的抗原活性表示。
2.根据权利要求1所述的一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述的转谷氨酰胺酶催化乳清蛋白质的糖基化交联修饰的参数优化为：乳清蛋白浓度50g·L-1，反应体系pH7.5，温度37℃，酶添加量10U·g-1乳清蛋白，反应时间为4h。
3.根据权利要求1所述的一种基于酶法糖基化修饰的低致敏乳清蛋白粉的制备方法，其特征在于，所述的乳清蛋白为乳清分离蛋白，其蛋白质含量不低于92％。
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