CN101045747A - 来自蜂王浆的降压肽 - Google Patents

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CN101045747A CNA2007100850595A CN200710085059A CN101045747A CN 101045747 A CN101045747 A CN 101045747A CN A2007100850595 A CNA2007100850595 A CN A2007100850595A CN 200710085059 A CN200710085059 A CN 200710085059A CN 101045747 A CN101045747 A CN 101045747A
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Abstract

本发明涉及一种蛋白分解物，经胰蛋白酶处理蜂王浆材料而得到，具有血管紧张素转化酶抑制作用，含有以下4种肽的至少一种：Thr－Ser－Asn－Thr－Phe；Tyr－Ser－Pro－Val－Ala－Ser－Thr；Thr－Asn－Asn－Leu－Tyr；Val－Pro－Ile－Phe－Asp－Arg。本发明的蛋白分解物具有血管紧张素转化酶抑制作用，对高血压的预防或治疗有效。

Description

来自蜂王浆的降压肽
技术领域
本发明涉及来自蜂王浆的蛋白分解物及其制造方法，以及含有该蛋白分解物的食品、口服制剂。本发明的蛋白分解物具有血管紧张素转化酶抑制作用，对高血压的预防或治疗有效。
背景技术
高血压症是一种没有自觉症状，如果置之不理的话则继发心脏病、脑血管病等重大疾病的疾病，高血压的治疗和预防是一个重大的课题。已知血管紧张素转化酶(以下称为ACE)与高血压症密切相关，通过抑制ACE可以预防或治疗高血压。
另一方面，预防或治疗高血压的药品需要长时间摄取，因此具有极低的副作用也是一个重要的因素。现在，预防医学的健康管理的观念正在普及，这就要求开发出不用担心副作用的预防高血压的食品。
据说蜂王浆是蜜蜂为了养育母蜂王而从头部的下咽头腺和大颚腺分泌出的一种乳白色的胶状物质，作为人类的食品所摄取的历史很久，具有滋养、强壮、改善体质等各种广泛作用。对该蛋白质的酶解产物进行了研究，也已经知道了具有ACE抑制活性的来自蜂王浆的肽(日本特开2002-145899；日本特开2002-338594；日本特开2005-255670；Journal of Nutritional Biochemistry 13(2002)，pp.80-86；診断と新薬，第39卷，第2号，2002年，85-90页；日本食品科学工学会誌，第50卷，第10号457-462页(2003)；日本食品科学工学会誌，第50卷，第6号286-288页(2003)；日本食品科学工学会誌，第50卷，第7号310-315页(2003)；日本食品科学工学会誌，第51卷，第1号34-37页(2004))。
但是，从经水解蜂王浆材料所得到的量和ACE抑制活性的强度、速效性、副作用、作用的持续时间、摄取的形状、保存稳定性平衡的观点考虑，这些肽还有面向工业化方向改善的余地。
虽然日本特开2005-255670公开了来自蜂王浆的ACE抑制肽，但是还要求具有强ACE抑制活性的肽。
发明内容
本发明的目的在于提供没有副作用、具有预防高血压作用的蛋白分解物、其制造方法、含有该蛋白分解物的食品以及口服制剂。
本发明的另一个目的在于提供一种具有速效性、效果持续性及保存稳定性的ACE抑制物质、含有该抑制物质的高血压预防或治疗剂。
本发明人对上述问题进行了反复地研究，结果发现，将生蜂王浆、干燥蜂王浆进行乙醇处理得到的变性蛋白质等蜂王浆材料利用蛋白分解酶，例如用胰蛋白酶进行水解，由此可以得到可以预防高血压的蛋白分解物。
另外，本发明的蛋白分解物(含有四种分离的游离，下同)具有较强的ACE抑制作用，具有比由ACE抑制作用所预测的更强的高血压预防或治疗作用，推测该作用的一部分是基于抑制具有降压作用的缓激肽分解的作用。
该蛋白分解物过敏作用等副作用小，是一种来自蜂王浆的安全食品，对正常高值或轻度高血压等血压较高人群，具有特别有用的降压作用或高血压预防作用，特别适合用作为特定保健用食品等的食品。
对正常高值和轻度高血压的人群给用本发明的蛋白分解物，确认了显著的血压降低作用，并且摄取结束后，血压缓慢上升，没有超过摄取前值的反弹，脉搏、体重/BMI、血液检查、尿液检查无异常，没有干咳、皮肤症状、消化系统症状等可能与蜂王浆分解物具有因果关系的副作用，是一种安全性较高的食品。
本发明提供以下发明。
1.一种具有血管紧张素转化酶抑制作用的蛋白分解物，利用胰蛋白酶处理蜂王浆材料而得到，含有以下4种肽的至少一种：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
2.如上述1所述的蛋白分解物，其中蜂王浆材料是蜂王浆的醇变性蛋白质。
3.一种蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，其中，用下式
100×(相对于Gly(1摩尔)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相对于Gly(1摩尔)的蜂王浆材料的Lys(mol))
表示的以Gly为基准时Lys的酶解后的残存率(摩尔比)为蜂王浆材料的70％以下。
4.一种蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，其中，用下式
(相对于Lys(1摩尔)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相对于Lys(1摩尔)的蜂王浆材料的Leu(mol))
表示的以Lys为基准时Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的1.3倍以上。
5.如上述3或4所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上(実質的に)不含有(1)无机盐类，和(2)选自酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中的至少一种。
6.如上述5所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上(実質的に)不含有(1)无机盐类，和(2)游离酸性氨基酸、以及游离碱性氨基酸。
7.如上述6所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上(実質的に)不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸(Asp，Glu)、碱性游离氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羟基的游离氨基酸(Thr，Ser)、游离Ala和游离Gly。
8.如上述3～5任一项所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量为35重量％以下，在40℃、6个月(铝袋)的加速试验条件下实质上(実質的に)不变色。
9.如上述3～6任一项所述的蛋白分解物，其中，经凝胶过滤柱分析实质上(実質的に)未发现分子量10000以上的成分，在分子量约200～约1500的范围内具有最大的峰，具有分子量约200～约300的尖峰。
10.如上述3～6任一项所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在约700～约6000的范围内。
11.如上述1～10任一项所述的蛋白分解物，其中，使前述蛋白分解物通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下式表示的相关成分(関与成分)含量(％)为40％以上。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性
粒度分布；30μm
细孔径；250
官能团；没有
适用pH范围：全区域。
·相关成分含量(％)＝A1/AT×100
T1：色氨酸的保留时间
T2：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间
A1：从在T1的洗脱位置检测的峰之后到在T2的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和
AT：所有的峰面积的总和。
12.如上述11所述的蛋白分解物，其中，前述相关成分含量为58±5％。
13.如上述1～11任一项所述的蛋白分解物，其中，含有在使前述蛋白分解物通过具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，并且用水(级分1，2)、20％甲醇(级分3)、40％甲醇(级分4)、60％甲醇(级分5)、80％甲醇(级分6)、100％甲醇(级分7)洗脱时的级分中的级分3～6：
粒度分布；＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)
细孔径；400
官能团；没有
适用pH范围：全区域。
14.如上述13所述的蛋白分解物，其中，在级分4中含有选自由
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；和
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
组成的组中的至少一种肽，在级分5中含有
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
15.一种高血压的预防或治疗剂，其以上述1～14任一项所述的蛋白分解物为有效成分。
16.一种食品，其含有上述1～14任一项所述的蛋白分解物。
17.如上述16所述的食品，其为高血压预防用食品。
18.一种口服用制剂，其含有上述1～14任一项所述的蛋白分解物。
19.一种高血压的预防或治疗剂，其中，含有选自下述4种肽中的至少一种肽作为有效成分：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
20.如上述18所述的制剂，其为明确的食品和/或包含补充剂(サプリメント)的食品形态。
21.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其以上述1～14任一项所述的蛋白分解物为有效成分。
22.如上述1～14任一项所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用猪胰蛋白酶处理蜂王浆材料。
23.如上述22所述的方法，其特征在于，使用合成吸附剂对通过猪胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物进行处理，除去(1)无机盐类、和(2)选自酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中的至少一种。
24.如上述22所述的方法，其特征在于，将通过猪胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去无机盐和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脱。
25.如上述24所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性：
粒度分布：＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)
细孔径；400
官能团；没有
适用pH范围：全区域。
26.一种新型肽，含有以下4种肽中的任何一种：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
发明效果
本发明的来自蜂王浆材料的蛋白分解物通过口服显示较强的ACE抑制作用，对高血压的预防或治疗有效。
本发明的蛋白分解物，其中使能够成为抗原的分子量在2万以上的蛋白质含量降低，优选的蛋白分解物中几乎或者完全不含有能够成为抗原的分子量在1万以上的蛋白质。因此，本发明的蛋白分解物可以更强地抑制过敏反应，几乎没有发现过敏反应。
而且，本发明的蛋白分解物是在进行脉搏、体重·BMI、血液检查、尿液检查时没有异常，没有干咳、皮肤症状、消化器官症状等副作用的安全的物质。
在脱盐操作后的本发明的蛋白分解物中，可以作为升压物质的盐类，特别是氯化钠的含量非常低。并且，经脱盐操作，游离氨基酸和糖类等其它成分的含量降低，抑制了吸湿性或美拉德反应等的化学反应，可以得到稳定性更高的蛋白分解物。
通过长期摄取本发明的蛋白分解物，可以使血压缓慢而且持续地降低，对于正常血压的受试者可以预防高血压、进而可以预防高血压引起的各种疾病。
本发明的蛋白分解物因为作用持续时间(8～12小时)长，血压缓慢地降低，因此在服用了该蛋白分解物时，一天的血压变动小，容易控制血压。例如如果早晨服用，在活动时间使血压降低，睡觉时不使血压降低，因此，血压高的人服用具有理想的作用方式。另外，服用中止后血压缓慢地上升，没有观察到超过服用前的血压的反弹。特别是在缓慢降低舒张期血压这一方面，本发明的蛋白分解物或4种肽是优异的。
本发明的蛋白分解物的诱变试验及抗原性试验得到结果为阴性，血压变动少，几乎不影响心率、体重，是一种安全性优异的材料。
本发明的蛋白分解物适合具有高血压症的危险因子(遗传性、环境因素等)的正常高值或轻度高血压人群或高血压患者摄取。
附图说明
图1显示GFC分析结果。
具体实施方式
本发明中，蜂王浆材料是指含有蜂王浆的蛋白质的材料，只要满足上述条件就没有特别限制，例如有生蜂王浆、干燥蜂王浆、对蜂王浆进行乙醇沉淀、硫酸铵处理、加热处理等蛋白变性处理得到的蛋白沉淀物(包括乙醇沉淀物)、或者含有通过提取、过滤、离心分离、层析等各种方法对蜂王浆进行分级后的蛋白质的材料。
蜂王浆可以是任何一种，可以广泛使用蜜蜂为了养育蜂王而分泌的蜂王浆。具体地说，蜂王浆是将蜜蜂中的工蜂从下咽头腺及大颚腺分泌的分泌物混合而成的乳白色的胶状物质。
来自蜂王浆的蛋白质级分可以适合使用将蜂王浆进行醇沉淀而得到的蛋白级分。特别优选使用在制造蜂王浆饮料时作为水不溶性蛋白副产物产生的蜂王浆的乙醇变性蛋白质。乙醇变性蛋白质可以是用约50～约100体积％的乙醇从蜂王浆中提取癸烯酸等饮料用生理活性物质后的残渣的对水溶解度小的蛋白质。
含有4种肽的本发明的蜂王浆材料的酶解产物可以利用胰蛋白酶进行水解得到。胰蛋白酶有通过胰蛋白酶原的限制性水解生成的活性α-胰蛋白酶和β-胰蛋白酶，可以使用其中的任何一种。另外，也可以将凝血酶、纤维蛋白血溶酶、激肽释放酶、尿激酶等底物特异性和催化机理相似的类胰蛋白酶作为胰蛋白酶使用。而且，可以使用通过对胰蛋白酶(包含类胰蛋白酶)的一种以上的氨基酸进行置换、添加、缺失、插入等变性的变异型酶。该变异型胰蛋白酶和类胰蛋白酶也包含在本发明的蜂王浆材料的酶解中所使用的胰蛋白酶中。胰蛋白酶的来源例如有牛、猪、羊、人等哺乳动物。在蜂王浆材料的水解中也可以使用从牛、猪等哺乳动物的胰脏提取出来的胰蛋白酶，也可以使用通过基因重组而得到的胰蛋白酶。
作为用胰蛋白酶处理蜂王浆材料的条件，例如通过在水性溶剂中在约15℃到约60℃，优选约20℃到约50℃，特别是37℃左右处理约1～约72小时，优选处理约3～约48小时，可以较好地实施。胰蛋白酶的使用量例如相对于每100g蛋白质为约0.01～约3g，优选约0.05～约1g。胰蛋白酶可以使用游离的酶，也可以使用固定在载体上的酶。胰蛋白酶具体可以优选使用由Novozyme制造的来自猪的胰蛋白酶。
酶反应液的pH为约6～约10，优选约7～约9。用胰蛋白酶水解蜂王浆材料时，由于pH慢慢下降，因此优选使用碱金属氢氧化物(例如氢氧化钠、氢氧化钾)、碱金属碳酸盐(例如碳酸钠、碳酸钾)、碱金属碳酸氢盐(例如碳酸氢钠、碳酸氢钾)等碱，使pH保持在一定范围内。
反应液适合使用水，也可以在含有少量乙醇等水混溶性有机溶剂的含水醇等水性溶剂中进行。
通过对酶解产物(酵素分解物)的反应液进行热处理、以及根据需要进一步进行离心分离、过滤、提取、脱盐、冻干(或喷雾干燥)等后处理，可以得到本发明的蛋白分解物。例如，使用生蜂王浆或干燥蜂王浆作为蜂王浆材料的情况下，也可以除去来自蜂王浆的糖类等成分。在本发明的优选实施方式之一中，本发明的蜂王浆材料的蛋白分解物利用凝胶过滤柱测定的分子量为约200～约7000，特别是约250～约6000，具有分子量约200～约300的尖峰，和在分子量约200～约1500的范围内具有最大峰。从凝胶过滤柱的测定结果推定的蛋白分解物的推定分子量为约700～约6000，优选约800～约5000。
在本发明的其他优选的实施方式之一中，本发明的蜂王浆材料的蛋白分解物实质上(実質的に)不含有糖类、盐类、以及选自酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中的至少一种。如前所述，在用胰蛋白酶处理蜂王浆材料的情况下，在蛋白水解时，优选加入碱如氢氧化钠等维持反应液的pH为对胰蛋白酶合适的pH即约6～约10，特别是pH约7～约9。这样添加的碱(例如氢氧化钠)，在酶反应后向反应液中添加酸(例如盐酸)，将pH调整为约3.5～约7，优选约4～约5.5，将碱(例如氢氧化钠)变成对应的盐(例如氯化钠)。这时生成的大量的盐特别是氯化钠等含钠的盐的情况下，由于钠是升压物质，因而优选除去。该脱盐可以通过例如使用脱盐柱实施，具体而言，使用含有苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的疏水性的合成吸附剂(例如ダイヤイオンHP-20(由三菱化学制造)、セパビ一ズSP-70(由三菱化学制造)吸附蛋白分解物，用水洗涤除去氯化钠等盐，然后使用甲醇、乙醇、乙腈等合适的有机溶剂进行洗脱，由此可以得到脱盐的、实质上不含无机盐类的蛋白分解物。当在脱盐中使用合成吸附剂时，例如难以吸附于疏水性的合成吸附剂上的Asp、Glu、Lys、Arg等的酸性或碱性游离氨基酸等会和无机盐类一起除去，另一方面，Phe、Leu、Ile、Trp、Val等为疏水性的容易吸附于合成吸附剂上的游离氨基酸即使通过脱盐操作也难以除去。另外，Ser、Thr等具有醇羟基的游离氨基酸、以及游离Ala，游离Gly等也难以吸附在疏水性的合成吸附剂上，因而和酸性或碱性的游离氨基酸同样地容易与无机盐类一起被除去。
本发明的一个实施方式中，在蜂王浆的蛋白分解物中产生较多的游离Lys，但通过使用合成吸附剂柱进行的脱盐处理，大部分被水洗除去，因而在用乙醇等洗脱回收的分级的蛋白分解物中实质上不含有游离Lys。
本发明的另一实施方式中，在蜂王浆的蛋白分解物中也存在很多游离Ala，对于游离Ala，通过使用合成吸附剂柱进行的脱盐处理将其大部分水洗除去，因而在用乙醇等洗脱回收的分级的蛋白分解物中实质上不含有游离Ala。
这里，所说的“实质上不含有游离氨基酸”是指该游离氨基酸的含量为约0.01μmol/10mg以下，优选为约0.001μmol/10mg以下，更优选为0.0001μmol/10mg以下。
在本说明书中，“酸性氨基酸”是指Glu和Asp，碱性氨基酸是指Lys、His、Arg，具有醇羟基的氨基酸是指Thr、Ser。
优选的实施方式之一中，本发明的蛋白分解物中的盐类(特别是氯化钠)的含量为1重量％以下，更优选0.2重量％以下，进一步优选0.1重量％以下，特别是检测限以下。
如上所述，经脱盐处理虽然碱性游离氨基酸、酸性游离氨基酸、醇性游离氨基酸、游离Ala、游离Gly等的浓度降低，但是ACE抑制活性几乎或完全没有降低。认为这是由于碱性游离氨基酸、酸性游离氨基酸、醇性游离氨基酸、游离Ala和游离Gly等对ACE抑制活性的贡献率低的原因。
本发明的优选的另外的一个实施方式中，本发明的蛋白分解物中在以Gly为基准时Lys的残存率(以摩尔数比较)为蜂王浆材料的25～70％，30～60％，35～55％，40～50％。例如对于本发明的实施例得到的蛋白分解物，
酶解(酵素分解)前的蜂王浆材料(乙醇沉淀物)
相对于Gly(1摩尔)，Lys为(1.1摩尔)
酶解产物(酵素分解物)(用填充有合成吸附剂的柱处理脱盐后，回收的样品)
相对于Gly(1摩尔)，Lys为(0.5摩尔)
故根据数学式1计算Lys的残存率为，
100×(0.5/1.1)＝约45％。
虽然根据蜂王浆材料、分解条件的不同多少有些变动，但是在通过合成吸附剂吸附蛋白分解物进行脱盐的情况下，很明显游离Lys的含有浓度和原来的分解物相比降低了。
本发明的优选的其它的一个实施方式中，本发明的蛋白分解物中，在以Lys为基准时Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的约1.3～约3.5倍，例如为约1.5～约3倍，约1.7～约2.7倍或约2～约2.5倍。例如对于由本发明实施例所得到的蛋白分解物，
酶解前的蜂王浆材料(乙醇沉淀物)
相对于Lys(1摩尔)，Leu为(约1.1摩尔)
酶解产物(用填充有合成吸附剂的柱脱盐后，回收的样品)
相对于Lys(1摩尔)，Leu为(约2.5摩尔)
因此，根据数学式2计算Leu的含有比例(摩尔基准)为，
2.5/1.1＝约2.3倍
在本发明的蛋白分解物中，比未分解的高分子量的蛋白质、胰蛋白酶等残留时，根据需要可以利用超滤等除去。
本发明的优选的其它的一个实施方式中，优选本发明的蛋白分解物中来自蜂王浆的糖类含量低。糖类(糖分)含量只要不破坏蛋白分解物的质量即可，没有特别限定，通常为35重量％以下，优选为30重量％以下，更优选为25重量％以下。糖分例如有：葡萄糖、果糖、半乳糖、麦芽糖、蔗糖等单糖或二糖。这些糖分由于在保存时和蛋白分解物缓慢反应(例如美拉德反応)，使蛋白分解物变成褐色，或导致吸湿性升高，因此希望尽可能地除去。
本发明的蛋白分解物可以在酶处理后优选通过进行脱盐处理来制造，还可以进一步通过柱等处理收集ACE抑制活性更强的级分。然后，根据需要经反复进行同样的纯化，分离具有ACE抑制作用的肽，分离或浓缩该生理活性肽，用作具有ACE抑制作用的蛋白分解物。
对于ACE抑制肽而言，例如，将本发明的蛋白分解物施加至合成吸附剂或凝胶过滤剂、分子筛、反相色谱等中，用水、甲醇、乙醇、或这些的混合溶液等适当洗脱液进行洗脱，分离成各种级分，对ACE抑制活性强的级分利用制备型HPLC等常规方法分离肽，经结构鉴定也可以分离ACE抑制活性强的肽。
本发明的优选的一个实施方式中，使蜂王浆材料经胰蛋白酶进行处理得到的蛋白分解物吸附在作为合成吸附剂之一的HP-20柱上，根据下述流程图1，可以分级成7个级分。
另外，本说明书中，有时将级分(Fraction)简写为“Fr”或“P”。例如级分4可以写作“Fr4”或“P4”。
流程图1
蜂王浆蛋白水解液855mL(相当于冻干物50g)
↓
加到ダイヤイオンHP20(柱尺寸：φ11cm×20cm、容量：约1.9L)上
↓洗涤液：使用水3260mL
↓洗脱液：20％、40％、60％、80％、100％MeOH
↓·20％甲醇使用2460mL
↓·40％甲醇使用2340mL
↓·60％甲醇使用2720mL
↓·80％甲醇使用2300mL
↓·100％甲醇使用3200mL
洗涤液及各洗脱液
↓使用蒸发器(40℃)浓缩
各浓缩液
↓
冻干
水洗涤级分：级分1和2
20％甲醇洗脱级分：级分3
40％甲醇洗脱级分：级分4
60％甲醇洗脱级分：级分5
80％甲醇洗脱级分：级分6
100％甲醇洗脱级分：级分7
在上述级分中，优选含有级分3～6的制品。也可以含有级分7，但因为级分7的收率少，所以含有级分3～6的蛋白分解物显示充分的降压作用。另外，级分1，2尽管可以显示出ACE抑制作用，但是因为含有氨基酸和无机盐类(例如NaCl)，所以不是必须包含在本发明的蛋白分解物中。
本发明的蛋白分解物，当通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物(商品名：三菱化学公司制MCI-GEL，CHP55Y)的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下述式表示的相关成分含量(％)为35％以上，优选为40％以上，更优选为50％以上，进一步优选为50～70％，特别优选为58±5％、最优选为58±3％，
·相关成分含量(％)＝A1/AT×100
T1：色氨酸的保留时间
T2：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间
A1：从在T1的洗脱位置检测的峰之后到在T2的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和
AT所有的峰面积的总和。
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性
粒度分布；30μm
细孔径；250
官能团；没有
适用pH范围：全区域
柱(4.6mmφ×150mm)
在上述A1中，主要含有级分4和级分5。
蜂王浆蛋白水解物(被分析物)的相关成分含量的测定例如可以在以下的条件(试验方法)下进行。
试验方法
称量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10mL溶解，并且制成50mL。用薄膜过滤器(0.45μL)过滤该液体，将滤液作为待检液体。
或者，称量本品0.50g，添加水/甲醇混合液(1∶1)10mL及磷酸缓冲液(pH8.0)1)10mL进行溶解，再添加水15mL和稀醋酸2)5mL并充分地振荡混合，加水制成50mL。用薄膜过滤器(0.45μL)过滤该溶液，将滤液作为待检液体。
另外，称量1mg色氨酸3)及甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸4)5mg，添加醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)5)5mL进行溶解，再加水制成10mL，作为A液。
称量10-羟基-δ-癸烯酸标准品6)5mg，添加水/甲醇混合液(1∶1)0.5mL进行溶解。在该溶液中添加A液0.5mL，充分混合，作为比较液。
分别取待检液体和比较液各50μL，在下述操作条件下进行液相色谱测定。将比较液的色氨酸及10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间设为T1及T2，测定从在待检液体的T1的洗脱位置检测的峰之后到在T2的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和A1及全部的峰面积的总和AT，经下式求出相关成分含量。
相关成分含量(％)＝A1/AT×100
操作条件
检测器：紫外分光光度计(测定波长：275nm)
柱：向内径4.6mm，长度150mm的不锈钢管中填充30μm的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物7)。
柱温：50℃左右的恒定温度
流动相A：水/甲醇混合液(199∶1)
B：甲醇/水混合液(19∶1)
流速*：1mL/分钟
梯度条件
0分     → 10分    A∶B＝92∶8               保持
10分    → 12分    A∶B＝92∶8 →A∶B＝50∶50直线
12分    → 22分    A∶B＝50∶50              保持
22分    → 30分    A∶B＝50∶50→A∶B＝10∶90直线
30分    → 45分    A∶B＝10∶90              保持
45.01分 → 55分    A∶B＝92∶8               保持
面积测定范围：10-羟基-δ-2-癸烯酸保留时间的约1.5倍的范围
*对于流速和梯度条件，进行适当地调整，以满足下述系统适合性。
系统适合性
系统的性能：对于比较液50μL，在上述的操作条件下进行液相色谱测定时，以色氨酸、甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸、10-羟基-δ-2-癸烯酸的顺序洗脱，色氨酸和甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸的分离度为3以上，甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸和10-羟基-δ-2-癸烯酸的分离度为5以上。
注：
1)磷酸缓冲液(pH8.0)：按照日本食品添加剂标准(食品添加物公定書)进行制备。
2)稀醋酸：按照日本食品添加剂标准进行制备。
3)L-色氨酸：使用C11H12N2O2，和光纯药工业株式会社公司制造的特级试剂或同等质量的产品。
4)甘氨酰-L-亮氨酰-L-酪氨酸：使用C17H25N3O5，フルカ(リ一デル·デ·ハ一ン)公司制的含量为98％以上或同等质量的产品。
5)醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.0)：将醋酸钠三水合物5.44g溶解在水900mL中，滴加醋酸(100)，将pH调整为4.0之后，添加水至1000mL。
6)10-羟基-δ-2-癸烯酸标准品：使用(E)-10-羟基-δ-2-癸烯酸标准品(C10H18O3)，由和光纯药工业株式会社公司制造或同等质量的产品。
(7)苯乙烯-二乙烯基苯共聚物反相用聚合物：使用三菱化学公司制造的MCI-GEL CHP55Y或同等质量的产品。
下面，对级分3～6的相关成分(肽)的分离和其鉴定按如下所述进行。
(a)经大口径柱分离
HPLC条件
柱：TSK-gel ODS 120T 55mmφ×300mm東ソ一
保护柱：TSK-gel ODS 120T 45mmφ×55mm東ソ一
流动相：水/乙腈混合液*/0.05％TFA
流量：42mL/分钟
柱温：室温
检测波长：220nm
*：乙腈浓度7～25％、50％(洗出)
(b)经中口径柱分离
HLPC条件
柱：COSMOSIL-5C18-AR II 20mmφ×250mmナカライテスク
和/或COSMOSIL-5C18-AR II 10mmφ×250mmナカライテスク
流动相：水/甲醇混合液*/0.05％TFA
流量：8mL/分钟或2mL/分钟
柱温：40℃
检测波长：220nm
*：甲醇浓度
等度(イソクラテイツク)方式2～35％、50％(洗出)
梯度方式A液0％(0.05％TFA)、B液50％
(c)各分部分离液(分取液)的纯度的确认
<HLPC条件>
检测器：紫外分光光度计(测定波长：220nm)
柱：COSMOSIL-5C18-AR II 4.6mmφ×250mmナカライテスク
流动相：水/甲醇混合液*/0.05％TFA
流量：0.4mL/分钟
柱温：40℃
*：甲醇浓度2～40％
ACE抑制率的测定
测定纯度为85％以上的级分的ACE抑制率。
另外，也进行纯度为85％以下的样品的一部分测定。
ACE抑制率的测定方法
试样溶液(反应液中浓度：0.1mg/mL)    25μL
↓ACE溶液(来自兔肺的血管紧张素I转化酶：25mU/mL)50μL
预温育(プレインキユベ一ト)37℃-5分钟
↓底物溶液(马尿酰-L-组氨酰-L-亮氨酸：12.5mM)50μL
温育(インキユベ一ト)37℃-60分钟
↓盐酸(9→200)125μL
↓内标液(m-马尿酸：0.625mM)100μL
↓乙酸乙酯750μL
↓涡流混合机10秒×2
离心分离(2000rpm，5分钟)
↓
有机层500μL
↓在60℃、氮气气流下干燥硬化
↓流动相500μL
↓用涡流混合机溶解
将20μL注入HPLC
<HPLC条件>
检测器：紫外分光光度计(测定波长：228nm)
柱：L-column ODS 4.6mmφ×150mm，化学物质评价研究机构
流动相：0.01M磷酸缓冲液(pH3.0)/乙腈混合液(17∶3)
流量：1.0mL/分钟
柱温：40℃
注射量：20μL
(d)组成氨基酸(構成アミノ酸)的测定
对于分离量为2mg以上或ACE抑制率为20％以上的级分，在加酸水解之后测定氨基酸浓度，求出组成氨基酸。
组成氨基酸的测定方法
<加酸水解法-1：不含色氨酸的分离肽>
试样溶液(1mg/mL 50％甲醇溶液)50μL
↓使用Pico-Tag(Waters)在减压条件下干燥硬化(室温)
残留物
↓+6mol/L盐酸溶液(含有1％苯酚)0.2mL(放入反应瓶中)
↓经Pico-Tag法水解(110℃、22小时)
↓冷却后
↓使用Pico-Tag在减压条件下干燥硬化(室温)
残留物
↓+0.02mol/L盐酸试液0.25mL(稀释5倍)
20μL/氨基酸分析
<加酸水解法-2：含有色氨酸的分离肽>
试样溶液(1mg/mL 50％甲醇溶液)50μL
↓使用Pico-Tag(Waters)在减压条件下干燥硬化(室温)
残留物
↓+4mol/L甲磺酸溶液(含有0.2％的色胺)20μL
↓+水0.2mol/L(放入反应瓶中)
↓经Pico-Tag法水解(110℃、22小时)
↓冷却后
↓+4mol/L氢氧化钾溶液22μL
↓使用Pico-Tag在减压条件下干燥硬化(室温)
残留物
↓+0.05mol/L盐酸试液0.25mL(稀释5倍)
20μL/氨基酸分析
<氨基酸分析条件>
(利用茚三酮反应的后标记法)
装置：L-8500型日立高速氨基酸分析计
柱：4.6mmID×80mm日立カスタムイオン交换树脂(#2622SC，LotNo.K99272)(Na型、高分离分析、梯度法)
缓冲液：日立高速氨基酸分析计用缓冲液L-8500PH-KIT(由三菱化学或和光纯药公司制造)
V1：PH-1(向PH-1 500mL中添加乙醇(99.5)65mL和水，制成1000mL)
V2：PH-2
V3：PH-3(未使用)
V4：PH-4
V5：PH-RG
反应液：茚三酮试液-L8500套装(由和光纯药公司制造)
流量：缓冲液0.26mL/分钟
反应液0.30mL/分钟
注射量：20μL
测定波长：570nm(Pro：440nm)
(e)氨基酸序列的测定
基于ACE抑制率和组成氨基酸的测定结果，可以推测ACE抑制活性率比较高，含量较多，并且对于纯度较高的肽，尝试通过N-末端氨基酸分析法(埃德曼降解法)对氨基酸序列进行解析。
埃德曼降解法的操作条件
试样溶液的制备方法
量取一定量的各试样，各自添加纯化水溶解，达到1nmol/μL。进一步用纯化水稀释10倍，达到100pmol/μL。其中，使用各2μL(200pmol)，用下述装置测定。
装置：多肽氨基酸序列测定仪(PPSQ-23A，SHIMADZU)
PTH分析仪(SPD-10A，SHIMADZU)
序列明细表(シ一ケンススケジユ一ルフアイル)(standard GFD)
测定结果
对于推测为ACE的抑制活性率比较高，含量较多的肽，尝试经埃德曼降解分析氨基酸序列。
结果是，可以鉴定出结构的是4个检测样(A1～A4)，从HP-20的粗级分的Fr4部分可以鉴定3种肽的结构，从Fr5部分可以鉴定1种肽的结构。
将根据它们的结构式及ACE抑制率的测定结果所求得的ACE抑制活性IC50值示于下述的表1中。
表1
  级分   氨基酸序列   ACE抑制活性IC50值
  mg/mL   μM
  Fr.4级分   Thr-Ser-Asn-Thr-Phe(A1)   0.24   420
  Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr(A2)   0.08   120
  Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr(A3)   0.15   240
  Fr.5级分   Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg(A4)   0.08   110
本发明的蛋白分解物(含有鉴定为有效成分或相关成分的前述4种肽。以下相同)可以调整到等电点的pH后，作为游离(自由)的蛋白质分解物使用，或者调整到比等电点偏酸性或偏碱性的一侧的pH之后，通过冻干、喷雾干燥等除去溶剂，或者添加乙醇等的溶剂使其沉淀等方法，由此可以得到酸加成盐(盐酸盐等无机酸盐或富马酸盐等有机酸盐)或碱盐(例如Na，K等的碱金属盐)的形式。碱盐优选尽可能降低升压物质即钠的含量。这样的蛋白分解物可以在溶液形态下使用，通常优选以固形物，例如结晶、非晶形或粉末的形态分离，使用。
本发明的蛋白分解物本身可以用作食品，或者单独或和适当的无毒口服用载体、稀释剂或赋型剂一起做成片剂(未包衣片、糖衣片、泡腾片、薄膜包衣片、咀嚼片等)、胶囊剂、锭剂、粉末剂、细粒剂、颗粒剂、液体制剂、悬浊液、乳浊液、糊剂、霜剂、注射剂(包括添加到氨基酸输液、电解质输液等的输液中的情况)、或者可以做成用于肠溶性片剂、胶囊剂、颗粒剂等缓释制剂等的食品或药品制剂。前述制剂中的蛋白分解物的含量可以适当选择，一般是0.01～100重量％的范围。
另外，通过添加、混合本发明的蛋白分解物(蜂王浆酶解产物)制备得到的食品的具体形态例如有：饮料类(清凉饮料(咖啡、可可饮料、果汁、矿物质饮料、茶饮料、绿茶、红茶、乌龙茶等)、乳饮料、乳酸菌饮料、酸乳饮料、碳酸饮料、酒类(日本米酒、洋酒、果酒、蜂蜜酒等)等)、涂抹食品(スプレツド)(乳蛋糕乳脂、加糖奶油浆、花生酱、巧克力酱、涂抹干酪等)、糊状物(果泥、蔬菜泥、芝麻糊、海藻糊等)、洋点心(巧克力、炸面圈、馅饼、奶油面包、手指形小蛋糕、松饼、华夫饼干、口香糖、Gummi糖、果冻、糖果、曲奇饼、克力架、饼干、方便点心、蛋糕、布丁等)、日式点心(饴糖、日本脆饼干、油炸糖点心、米雪、米粉团、牡丹饼、年糕饼、豆饼、饼、馅、馒头、蛋糕、豆沙水果凉粉、羊羹等)、冰果(冰激淋、冰棍、果子露冰激淋、刨冰等)、蒸煮食品(咖喱、牛肉饭、中华饭、杂饭、稀粥、酱汤、汤、肉沙司、半冰沙司、肉球、汉堡、杂烩类、红小豆米饭、烤鸡肉串、蒸鸡蛋羹等)、速食食品(方便面、速食乌冬面、速食荞麦面、速食炒面、速食意大利实心面、速食混沌面、速食年糕小豆汤、酱汤料、粉末汤料、果汁粉混料、混合热糕点等)、瓶装食品及罐装食品、胶状食品(果冻、琼脂、陶罐装食品、胶状饮料等)、调料(食盐、天然盐、酱油、日本甜料酒、醋、砂糖、蜂蜜、大酱、调味品、增香调料、复合调料、沙司、蛋黄酱、番茄酱、添加粉末的食品、天麸罗料汁、面汁(麺つゆ)、即食肉汤料、中华清汤料、中华汤料(麻婆豆腐料、青椒肉丝料)、肉汤、烤肉佐料、冷火锅佐料、咖喱糊、炖菜糊等)、蜂产品(蜂蜜、蜂王浆、蜂胶、花粉团子、蜂幼虫等)、乳制品(牛奶、乳酪、酸奶、生奶油等)、经加工果实(果酱、橘皮果酱、糖水水果、干果等)、经加工蔬菜(蔬菜果酱等)、谷物类加工食品(面、意大利面条、面包、米粉等)、腌菜(咸菜、奈良泡菜、朝鲜泡菜、福神泡菜、腌葱、腌白菜、芥末腌菜、腌结缕草、少盐腌菜、腌渍品等)、腌菜料(即食腌菜材料、腌白菜材料等)、鱼肉制品(鱼糕、竹轮、鱼肉山芋饼等)、畜肉制品(火腿、红肠、腊肠、腊肉等)、美味(枪乌贼(さきするめ)、腌制鳕鱼、腌海胆、腌墨斗鱼、腌章鱼、丝背细鳞鲀干、河豚干、熏墨斗鱼、腌海参肠等)、干物(带味海苔等)、日常食品类(拌菜、油炸食品、炒菜、烧菜、煮菜、醋拌食品等)、冷冻食品(炸虾、炸肉饼、春卷、炸猪排、烧麦、饺子、汉堡、章鱼丸子、圆薄饼(旋转烙饼)、肉包子、有馅馒头等)、油脂食品(色拉油、人造黄油、黄油)等。通过添加、混合本发明的蜂王浆蛋白分解物可以制备的食品也可以作为保健食品、功能性食品、营养辅助补品、辅助品、特定保健用食品、患者用食品·患者用组合食品(厚生劳动省、特别用途食品的一种)或高龄者用食品(厚生劳动省、特别用途食品的一种)，这种情况下，也可以做成未包衣片、薄膜包衣片、糖衣片、颗粒、粉末、药片、胶囊(包括硬胶囊和软胶囊中的任何一种)、咀嚼型、糖浆型、饮品型等。添加、混合有本发明的蜂王浆酶解产物的食品的制备可以使用公知的方法。
含有本发明蛋白分解物的特定保健用食品等食品对血压的正常高值(收缩压为130～139mmHg，舒张压为85～89mmHg)以及轻度高血压(收缩压为140～159mmHg或者舒张压为90～99mmHg)的两类人具有预防高血压的效果。
本发明的蛋白质分解物对轻度高血压及正常高值血压的受试者具有特别有效的降压作用，但对正常或低血压受试者的血压几乎没有影响，只显示轻微的作用，具有理想的预防高血压的效果。
本发明的蛋白质分解物经口服由口腔粘膜或小肠直接吸收，或者，在胃肠道中水解而被吸收之后，显示较强的持续抑制ACE的作用，为了预防高血压症、缓和高血压倾向或调节血压，可以继续摄取，可以用作预防高血压的功能性食品、特别是特定保健用食品等。为了该目的使用本发明的蛋白分解物或制剂时，一般来说体重60kg的成人一天口服10mg～10g、优选0.1～5g、更优选0.5～3g、特别优选0.5～1g的范围。
另外也可以将本发明的蛋白质分解物与蜂王浆、蜂胶、蜂蜜、花粉、蜂幼虫等并用，或混合使用。
本发明的蛋白质分解物几乎或完全没有过敏反应等副作用，作用持续时间长、一天摄取(给药)一次可以显示充分的降压作用。而且，虽然具有速效性，但是没有像血压快速降低、或大量饮用时血压大幅度降低，具有安全性高的降压作用。另外对人具有优良的降压作用。
具体实施方式
下面，使用实施例进一步详细地说明本发明。
实施例1
使用向蜂王浆中添加乙醇沉淀的乙醇变性蛋白质1g，添加猪胰蛋白酶250mg，在pH8.0下处理24小时。反应结束后，在100℃下加热10分钟，使酶失活。
将该反应液调至pH4.5，施加到合成吸附剂(セパビ一ズSP-70(由三菱化学制造))上，经水洗除去氯化钠以及酸性或碱性的游离氨基酸、和糖类等，之后用乙醇洗脱，得到脱盐的本发明的蛋白分解物。
脱盐后的蛋白分解物，实质上不含有碱性游离氨基酸、酸性游离氨基酸、醇性游离氨基酸、游离Ala和游离Gly，根据数学式1计算Lys的残存率为约45％，根据数学式2计算Leu的含有比例(摩尔基准)为约2.3倍。并且，糖分的含量为35重量％以下，明确了放入铝袋中，即使在40℃，6个月的加速试验中也没有变色。
另外，取出经过24小时处理后的猪胰蛋白酶分解物25mg，加入流动相20mL，经超声波处理溶解，精确作成25mL，对其10μl进行下述的凝胶过滤色谱(GFC)分析，检查分子量分布。
<GFC分析>
柱：TSKgel G2000SWXL 7.8mmI.D.×30cm
流动相：0.1％TFA/乙腈
流速：1.0mL/分钟
柱温：25℃
检测：UV(220nm)
GFC分析结果如图1所示。
实施例2：蜂王浆(RJ)蛋白水解物的相关成分的结构分析
取蜂王浆的乙醇变性蛋白100g，利用猪胰蛋白酶(由Novozyme制造的来自猪的胰蛋白酶)在pH8.0、37℃下酶解24小时。将反应液在沸水浴中加热30分钟，使酶失活后，用盐酸调至pH4.5，离心分离(10000rpm，20分钟)，将得到的上清液用薄膜过滤器(0.8μm)过滤，得到RJ蛋白水解物1160mL。
将得到的RJ蛋白水解液按照上述流程图1使用ダイヤイオンHP20，用水、20％、40％、60％、80％的甲醇以及甲醇(100％)洗脱，得到级分1(Fr1)～级分7(Fr7)。
然后，由级分3～6鉴定的4种相关成分(肽)的分离和鉴定的详细说明如下所示：
蜂王浆蛋白水解物的相关成分的分离、鉴定
1.分离鉴定肽
HP20      级分Fr4
分离肽A1：Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
分离肽A2：Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
分离肽A3：Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
HP20      级分Fr5
分离肽A4：Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
2.相关成分鉴定用检测样的制备
(1)蜂王浆蛋白水解物的制备
在蜂王浆乙醇变性蛋白100g中添加水1200mL，在37℃的水浴中边搅拌边添加20％的氢氧化钠溶液，调至pH8.0，添加猪胰蛋白酶250mg，在37℃下酶解24小时之后，在沸水浴中加热30分钟。向其中加入稀释的盐酸调至pH4.5，进行离心分离(10000rpm，20分钟)之后，将得到的上清液用薄膜过滤器过滤，得到蜂王浆蛋白水解液1160mL。
(2)经ダイヤイオンHP20粗分级
将蜂王浆蛋白水解液855mL加至填充有ダイヤイオンHP20作为合成吸附剂的玻璃柱(11cmφ×20cm，容量：约1.9L)中，按照水、20％、40％、60％、80％及100％的甲醇的顺序洗脱，将水洗脱级分设定为级分(以下称Fr)1、2，将20％、40％、60％、80％及100％甲醇洗脱级分分别设定为Fr3，4，5，6及7。用蒸发器将各分级液浓缩后冻干，将得到的级分Fr4和级分Fr5作为相关成分鉴定用的检测样。
3.蜂王浆蛋白水解物的相关肽的分离、鉴定
(1)来自级分Fr4的相关肽的分离、鉴定
分离肽A1：Thr-Ser-Asn-Thr-Phe
对于利用HP20粗分级的级分Fr4约5g，通过利用大口径制备用ODS柱的高效液相色谱法[柱：TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流动相：10％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量：42mL/分钟，柱温：室温，检测波长：UV220nm。以下，称为HPLC]进行再分级。
将得到的各分级液进行浓缩、冻干，得到P4(1)、P4(2)(0.536g)，P4(3)，P4(4)(不进行冻干，浓缩后供肽-A3的分离)。
再次使用大口径的制备用ODS柱，用8％和50％的乙腈(含有0.05％TFA)作为流动相将P4(2)(0.536g)再次分离为7个级分，将各分级液进行浓缩、冻干，得到P4012-11～P40121-13、P4012-14(95.4mg)、P4012-15(44.5mg)、P4012-16以及P4012-17。
使用中口径的半制备用ODS柱，对P4012-14(95.4mg)进行分部分离(分取)、纯化。柱使用COSMOSIL 5C18 AR-II20mmφ×250mm，在流动相：12.5％以及50％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量：8mL/分钟，柱温：40℃，检测波长：UV220nm的条件下，再次分离为6个级分，将各分级液浓缩、冻干，得到P40409-1、P40409-2、P40409-3(26.7mg)以及P40409-4～P40409-6。
再次使用中口径的半制备用ODS柱对得到的P40409-3(26.7mg)进行分部分离(分取)、纯化。使用流动相A为0.05％TFA，流动相B为50％的甲醇(含有0.05％TFA)的浓度梯度法(0分钟：B 10％→360分钟：B 100％)，分部分离保留时间为69.7分钟～76.3分钟的峰部分，将得到的分级液进行浓缩、冻干，得到P40409-3-1(8.6mg)。
利用HPLC测定得到的P40409-3-1的纯度，并且在通过加酸水解后的氨基酸分析实施组成氨基酸的测定后，用埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法，确定P40409-3-1(A1)的结构为Thr-Ser-Asn-Thr-Phe。
分离肽A2：Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr
进一步使用中口径的半制备用ODS柱，对先前通过大口径制备用ODS柱二次实施再分级操作得到的P4012-15(44.5mg)，进行分部分离、纯化。流动相使用12.5％甲醇(含有0.05％TFA)，分部分离保留时间为95.5分钟～103.4分钟的峰部分，将得到的分级液进行浓缩、冻干，得到P40410-4(6.1mg)。
利用HPLC测定所得到的P40410-4的纯度，并在通过加酸水解后的氨基酸分析实施组成氨基酸的测定后，经埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法确定了P40410-4(A2)的结构为Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr。
分离肽A3：Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr
再次使用大口径制备用ODS柱，对经大口径制备用ODS柱进行再分级得到的P4(4)在同一条件下分级为6个级分，将各分级液进行浓缩、冻干，得到P41206-3、P41206-4(177.8mg)以及P41206-5～P41206-8。
进一步使用中口径的半制备用ODS柱，对P41206-4(177.8mg)的100mg，进行分部分离、纯化。在流动相：12.5％以及50％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量：7.6mL/分钟，柱温：40℃，检测波长：UV220nm的条件下分部分离，将得到的分级液浓缩、冻干，得到P41219-2、P41219-3(11.12mg)和P41219-4。
再次利用中口径的半制备用ODS柱，对得到的P41219-3(11.12mg)进行分部分离、纯化。流动相使用17.5％甲醇(含有0.05％TFA)，分部分离保留时间为63.5分钟～70.6分钟的峰部分，将得到的分级液进行浓缩、冻干，得到P41219-3-2(5.25mg)。
利用HPLC测定所得到的P41219-3-2的纯度，并在通过加酸水解后的氨基酸分析实施组成氨基酸的测定后，经埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法确定了P41219-3-2(A3)的结构为Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr。
(2)来自Fr5级分的相关肽的分离、鉴定
分离肽A4：Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg
对利用HP20粗分级的级分Fr5约5g，通过利用大口径制备用ODS柱的高效液相色谱法[柱：TSK-gel ODS 120T(55mmφ×300mm)，流动相：15％、20％以及50％乙腈(含有0.05％TFA)，流量：42mL/分钟，柱温：室温，检测波长：UV220nm]进行再分级。
将得到的各分级液进行浓缩、冻干，得到P5(1)～P5(5)、P5(6)(0.379g)以及P5(7)～P5(9)。
再次利用中口径的半制备用ODS柱对得到的P5(6)(0.379g)，进行分部分离、纯化。在使用流动相A为0.05％TFA，流动相B为50％的甲醇(含有0.05％TFA)的浓度梯度法(0分钟：B 45％→240分钟：B100％)，流量：8mL/分钟，柱温：40℃，检测波长：UV220nm的条件下，再次分级为13个级分，将得到的各分级液进行浓缩、冻干，得到P5(vi)-1、P5(vi)-2、P5(vi)-3(20.3mg)以及P5(vi)-4～P5(vi)-13。
使用口径较小的ODS柱，对得到的P5(vi)-3(20.3mg)进行分部分离、纯化。柱使用COSMOSIL 5C18 AR-II 10mmφ×250mm，在流动相：25％的甲醇(含有0.05％TFA)，流量：2mL/分钟，柱温：40℃，检测波长：UV220nm的条件下，分部分离保留时间41.7分钟～46.3分钟的峰部分，对得到的分级液进行浓缩、冻干，得到P5(vi)-3-2(5.3mg)。
利用HPLC测定得到的P5(vi)-3-2的纯度，并且在利用加酸水解后的氨基酸分析实施组成氨基酸的测定后，经埃德曼降解N末端氨基酸序列分析法，确定P5(vi)-3-2(A4)的结构为Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
实施例3：蛋白分解物的临床试验
和实施例1同样的，得到RJ乙醇变性蛋白的猪胰蛋白酶分解物(含有本发明的4种新型肽)，将其根据上述流程图，吸附于ダイヤイオンHP20后，经水洗除去级分1和2，然后用80％乙醇洗脱，制备成含有级分3～6的本发明的蛋白分解物，提供给以下实验。
为了研究长期摄取含有所得到的蜂王浆蛋白质水解物(RJPH)的片剂的降压作用和安全性，实施了对于血压高的人群(正常高值血压患者以及轻度高血压患者都没有治疗)以安慰剂作为对照的双盲试验。为使受试者的性别、年龄、收缩压、舒张压、脉搏数、体重、BMI没有差别，分为受试人群(男/女＝26/28、平均年龄49.7±11.2、收缩压140.1±6.9mmHg、舒张压81.7±7.1mmHg)和安慰剂人群(男/女＝24/29、平均年龄52.6±10.5、收缩压140.5±6.6mmHg、舒张压83.0±7.8mmHg)，对受试人群给与含有RJPH的片剂(250mg/片)，1日4片(RJPH/1000mg/天)，对安慰剂人群给与不含RJPH的片剂，1日4片，分别一日一次。连续给药12周。
其结果如下表所示，在10、12周后，受试人群的收缩压和舒张压与安慰剂人群相比，显示了显著的降压作用。并且，在结束12周服药并观察4周后，血压与安慰剂人群同等程度的缓慢恢复，确认了没有过度超过服药前的值的反弹现象。
并且，在服药期间也没有确认一般被认为是试验饮食起因的血液和尿液检查值的变动，以及ACE抑制剂一般报告的空咳等有害的现象。
从以上内容，明确了含有RJPH的食品即使经过12周的长期给药，安全性也较高，对正常高值血压患者以及轻度高血压患者都具有适度的降压作用。
表2
血压的推移
  项目   组   摄取开始日              摄取时间
  2周后   4周后
  收缩压(mmHg)  受试组(n＝54)   139.7±9.3   135.8±9.8*   135.7±10.8#
 安慰剂组(n＝53)   141.0±7.5   139.1±9.6   140.9±11.9
  舒张压(mmHg)  受试组(n＝54)   82.6±8.3   79.6±9.2   80.0±8.0
 安慰剂组(n＝53)   82.4±8.2   81.1±8.0   82.5±8.1
  项目   组                   摄取时间   观察时间
  10周后   12周后   摄取结束4周后
  收缩压(mmHg)  受试组(n＝54)   135.0±7.6##，**   133.3±8.0##，**   138.4±8.6
 安慰剂组(n＝53)   140.5±9.6   141.1±10.2   140.2±9.8
  舒张压(mmHg)  受试组(n＝54)   79.1±8.1##   78.0±7.1##，**   80.3±7.7
 安慰剂组(n＝53)   83.1±6.8   82.2±6.6   81.9±7.0
平均值±标准偏差
与安慰剂组比较：#p＜0.05，##p＜0.01(t-检验)
和摄取开始日比较：*p＜0.05，##p＜0.01(Bonferroni检验)
以下表示含有本发明蛋白分解物的处方例。
处方例1(粒)
利用常法将下述原料混合，用打片机成型，制造了直径8mm的未包衣片。利用常法将该未包衣片进行食品用薄膜包衣，制成了粒状的保健食品。
(每1粒的组成)
表3
  实施例1的胰蛋白酶分解物   150mg
  淀粉   90mg
  蔗糖脂肪酸酯   10mg
  合计   250mg
处方2(饮料)
将下述材料于水中充分搅拌之后，使总量为100mL。
(1瓶的组成)
表4
  实施例1的胰蛋白酶分解物   1g
  柠檬果汁   20mL
  蜂胶   0.3g
  维生素C   0.2g
  蜂蜜   13g
  水   适量
  合计   100mL
处方3(胶囊剂)
将下述材料均匀混合，通过60目筛之后，将该粉末全部量填充于2号明胶胶囊中。
(1个胶囊剂的组成)
表5
  实施例1的胰蛋白酶分解物   100mg
  乳糖   100mg
  硬脂酸镁   10mg
  合计   210mg
处方4(颗粒)
按照常法将下述材料制成颗粒状，做成棒状的铝分包(アルミ分包)包装。
(1包的组成)
表6
  实施例1的胰蛋白酶分解物   300mg
  乳糖   1000mg
  食物纤维   100mg
  蜂蜜粉末   20mg
  维生素C   5mg
  合计   1425mg
处方5(沙司)
将下述材料充分混合，使用时充分搅拌，用于沙拉或油炸食品。
(1人量的组成)
表7
  实施例1的胰蛋白酶分解物   500mg
  蛋黄酱   10g
  整颗芥末   3g
  蜂蜜   2g
  芝麻粉   2g
  合计   17.5g

Claims (26)

1.一种具有血管紧张素转化酶抑制作用的蛋白分解物，其利用胰蛋白酶处理蜂王浆材料而得到，含有以下4种肽的至少一种：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
2.如权利要求1所述的蛋白分解物，其中蜂王浆材料是蜂王浆的醇变性蛋白质。
3.一种蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，其中，用下式
100×(相对于Gly(1摩尔)的蛋白分解物的Lys(mol))/(相对于Gly(1摩尔)的蜂王浆材料的Lys(mol))
表示的以Gly为基准时Lys的酶解后的残存率(摩尔比)为蜂王浆材料的70％以下。
4.一种蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，其中，用下式
(相对于Lys(1摩尔)的蛋白分解物的Leu(mol))/(相对于Lys(1摩尔)的蜂王浆材料的Leu(mol))
表示的以Lys为基准时Leu的含有比例(摩尔比)为蜂王浆材料的1.3倍以上。
5.如权利要求3或4所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)选自酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中的至少一种。
6.如权利要求5所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)游离酸性氨基酸及游离碱性氨基酸。
7.如权利要求6所述的蛋白分解物，其来自蜂王浆材料，实质上不含有(1)无机盐类，和(2)酸性游离氨基酸(Asp，Glu)、碱性游离氨基酸(Lys，His，Arg)、具有醇羟基的游离氨基酸(Thr，Ser)、游离Ala和游离Gly。
8.如权利要求3～5任一项所述的蛋白分解物，其中，糖分的含量为35重量％以下，在40℃、6个月(铝袋)的加速试验条件下实质上不变色。
9.如权利要求3～6任一项所述的蛋白分解物，其中，经凝胶过滤柱分析实质上未发现分子量10000以上的成分，在分子量约200～约1500的范围内具有最大的峰，具有分子量约200～约300的尖峰。
10.如权利要求3～6任一项所述的蛋白分解物，其中，平均分子量在约700～约6000的范围内。
11.如权利要求1～10任一项所述的蛋白分解物，其中，使所述蛋白分解物通过具有下述特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱(4.6mmφ×150mm)时，由下式表示的相关成分含量(％)为40％以上，
·苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的特性
粒度分布：30μm
细孔径：250
官能团：没有
适用pH范围：全区域，
·相关成分含量(％)＝A1/AT×100
T1：色氨酸的保留时间
T2：10-羟基-δ-2-癸烯酸的保留时间
A1：从在T1的洗脱位置检测的峰之后到在T2的洗脱位置检测的峰之前的峰面积的总和
AT：所有的峰面积的总和。
12.如权利要求11所述的蛋白分解物，其中，所述相关成分含量为58±5％。
13.如权利要求1～11任一项所述的蛋白分解物，其中，含有在使所述蛋白分解物通过具有以下特性的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物的柱，并且用水(级分1，2)、20％甲醇(级分3)、40％甲醇(级分4)、60％甲醇(级分5)、80％甲醇(级分6)、100％甲醇(级分7)洗脱时的级分中的级分3～6：
粒度分布：＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)
细孔径：400
官能团：没有
适用pH范围：全区域。
14.如权利要求13所述的蛋白分解物，其中，在级分4中含有由
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；和
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
组成的组中的至少一种肽，在级分5中含有
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
15.一种高血压的预防或治疗剂，其以权利要求1～14任一项所述的蛋白分解物为有效成分。
16.一种食品，其含有权利要求1～14任一项所述的蛋白分解物。
17.如权利要求16所述的食品，其为高血压预防用食品。
18.一种口服用制剂，其含有权利要求1～14任一项所述的蛋白分解物。
19.一种高血压的预防或治疗剂，其中，含有选自下述4种肽中的至少一种肽作为有效成分：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
20.如权利要求18所述的制剂，其为明确的食品和/或包含补充剂的食品形态。
21.一种血管紧张素转化酶抑制剂，其以权利要求1～14任一项所述的蛋白分解物为有效成分。
22.如权利要求1～14任一项所述的蛋白分解物的制造方法，其特征在于，用猪胰蛋白酶处理蜂王浆材料。
23.如权利要求22所述的方法，其特征在于，使用合成吸附剂对通过猪胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物进行处理，除去(1)无机盐类、和(2)选自酸性游离氨基酸、碱性游离氨基酸、具有醇羟基的游离氨基酸、游离Ala和游离Gly组成的组中的至少一种。
24.如权利要求22所述的方法，其特征在于，将通过猪胰蛋白酶处理得到的蛋白分解物吸附在苯乙烯-二乙烯基苯共聚物上，水洗除去无机盐和水溶性氨基酸，然后用含水醇洗脱。
25.如权利要求24所述的方法，其中，苯乙烯-二乙烯基苯共聚物具有下述特性：
粒度分布：＞250μm(含有90％以上粒径大于250μm的粒子)
细孔径：400
官能团：没有
适用pH范围：全区域。
26.一种新型肽，含有以下4种肽中的任何一种：
Thr-Ser-Asn-Thr-Phe；
Tyr-Ser-Pro-Val-Ala-Ser-Thr；
Thr-Asn-Asn-Leu-Tyr；
Val-Pro-Ile-Phe-Asp-Arg。
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