CN113913485A - 一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法 - Google Patents
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Abstract
一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，属于肽的修饰技术领域。本发明是以榛仁肽、紫苏肽、花生肽、大豆肽或核桃肽等活性肽为原料，通过类蛋白反应和美拉德反应对活性肽进行双重修饰，经此修饰后得到的肽抗氧化活性显著提升，功能活性明现提高且风味良好。本发明所述的修饰方法不需要进行分离纯化便可获得高抗氧化活性肽，修饰路线设计简单合理。本发明反应效率高，安全无害，极大程度简化了功能性肽的制备工艺，既节省了时间又降低了生产成本，产物活性得到大幅度提升，肽固有的不良风味也极大限度上被新生成的芳香物质所改善，可以更好应用于商业化和工业化生产，对资源的综合利用具有极大意义。
Description
技术领域
本发明属于肽的修饰技术领域，具体涉及一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法。
背景技术
生物活性肽是可调节生物体生理功能的多肽。与蛋白质相比，活性肽具有抗氧化、增强免疫、抗菌、抗病毒、降血压和降血脂等生理功能。此外活性肽还有较好的酸、热稳定性，易于作为功能因子添加到各种食品中，食用安全性极高，是极具发展前景的功能因子。目前广泛应用的药物都有一定的副作用，如：头痛、疲乏、肌肉痛性痉挛、皮疹、心悸、恶心等。人们越来越关注使用基于食品的蛋白质生物活性产品作为功能性食品、膳食补充剂和营养保健品的干预剂，以维持健康和对抗人类慢性疾病。
食物蛋白源生物活性肽安全性高、有比蛋白质更好的消化吸收性，广泛应用于食品、保健品和医药行业中。但是，酶解法水解底物蛋白制备的肽，疏水性氨基酸得到暴露，肽及肽制品会产生不同程度的臭味，以及食用会有苦味等不良风味。且天然水解肽的活性不能完全满足人们的需求。因此，为进一步提高肽的生物学效用，有必要对其功能和风味作进一步提升和改善，通过修饰处理改善活性肽本身的不良气味，且提高肽的生物活性及体内稳定性。
本发明提供了一种使用类蛋白反应和美拉德反应双重修饰工艺，工序少，在较短时间内即可获得一种风味良好的活性肽，旨在简化高活性肽制备工艺和改善肽风味，解决制约活性肽发展与应用问题，使其可以更好的应用在食品与医药行业中，也是近年来食品科学和药学领域研究中的一个重要发展方向。
发明内容
本发明的目的是提供一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其步骤如下：
称取冷冻干燥后的活性肽加入蒸馏水，使活性肽质量浓度为10％～40％，用0.5mol/LNaOH调pH值6～10，加入活性肽质量0.1％～5％的蛋白酶，于25～50℃水浴中反应3～7h，反应结束后迅速于85～95℃加热10～20min使酶灭活，再加入活性肽质量30％～300％的单糖，然后加入蒸馏水调节活性肽质量浓度至2％～20％；用0.5mol/L NaOH调pH值6～9，90～140℃油浴1～4h，反应结束后立即冷却至室温，-50～-30℃冷冻干燥20～30h后得到风味和功能性良好的高抗氧化活性肽，4℃保存。
上述方法中所述活性肽为榛仁肽、紫苏肽、花生肽、大豆肽或核桃肽中的一种，可通过蛋白酶水解法、化学合成法、基因重组法或酸碱水解法制备得到，冷冻干燥后于4℃保存。
上述方法中所述蛋白酶为风味蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的一种。
上述方法中所述单糖为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、赤藓糖、苏力糖、来苏糖或果糖中的一种。
本发明相比现有技术的有益效果为：
本发明提供一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法。以活性肽为原料，通过类蛋白反应和美拉德反应双重修饰，经此方法得到的肽抗氧化活性提升较高，肽本身的不良风味也极大程度改善。本发明公布的修饰方法操作工艺简单，美拉德反应生成2,5-二甲基吡嗪和2-乙基-3,5-二甲基吡嗪，有烤花生、巧克力、奶油、油炸可可和杏仁的香味，经常被用来配制各种食品香精，活性肽中甲基类化物的味道被新生成的芳香成分所掩盖，其次通过类蛋白反应可以掩盖肽的苦味，使肽可以更好的作为天然添加剂添加到食品中，对资源的综合利用具有极大意义。
本发明公布的修饰方法不需要进行分离纯化便可获得高抗氧化活性肽，修饰路线设计简单合理。目前为了获得高活性肽，常规方法需要采取膜分离、离子交换色谱和反相高效液相色谱等一系列分离纯化方法，既耗时又增加生产成本，且得率较低。本发明采取的修饰方法极大程度上省略了传统分离纯化等繁琐步骤，即可赋予肽高抗氧化活性，极大限度缩短时间、降低生产成本又简化了高活性抗氧化肽的制备工艺，更适合工业化生产，弥补了现有技术的不足。修饰后风味良好的高活性肽作为保健品以及食品的原料，应用于食品与医药行业中，可用于相关疾病预防。
附图说明
下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为修饰后的榛仁肽DPPH清除率图；
图2为修饰后的榛仁肽ORAC值图；
图3为修饰后的榛仁肽ACE抑制率图。
1、ORAC检测
氧自由基吸附能力(Oxigen Radical Absorbance Capacity，ORAC)是一种新型试管抗氧化分析方法，其基于通过抑制氢质子转移终止自由基链式反应。将Trolox用PBS缓冲液稀释成4个不同浓度(6.25、12.5、25和50μM)的标准溶液。同时设置两个对照组，一组为是96孔黑板中加入自由基(+AAPH)，一组为96孔黑板中不加入自由基(-AAPH)。向各孔中分别加入终浓度63mmol/L荧光素钠(FL)100μL，不同浓度Trolox 50μL，以及谷胱甘肽、实施例1步骤(1)产物或实施例1步骤(2)产物的水溶液(浓度均为1mg/mL)各10μL。随后，充分震荡96孔板2min，并在37℃控温培养箱中温育10min，除(-AAPH)孔外，其他各孔分别加入终浓度6mmol/L的AAPH 50μL，使其充分混匀后，立即用激发波长485nm，发射波长528nm进行测定并记录数值，反应过程中每隔2min测定一次荧光值(记为fn)。以荧光半数衰减时间作为纵坐标、Trolox浓度为横坐标绘制标准曲线。
2、DPPH离子清除率检测
取2.0mL谷胱甘肽、实施例1步骤(1)产物或实施例1步骤(2)产物的水溶液(浓度均为1mg/mL)分别加入试管中，随后在每个试管中加入2.0mL、0.2mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，混均后将试管置于室温避光下，反应30min。待反应终止时，测定样品在517nm处的反应液吸光度，实验中每个样品做3次重复，无水乙醇被作为参比对照。样品的DPPH自由基清除能力大小的判别依据为吸光度差值。
3、ACE抑制率的测定
将谷胱甘肽、实施例1步骤(1)产物或实施例1步骤(2)产物的水溶液(浓度均为1mg/mL)和ACE溶液(0.25mU/mL，50μL)在37℃下水浴10min，然后加入150μL、4.15mM HHL底物在37℃下水浴反应1h，加入250μL 1M HCl终止反应。加入500μL乙酸乙酯震荡提取生成的马尿酸，以3000r/min条件离心10min，将200μL上清液置于110℃的干燥烘箱中直至溶液完全蒸发。将残余物溶解在1mL蒸馏水中，并使用酶标仪在228nm下测量其UV光谱密度。
如图1、图2所示，其中，未修饰对应实施例1步骤(1)产物，二次修饰对应实施例1步骤(2)产物。修饰后的肽抗氧化指标显著提高，表明本发明制备的高抗氧化活性榛仁肽具有良好的抗氧化性；如图3所示，本发明制备的高抗氧化活性榛仁肽的ACE抑制率显著提高，说明降血压功能也得到了改善，是一种风味良好的高活性肽作为保健品以及食品的原料，应用于食品与医药行业中，可用于相关疾病预防。
具体实施方式
以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明作任何限定。
实施例1：
(1)榛仁肽制备
参考文献“Exploration of the molecular interactions betweenangiotensin-I-converting enzyme(ACE)and the inhibitory peptides derived fromhazelnut(Corylus heterophylla Fisch.)，Chunlei Liu，Wei-hong Min”所述方法制备榛仁肽，冷冻干燥后于4℃保存；
(2)榛仁肽修饰
取25g冷冻干燥后的榛仁肽，用蒸馏水配成榛仁肽质量浓度为25％的溶液，用0.5mol/L NaOH调pH值8.1，然后加入榛仁肽质量2.55％的碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)，于41.2℃水浴中反应4.5h，反应结束后迅速于90℃下加热15min使酶灭活；再加入45g的木糖和500mL蒸馏水，使榛仁肽的质量浓度为5％，用0.5mol/L NaOH调pH值7.9，109℃油浴3.5h，反应结束后立即冷却至室温，-41℃冷冻干燥24h得到风味和功能性良好的高抗氧化榛仁肽，4℃保存。
实施例2：
(1)核桃肽制备
参考文献“Exploration of the molecular interactions betweenangiotensin-I-converting enzyme(ACE)and the inhibitory peptides derived fromhazelnut(Corylus heterophylla Fisch.)，Chunlei Liu，Wei-hong Min”所述工艺条件制备核桃肽，冷冻干燥后于4℃保存；
(2)核桃肽修饰
取30g冷冻干燥后的核桃肽，用蒸馏水配成核桃肽质量浓度为30％的溶液，用0.5mol/L NaOH调pH值8.4，然后加入核桃肽质量1.5％的碱性蛋白酶(Alcalase 2.4L)，于45℃水浴中反应5h，反应结束后迅速于90℃下加热15min使酶灭活；再加入50g的果糖和500mL蒸馏水，使核桃肽的质量浓度为5％，用0.5mol/L NaOH调pH值7.9，109℃油浴3.5h，反应结束后立即冷却至室温，-41℃冷冻干燥24h得到风味和功能性良好的高抗氧化核桃肽，4℃保存。
以上所述仅是本发明的优先实施方式，应当指出，在不脱离本发明原理的前提下，2种修饰方法的排列组合方式及对肽做出的若干改进和修饰，也应视为本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其特征在于：称取冷冻干燥后的活性肽加入蒸馏水，使活性肽质量浓度为10％～40％，用0.5mol/L NaOH调pH值6～10，加入活性肽质量0.1％～5％的蛋白酶，于25～50℃水浴中反应3～7h，反应结束后迅速于85～95℃加热10～20min使酶灭活，再加入活性肽质量30％～300％的单糖，然后加入蒸馏水调节活性肽质量浓度至2％～20％；用0.5mol/L NaOH调pH值6～9，90～140℃油浴1～4h，反应结束后立即冷却至室温，冷冻干燥后得到风味和功能性良好的高抗氧化活性肽，4℃保存。
2.如权利要求1所述的一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其特征在于：活性肽为榛仁肽、紫苏肽、花生肽、大豆肽或核桃肽中的一种。
3.如权利要求1所述的一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其特征在于：蛋白酶为风味蛋白酶、胃蛋白酶、碱性蛋白酶、中性酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶中的一种。
4.如权利要求1所述的一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其特征在于：单糖为木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、赤藓糖、苏力糖、来苏糖或果糖中的一种。
5.如权利要求1所述的一种改善活性肽风味和功能性的修饰方法，其特征在于：冷冻干燥的温度为-50～-30℃，冷却干燥的时间为20～30h。
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