CN103288918A

CN103288918A - 具有肾素和ace双重抑制活性的小肽及应用

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Publication number: CN103288918A
Application number: CN2013102527128A
Authority: CN
Inventors: 鞠兴荣; 何荣; 袁建; 王立峰; 汪海峰; 都立辉; 高瑀珑; 唐培安; 周建新; 陈银基; 郑毅; 石嘉怿
Original assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Current assignee: Nanjing University of Finance and Economics
Priority date: 2013-06-24
Filing date: 2013-06-24
Publication date: 2013-09-11
Anticipated expiration: 2033-06-24
Also published as: CN103288918B

Abstract

本发明提供具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽及应用，属于生物技术领域。所述小肽，氨基酸序列为Leu-Tyr。该小肽的制备方法为：将菜籽粕粉碎，分散于蒸馏水中，用碱液调节pH为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌，离心后取上清液为菜籽蛋白粗提液；调节所述菜籽粗提液的pH为4-5，静置后离心取沉淀，即得菜籽蛋白粗提物；将所述菜籽蛋白粗提物用蛋白酶Alcalase水解，得到菜籽蛋白水解物；将菜籽蛋白水解物采用高效液相色谱分离，得到所述小肽。本发明提供的小肽，具有较好的肾素和ACE双重抑制活性，较好的降血压效果，可作为药物使用，或者作用降血压营养添加剂用于与降血压相关的功能食品和保健品的开发。

Description

具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽及应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽、其制备方法及应用。

背景技术

肾素-血管紧张素系统（RAS）对机体血压和体液平衡的调节具有重要作用，RAS系统失衡会导致机体血压升高，进而导致相关慢性疾病如心脑血管疾病、慢性肾病和糖尿病等发病率的升高。抑制RAS系统中的2个关键水解酶肾素和血管紧张素转化酶-

（ACE），能够有效阻断RAS系统。另一方面，临床研究发现，长期使用ACE抑制剂例如卡托普利（Captopril）还会导致血管紧张素-

（Ang-I）的堆积，激活旁路途径，将大量Ang-I重新转化成血管紧张素-Ⅱ（Ang-Ⅱ），发生‘Ang-Ⅱ逃逸’的现象，严重影响高血压病的治疗。近年来，新研制的肾素抑制剂阿利吉仑在临床应用中表现出了较好的降血压效果和对相关机体组织的保护作用，然而也存在头晕、头痛等不良反应。鉴于单独使用ACE抑制剂和肾素抑制剂中存在的问题，研究人员尝试联合使用不同功能的抑制剂，发现联合肾素抑制剂和ACE抑制剂，不仅可以降低机体血压，还有助于减少

-型糖尿病患者肾功能的损伤。但是，现有技术中缺少同时具有肾素和ACE双重抑制活性的物质。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽。

本发明的另一目的是提供具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽的制备方法，该方法简单，由于原料来源于菜籽粕，所以对人体安全。

本发明的目的采用如下技术方案实现：

一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽，氨基酸序列为Leu-Tyr。

一种上述小肽的制备方法，

（1）将菜籽粕粉碎，分散于蒸馏水中，用碱液调节pH值为10.5-11.5，并维持pH值不变，搅拌1-2 h，离心后分离上清液和沉淀，所述上清液为菜籽蛋白粗提液，所述沉淀为残渣；调节所述菜籽蛋白粗提液的pH为4-5，静置后离心取沉淀，即得菜籽蛋白粗提物；

（2）将所述菜籽蛋白粗提物用蛋白酶 Alcalase水解，得到菜籽蛋白水解物；

（3）将所述菜籽蛋白水解物采用高效液相色谱分离，得到所述小肽。

将步骤（1）中所述菜籽粕分散于蒸馏水中，用碱液调节pH 为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌，离心后取上清液，所述上清液为菜籽蛋白粗提液。

步骤（2）所述水解的具体方法为：将菜籽蛋白粗提物冷冻干燥后溶于水，调节pH为7.5-8.5，加入蛋白酶Alcalase，在45-55℃条件下进行水解反应。

步骤（3）的具体方法为：将所述菜籽蛋白水解物依次采用Jupiter C12 色谱柱和Vydac C18色谱柱进行分离，得到所述小肽。

将所述菜籽蛋白水解物采用Jupiter C12 色谱柱分离的具体方法为：

将菜籽蛋白水解物上样于Jupiter C12 色谱柱，用流动相A和B进行洗脱，洗脱程序：0～35 min，流动相B 5～80%线性升高，流动相A 95～20%线性降低，收集对应于流动相B体积浓度为60-70%时的洗脱液F5；

将洗脱液F5再次采用Jupiter C12 色谱柱分离，用流动相A和B进行洗脱，洗脱程序为： 0～40 min，流动相A 35～30%线性降低，流动相B 65～70%线性升高，收集对应于流动相B体积浓度为67-68%时的洗脱液F5-F；

所述流动相A：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的水溶液；所述流动相B：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的甲醇溶液。

将所述洗脱液F5-F采用Vydac C18色谱柱进行分离的具体方法为：采用流动相A和B进行洗脱，收集对应于流动相B体积浓度为16.5-18.0%时的洗脱液，即得所述小肽；所述流动相A：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的水溶液；所述流动相B：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的甲醇溶液；所述洗脱程序：0～60 min，流动相A 95～70%线性降低，流动相B 5-30%线性升高。

一种所述具有肾素和ACE抑制活性的小肽在制备降血压药物或具有降血压功能的食品中的应用。

一种降血压药物组合物，含有氨基酸序列为Leu-Tyr的小肽。

一种具有降血压功能的食品，含有氨基酸序列为Leu-Tyr的小肽。

有益效果：

本发明提供的小肽，具有较好的肾素和ACE双重抑制活性，较好的降血压效果，反应出较好的体内、体外活性的一致性。其原因可能是，本发明提供的小肽抑制了RAS系统中的2个关键酶肾素和ACE的活性。该小肽可作为药物使用，或者作用降血压营养添加剂用于与降血压相关的功能食品和保健品的开发

本发明小肽的制备方法简单，由于原料来源于菜籽粕，所以对人体安全。

附图说明

图1 第一次RP-HPLC分离菜籽蛋白水解物色谱图，其中F1-F10分别表示不同洗脱时间的洗脱液。

图2 菜籽蛋白水解物经第一次RP-HPLC分离得到的各洗脱液的得率、ACE和肾素抑制活性，其中得率是指各洗脱液中活性成分占菜籽蛋白水解物的重量百分比。

图3 第二次RP-HPLC色谱图，其中A、B、C、D、E、F和G分别表示洗脱液F5-A、F5- B、F5-C、F5-D、F5-E、F5-F、F5-G。

图4 第二次RP-HPLC分离得到的各洗脱液中活性成分的ACE和肾素抑制活性。

图5 第三次RP-HPLC色谱图, 其中Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ和Ⅴ分别表示洗脱液F5-F-Ⅰ、F5-F-Ⅱ、 F5-F-Ⅲ、 F5-F-Ⅳ和F5-F-Ⅴ。

图6 第三次RP-HPLC分离得到各洗脱液中活性成分的ACE和肾素抑制活性。

图7 洗脱液F5-F-III中一种活性成分的二级质谱图。

图8 小肽LY对自发性高血压大鼠的降血压活性，其中saline表示对照组,captopril表示卡托普利灌胃组、LY表示小肽LY灌胃组。

具体实施方式

1.材料：菜籽粕（Brassica napus），东海粮油工业有限公司；牛血清白蛋白，Alcalase 2.4 L、管紧张素转化酶（ACE）、N-[(2S,3R)-3-氨基-2-羟基-4-苯丁酰]-L-亮氨酸（FAPGG），Sigma公司；肾素活性测定试剂盒，美国Cayman chemical公司。Jupiter Proteo C12 色谱柱（制备型色谱柱）（250 × 21.10 mm, 5 μm），美国 Phenomenex；Vydac C18柱（C18蛋白和多肽分析柱，4.6 × 250 mm, 5 μm），美国VYDAC；Eclipse Plus C18 RRHD 色谱柱（2.1 x 100 mm, 1.8 μm）美国 ZORBAX；96-孔板和其他所用化学试剂，美国Fisher公司。

2.主要仪器与设备：RET磁力搅拌器，德国IKA公司；FE20K pH 酸度计，llegra64R高速冷冻离心机，美国贝克曼库尔特；瑞士梅特勒-托利多；荧光酶标仪，美国 Spectra MAX Gemini；FP-6300 荧光分光光度计，日本JASCO；Cary 4000 紫外可见光分光光度计，美国瓦里安；IITC RMA 253动物血压计，美国 ?Life Science (IITC)；Varian 940半制备高效液相色谱系统美国安捷伦。ACQUITY超高效液相色谱，美国Waters；Micromass四级杆质谱，美国Waters。

3.ACE抑制活性检测方法如下:在比色杯中加入1 mL 0.5 mM FAPGG (溶解在含 0.3 M NaCl、浓度为 50 mM 的Tris-HCl 缓冲液，pH 7.5) ，20 μL ACE (1U/mL, 最终活力 20 mU) ，200 μL样品（蛋白质浓度为1mg/mL，溶剂为50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.3 M NaCl, pH 7.5），混匀；室温下（18-25 ℃），2 min内测定345 nm下吸光值的降低速率。空白以 Tris–HCl 缓冲液代替样品。根据以下公式计算ACE抑制活性：

ACE抑制率（%）=1-[ΔA·min^-1(样品)/ ΔA·min^-1(空白)]×100%,

其中，ΔA·min^-1(样品)和ΔA·min^-1(空白)分别是表示样品和空白的ACE活性变化速率。

菜籽肽LY对ACE的IC₅₀（抑制50% ACE活性时的样品浓度）测定：分别测试样品（菜籽肽LY）中蛋白浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5 mg/mL时对ACE抑制活性，采用非线性回归计算其IC₅₀值。

4.肾素抑制活性的检测方法如下:样品抑制肾素活性的体外测定根据肾素活性试剂盒(购买于Cayman Chemical，编号10006270)提供方法，按以下步骤测定：96-孔板中依次加入(1) 空白孔：20 μL 底物, 160 μL 测试用缓冲液, 10 μL 纯水；（2）空白对照孔：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 和10 μL 纯水；(3)样品孔：20 μL 底物, 150 μL 测试用缓冲液, 10 μL蛋白浓度已经调整至1mg/mL的样品。之后分别在每个孔（除空白孔外）中加入10 μL肾素启动反应。96-孔板室温下震荡10 s ，在37 ^oC下预热15 min ，在10min内测定样品的荧光强度，激发波长340nm, 发射波长490nm，根据以下公式计算样品的肾素抑制活性：肾素抑制率（%）=1-[ΔFI·min^-1(样品孔)/ΔFI·min^-1(空白对照孔)]×100% ，其中，ΔFI·min^-1(样品孔)和ΔFI·min^-1(空白对照孔) 分别是表示样品孔和空白对照孔的肾素活性变化速率。

测试用缓冲液：50 mM Tris-HCl 缓冲液，含 0.1 M NaCl，pH 8.0 。

菜籽肽LY对肾素的IC₅₀（抑制50%肾素活性时的样品浓度）测定：分别测试样品（菜籽肽LY）中蛋白浓度为0.0625、0.125、0.25、0.5，1.0 mg/mL时对肾素的抑制活性，采用非线性回归计算其IC₅₀值。

实施例1 小肽的制备

1. 菜籽蛋白Alcalase水解物的制备

采用碱溶酸沉方法制备菜籽蛋白：将菜籽粕粉碎、过80目筛，分散于10倍重量的蒸馏水中，用1M NaOH 调节pH 为11.0，并维持pH不变，室温搅拌2 h 后，8000 g 力离心分离上清液和沉淀，收集上清液为菜籽蛋白粗提液，沉淀为残渣；在所述残渣中加入其重量5倍的蒸馏水，用1M NaOH 调节pH 为11.0，并维持pH不变，室温搅拌2 h 后，8000 g 力离心分离上清液和沉淀，收集上清为菜籽蛋白粗提液。合并上述菜籽蛋白粗提液，用1M HCl 调节pH至4.5，静置2 h后离心，取沉淀得到菜籽蛋白粗提物。在菜籽蛋白粗提物中加入少量蒸馏水，搅匀，调节pH 为7.0后，冷冻干燥，得到菜籽蛋白粗品（蛋白质含量为85.2%）。

将菜籽蛋白粗品溶解于蒸馏水中，调节蛋白浓度至50g/L，pH 8.0，温度50℃，搅拌1 h后，加入菜籽蛋白粗品中蛋白质重量4%的蛋白酶 Alcalase水解4 h，水解过程中通过滴加1 mol/L的NaOH 保持反应溶液的pH为8.0。水解反应结束后，将水解物加热至90℃保温10min灭活蛋白酶 Alcalase，冰水浴快速冷却后以8000×g力离心1 h，上清液冷冻干燥得到菜籽蛋白水解物。

2. 小肽的分离和纯化

主要采用反相高效液相色谱法（RP-HPLC）分离纯化菜籽降血压肽。

将菜籽蛋白水解物溶解于0.1%（质量百分浓度）三氟乙酸（缩写为TFA）的去离子水溶液中，调节其蛋白浓度为10 mg/mL。应用Varian 940半制备高效液相色谱系统对菜籽蛋白水解物进行第一次反相高效液相色谱分离。分离条件为：色谱柱Jupiter C12 制备型色谱柱；流动相A：质量百分浓度为0.1%TFA的去离子水溶液，B为质量百分浓度为0.1% TFA的甲醇溶液；洗脱程序：0～35 min，流动相B 5～80%线性升高，流动相A 95～20%线性降低；检测波长215 nm；进样体积 5 mL；流速10 mL/min。第一次反相高效液相色谱分离后，收集10份含有不同疏水性活性成分的洗脱液（F1-10），当流动相B体积浓度为60-70%时收集到了洗脱液F5，具体结果见图1。冷冻干燥各洗脱液后分析其活性成分的ACE和肾素抑制活性，结果如图2所示。从图2可以看出，洗脱液F5中活性成分具有较高的肾素和ACE双重抑制活性。

利用色谱柱Jupiter C12对洗脱液F5中的活性成分进行第二次反相高效液相色谱分离。分离条件为：样品中蛋白浓度5 mg/mL，进样体积1 mL；流速5 mL/min；洗脱程序：0～40 min，流动相A 35～30%线性降低，流动相B 65～70%线性升高；流动相A：质量百分浓度为0.1%TFA的去离子水溶液，B为质量百分浓度为0.1% TFA的甲醇溶液。二次分离后，收集到7份含有不同疏水性组分的洗脱液。当流动相B体积浓度为67.2-67.8%时收集到洗脱液F5-F，具体结果如图3所示。冷冻干燥后分析这7份洗脱液中活性成分的ACE和肾素抑制活性，结果如图4。从图4看出，洗脱液F5-F中的活性成分具有较高的ACE和肾素双重抑制活性。

采用VYDAC C18分析柱对洗脱液F5-F中活性成分进行第三次反相高效液相色谱分离。分离条件为：样品中蛋白浓度 0.5 mL/min；进样体积 0.1 mL；洗脱程序：0～60 min，流动相A 95～70%线性降低，流动相B 5-30%线性升高；流动相A：质量百分浓度为0.1%TFA的去离子水溶液，B为质量百分浓度为0.1% TFA的甲醇溶液。收集5份含有不同疏水性活性成分的洗脱液，当流动相B体积浓度为16.5-18.0%时收集到了洗脱液F5-F-III，具体结果如图5所示。冷冻干燥各洗脱液后分析其活性成分的ACE和肾素抑制活性，具体结果见图6。可以发现，洗脱液F5-F-III中活性成分同时具有较高的ACE和肾素双重抑制活性。将洗脱液F5-F-III的冻干粉溶解，调整其蛋白浓度为0.15mg/mL，检测到其ACE抑制活性为70.05 ± 0.71%；将洗脱液F5-F-III的冻干粉溶解，调整其蛋白浓度为0.05 mg/mL，检测到其肾素抑制活性为44.50 ± 1.60%。

3 菜籽降血压肽的结构鉴定

对洗脱液F5-F-III中活性成分进行结构鉴定。

采用超高效液相色谱-质谱（UPLC-MS）分离和鉴定洗脱液F5-F-III中活性成分。进样前，将洗脱液F5-F-III的冻干粉溶解于去离子水（含0.1% TFA）中。色谱分离条件：色谱仪ACQUITY UPLC system，色谱柱Eclipse Plus C18 RRHD，进样体积为10 μL，流速为0.2 mL/min；洗脱程序：0～6 min，含0.1% TFA的乙腈0-30%的线性升高，含0.1% TFA的去离子水100-70%线性降低。质谱条件：质谱仪Quadrupole Mass Spectrometer，ESI源，碰撞能量35 V，毛细管电压1.5 kV，锥孔电压40 V，毛细管温度150 ^oC。

采用UPLC-MS联用仪鉴定洗脱液F5-F-III活性成分的氨基酸序列。y-型和b-型离子是多肽在低能量碰撞下产生的最常见离子。洗脱液F5-F-III活性成分经过UPLC用C18柱分离后，在一级质谱图中产生2个单电子离子色谱峰267.3 m/z和295.3 m/z（图略），说明其中含有2个小肽，其中一个小肽的二级质谱图如图7所示。母离子295.3 m/z可以判定为Leu-Tyr (LY)或者 Ile-Tyr (IY)。因为在其子离子质谱图中有一个y-型碎片离子182.4 m/z (Y) 和一个 b-型碎片离子86.3 m/z (L或者I)。为了进一步确认所鉴定氨基酸序列，在蛋白质数据库UniProt中比对菜籽蛋白Cruciferin, Napin 和 Lipid-transfer protein，发现所鉴定的氨基酸序列与 Cruciferin (P33525)有较好的匹配， LY (f85?86, f391?392)。所以，之前鉴定的小肽L/IY应为LY。分析一级质谱图，发现洗脱液F5-F-III冻干粉中，小肽LY的质量分数为85%。

实施例2采用固相化学合成法制备小肽LY

采用固相化学合成法制备小肽LY。

应用自动化多肽合成仪(Model CS 136, CS Bio Co. San Carlos, CA, USA) 合成小肽LY。将作为C-端氨基酸Tyr的保护树脂Fmoc-Tyr (t-Bu)-Wang resin（sigma）进行脱保护后，洗涤，然后再加入N端氨基酸Fmoc-Leu (t-Bu)-OH（购自sigma）进行缩合。以三氟乙酸/三异丙基硅烷水溶液切割合成的多肽LY，整个反应过程都在自动化多肽合成仪中完成。反应结束后，取出反应液，旋转蒸发后加冰乙醚沉淀，离心，并用乙醚洗涤，抽尽乙醚后加水溶解,冷冻干燥即得小肽。该小肽经质谱和高效液相验证为LY。

实施例3小肽LY的活性研究

采用实施例2中制备的小肽LY进行活性研究。

小肽LY具有很高的ACE抑制活性，其IC₅₀值为0.107 ± 0.008 mM。同时，LY具有较高的肾素抑制活性，其IC₅₀值为1.868 ± 0.055 mM。

通过单剂量灌胃自发性高血压大鼠（SHRs），探讨了小肽LY的体内降血压活性。具体方法为：将体重（bw）270-320 g雄性自发性高血压大鼠（SHR），随机分为3组，每组6只，分别灌胃1 mL PBS 缓冲液（对照组）、卡托普利（3 mg/kg bw）、小肽LY（30 mg/kg bw）其中卡托普利和小肽LY溶于PBS缓冲液。采用夹尾法测量SHRs的血管收缩压（SBP），计算灌胃后 2、4、6、8、24h SHRs的SBP该变量（灌胃后的收缩压减去灌胃前收缩压），见图8所示。

从图8可以看出，与空白对照相比，小肽LY在30 mg/kg bw 的剂量下灌胃后，明显降低了SHRs的收缩压。小肽LY在灌胃2 h后，降低 SHRs最大血压为26.73 ± 4.24 mmHg。跟商业化降血压药物卡托普利（Captopril）相比，小肽LY的降血压效果可以认为是急性效果，因为灌胃3 mg/kg bw 剂量的Captopril 6 h后，观察到了其最大的降血压效果为23.43 ± 6.56 mmHg，并且24 h后，仍保持较高的降血压效果（11.28 ± 5.76 mmHg）。令人满意的是，小肽LY在灌胃后，至少在8 h内，保持了较好的降血压效果（p < 0.05）。小肽LY的体内降血压效果与体外ACE和肾素的抑制活性也比较一致。本发明的结果充分说明了小肽LY具有较高的ACE和肾素双重抑制活性，同时具有较好的降血压效果，可以用于降血压药物和降血压功能食品的开发。

Claims

1.一种具有肾素和ACE双重抑制活性的小肽，氨基酸序列为Leu-Tyr。

2.一种权利要求1所述小肽的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

（1）将菜籽粕粉碎，分散于蒸馏水中，用碱液调节pH 为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌1-2 h，离心后分离上清液和沉淀，所述上清液为菜籽蛋白粗提液，所述沉淀为残渣；调节所述菜籽蛋白粗提液的pH为4-5，静置后离心取沉淀，即得菜籽蛋白粗提物；

3.根据权利要求2所述小肽的制备方法，其特征在于：将步骤（1）中所述残渣分散于蒸馏水中，用碱液调节pH 为10.5-11.5，并维持pH不变，搅拌，离心后取上清液，所述上清液为菜籽蛋白粗提液。

4.根据权利要求3所述小肽的制备方法，其特征在于：步骤（2）所述水解的具体方法为：将菜籽蛋白粗提物冷冻干燥后溶于水，调节pH为7.5-8.5，加入蛋白酶Alcalase，在45-55℃条件下进行水解反应。

5.根据权利要求4所述小肽的制备方法，其特征在于：步骤（3）的具体方法为：将所述菜籽蛋白水解物依次采用Jupiter C12 色谱柱和Vydac C18色谱柱进行分离，得到所述小肽。

6.根据权利要求5所述小肽的制备方法，其特征在于：将所述菜籽蛋白水解物采用Jupiter C12 色谱柱分离的具体方法为：

7.根据权利要求4所述小肽的制备方法，其特征在于：将所述洗脱液F5-F采用Vydac C18色谱柱进行分离的具体方法为：采用流动相A和B进行洗脱，收集对应于流动相B体积浓度为16.5-18.0%时的洗脱液，即得所述小肽；所述流动相A：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的水溶液；所述流动相B：质量百分浓度为0.05-0.2%三氟乙酸的甲醇溶液；所述洗脱程序：0～60 min，流动相A 95～70%线性降低，流动相B 5-30%线性升高。

8.一种权利要求1所述具有肾素和ACE抑制活性的小肽在制备降血压药物或具有降血压功能的食品中的应用。

9.一种降血压药物组合物，其特征在于含有氨基酸序列为Leu-Tyr的小肽。

10.一种具有降血压功能的食品，其特征在于含有氨基酸序列为Leu-Tyr的小肽。