CN107712065A - 一种中老年配方肽奶粉及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种中老年配方肽奶粉，属于营养工程和食品科学领域。本发明的配方奶粉含有以下重量份的原料：乳粉50‑85份，生物活性肽5‑30份，益生元2‑15份。本发明奶粉中蛋白、多肽、低聚肽形成梯度吸收，能够调节身体机能促进人体吸收奶粉中的营养物质，与添加的益生元相配合，综合改善身体状况。

Description

一种中老年配方肽奶粉及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种配方奶粉，特别是涉及一种中老年配方肽奶粉及其制备方法。

背景技术

奶粉不是婴儿的专利，中老年人都是需要喝奶粉的，喝奶粉可以补充身体内的营养元素，还能增加身体的健康度。牛奶及其乳制品中含有较多的的矿物质，是属于人们身体上的钙物质最佳来源，钙磷比例比较适当，利于钙物质的吸收，并且牛奶及其乳制品中含有了大量的磷脂、蛋白质、脂肪、乳糖、无机盐等，但牛奶及其乳制品中的蛋白质很大一部分是大分子蛋白质，不容易被身体吸收和利用。

传统观念认为蛋白质组成人体结构，参与到所有生命活动的过程中，是细胞的核心营养素。随着现代营养学研究的不断深入，越来越多的既成理论被重新修订，氨基酸曾经被认为是人体对蛋白质类食物吸收的最小单位，然而近年的研究发现，蛋白质消化分解后只有1/3是以氨基酸的形式吸收的，其余2/3以含2-3个氨基酸的低聚肽被吸收，且其吸收效率较单个氨基酸更高，所以肽是一种比蛋白质更小，比氨基酸更有效的营养补充方式。

中老年人由于身体机能的弱化，必须强化营养物质的补充，其中供给中老年的蛋白质必须易于消化吸收，同时应降低脂肪含量，增加维生素、膳食纤维和矿物质的比例。目前市场上存在营养强化型奶粉、大分子整蛋白型蛋白粉，属于大分子物质，吸收利用率根据人群健康状态不同，可能只有20-80％的吸收率，人体不仅无法获得足够易吸收的蛋白质，还可能造成额外的身体负担。市场上也存在一些肽产品，但只能补充后短暂产生吸收峰值，无法长时间稳定提供营养。大多数中老年配方奶粉只关注营养搭配平衡，未见有报道在满足提高营养吸收能力的同时，兼顾养生保健、治疗疾病功效的中老年配方奶粉。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种具有养生保健功能且易被身体吸收利用的中老年配方奶粉。

本发明的中老年配方肽奶粉，含有以下重量份的原料：乳粉50-85份，生物活性肽5-30份，益生元2-15份。

进一步地，本发明的中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉38-55份，全脂乳粉12-28份，生物活性肽10-26份，益生元5-12份。

所述生物活性肽粉为海洋鱼皮胶原低聚肽粉、水解小麦蛋白肽粉、酶解酪蛋白中的一种或多种；其中，上述生物活性肽粉组合应用，肽段分布量5000-10000D占所有肽段的5-30％；1000-5000D占所有肽段的15-50％；1000D以下的肽段占20-70％。本发明涉及的生物活性肽其分子量分布情况见表1-表3以及图13-图15。

表1海洋鱼皮胶原低聚肽GPC分子量分布计算结果：

表2水解小麦蛋白肽粉GPC分子量分布计算结果

表3酶解酪蛋白GPC分子量分布计算结果

本发明所用的海洋鱼皮胶原低聚肽、酶解酪蛋白、水解小麦蛋白肽是活性肽成分，具有生理活性功能。海洋鱼皮胶原肽含多肽-铬螯合物，具有激活免疫系统、促进皮肤细胞生长、调节血糖的功效；海洋胶原肽中含有大量的亲水基团(-COOH，-OH，-NH2等)，能够增加皮肤角质层的水合作用，还能够能够增加超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶的活性，降低脂质过氧化物-丙二醛的水平。酶解酪蛋白含有阿片肽，能调节神经系统、辅助降血压、促进心血管健康；水解小麦蛋白肽含有谷氨酰胺，促进免疫细胞生长、缓解体力疲劳、保护胃肠粘膜。它们能明显促进小肠绒毛生长、增加肠道褶皱，改善肠道在配方促进肠道菌粘附能力等方面起主要作用。

所述益生元为菊粉或水苏糖。

进一步地，本发明的还含有燕麦粉、红茶粉、麦精、罗汉果粉；

所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-55份，全脂乳粉22-28份，水解小麦蛋白肽粉2-16份，酶解酪蛋白3-14份，菊粉1-8份、水苏糖1-8份，燕麦粉1-3份，红茶粉0.6-1.6份，麦精0.5-1.8份，罗汉果粉0.01-0.02份。

优选地，本发明上述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉48-52份，全脂乳粉22-25份，水解小麦蛋白肽粉5-12份，酶解酪蛋白4-10份，菊粉3-6份、水苏糖2-6份，燕麦粉1-2份，红茶粉0.8-1.3份，麦精0.6-1.4份，罗汉果粉0.01-0.02份。

本发明提供了上述中老年配方肽奶粉在促进肠道菌粘附能力或改善肠道菌群平衡中的应用。

另一方面，本发明的中老年配方肽奶粉还含有赤藓糖醇、人参粉、山楂粉、牛磺酸；具体地，所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉40-55份，全脂乳粉16-28份，水解小麦蛋白肽粉7-16份，酶解酪蛋白3-10份，菊粉2-7份，水苏糖1-8份，赤藓糖醇1-9份、人参粉0.2-1.0份、山楂粉0.02-0.1份、牛磺酸0.1-0.3份。

优选地，上述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-52份，全脂乳粉20-28份，水解小麦蛋白肽粉9-14份，酶解酪蛋白3-8份，菊粉2-5份，水苏糖2-6份，赤藓糖醇2-8份、人参粉0.3-0.8份、山楂粉0.04-0.1份、牛磺酸0.1-0.2份。

本发明提供了上述中老年配方奶粉在治疗或预防动脉粥样硬化中的应用。

再一方面，本发明提供的中老年配方肽奶粉中含有的益生元为菊粉，该配方肽奶粉中还含有燕麦粉、牛磺酸、绿茶粉、南瓜粉、苦瓜粉；具体地，所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-50份，全脂乳粉20-28份，海洋鱼皮胶原低聚肽粉8-25份，酶解酪蛋白2-15份，菊粉3-8份，燕麦粉2-7份，绿茶粉1-5份，南瓜粉1-6份，苦瓜粉0.05-0.5份，牛磺酸0.05-0.4份。

优选地，本发明提供的上述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-48份，全脂乳粉25-28份，海洋鱼皮胶原低聚肽粉10-20份，酶解酪蛋白2-10份，菊粉3-6份，燕麦粉2-6份，绿茶粉1-4份，南瓜粉1-4份，苦瓜粉0.1-0.3份，牛磺酸0.1-0.3份。

本发明提供了上述中老年配方奶粉在调节血糖或治疗糖尿病中的应用。

本发明提供了上述中老年配方肽奶粉在制备中老年保健品中的应用。

本发明提供了上述配方奶粉的制备方法，包括以下步骤：

(1)按照上述的配方奶粉中的原料分别称量，过筛；

(2)投料、预混；

(3)批量混合，真空充氮包装。

本发明的中老年配方奶粉在一系列营养学分析、食品理化分析、医学分析的基础上构建，并通过细胞学分析结果修正，建立合适的蛋白肽、奶粉、动植物精华功效成份最佳组合，具有以下有益效果：

1、本发明配方奶粉成分主要来自天然动植物，不添加防腐剂，也不添加人工色素，安全无风险。

2、本发明配方奶粉以基础营养+活性调节，共同作用，不仅在特别功能方面表现价值，还能通过合理营养搭配调节细胞营养，长期促进人体细胞的自我修复能力。肽从内部改善肠道结构，益生元从外部改善肠道环境，双向调节，发挥协同作用。

3、利用整蛋白、多肽、低聚肽的梯度吸收原理，构建合理蛋白吸收方案。在常规奶粉基础上，添加不同来源肽成分和动植物精华，本发明配方肽奶粉中，生物活性肽片段的分子量呈阶梯分布，有利于提高机体的蛋白吸收效率，帮助人体建立蛋白质等营养素的梯度吸收平衡，不增加胃肠负担，激活人体营养吸收系统，保持健康状态。

4、生物活性肽不仅直接提供蛋白质营养，改善修复中老年自身的细胞营养和消化吸收能力，还能调节神经系统各心血管健康，促进免疫细胞生长、缓解体力疲劳、保护胃肠粘膜等，综合提高中老年人的细胞营养和健康状态。

5、菊粉，水苏糖，赤藓糖醇，荷叶粉均来自天然植物精华，可以促进肠道蠕动，改善肠道环境，有益于消化吸收，有助于保持胃肠道健康活力，改善风味，提高适口性，调节营养代谢平衡。

6、本发明的配方奶粉在保证中老年所需的各种营养成分之外，添加食源性生物活性肽，配合维生素和各种微量元素，能够改善2型糖尿病的胰岛素抵抗现象；且具有促进肠道菌粘附，抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞的增殖，极显著的促进细胞NO的释放，较好的预防动脉粥样硬化。本发明的配方奶粉是一款在促进机体营养吸收能力的同时，兼顾养生保健、治疗疾病的中老年配方奶粉。

附图说明

图1为不同浓度胰岛素不同作用时间对HepG-2葡萄糖消耗量的影响。ΔG/OD细胞培养上清液葡萄糖含量；*P<0.05，**P<0.01，与空白组比较。

图2为不同浓度胰岛素诱导24h对HepG-2增殖的影响，*P<0.05；**P<0.01，与空白组比较。

图3为本发明实施例1制得的不同浓度奶粉对HepG-2增殖的影响。

图4为本发明实施例1制得的不同浓度奶粉对HepG-2胰岛素抵抗模型葡萄糖消耗量的影响，*P<0.05，与模型组比较。

图5为本发明实施例3制得的奶粉对Caco-2细胞增殖能力的影响。

图6为本发明实施例3制得的奶粉对Caco-2细胞粘附唾液乳杆菌数量的影响。**P<0.01，与对照组比较。

图7为本发明实施例3制得的奶粉对唾液乳杆菌粘附的影响，图7A为对照组，图7B为试验组，粘附的肠道菌如图中箭头所指。

图8为不同浓度ox-LDL对平滑肌细胞增殖的影响，**P<0.01，与空白组比较。

图9为不同浓度ox-LDL对平滑肌细胞上清NO释放量的影响，**P<0.01，与空白组比较。

图10为本发明实施例5制得的奶粉对ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖的影响。

图11为本发明实施例5制得的奶粉对ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖的影响，**P<0.01，与模型组比较。

图12为本发明实施例5制得的奶粉对ox-LDL诱导的平滑肌细胞NO释放量的影响，**P<0.01，与模型组比较。

图13为本发明使用的海洋鱼皮胶原低聚肽的PDA检测色谱图(220nm)。

图14为本发明使用的水解小麦蛋白肽粉的PDA检测色谱图(220nm)。

图15为本发明使用的酶解酪蛋白的PDA检测色谱图(220nm)。

具体实施方式

以下实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，实施例中所用的原料均为市售。DMEM培养基：Hyclone公司；胎牛血清(FBS)：四季青公司；胰蛋白酶和缓冲液PBS：碧云天生物技术研究所；葡萄糖测定试剂盒：上海荣盛生物药业有限公司；HepG-2细胞株和Caco-2细胞株：中国医学科学院肿瘤医院；胰岛素、MTT：Sigma公司；DMSO：西陇化工股份有限公司。Spectra MR多功能酶标仪：美国Dynex公司；ESCO AC2-6S1生物安全柜：新加坡艺思高科技有限公司；240i直热式二氧化碳培养箱：美国Thermofisher公司；BD C6流式细胞仪。唾液乳杆菌：CICC。兔主动脉平滑肌细胞CCC-SMS-1细胞株：中国协和医科大学细胞中心；氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)：yiyuan biotech公司。Spectra MR多功能酶标仪：美国Dynex公司；ESCO AC2-6S1生物安全柜：新加坡艺思高科技有限公司。

本发明实施例中，奶粉中蛋白质含量的测定，采用凯氏定氮法。奶粉中水分含量的测定，采用常压干燥法测定。

本发明采用SPSS16.0统计软件对数据进行处理，试验结果以均值±标准偏差(Mean±SD)表示。采用组间t检验，P<0.05具有显著性差异，P<0.01具有极显著性差异。

实施例1本发明配方奶粉的制备(1)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉48g，全脂乳粉25g，海洋鱼皮胶原低聚肽粉12g，酶解酪蛋白4g，菊粉3.58g，燕麦粉3g，绿茶粉2g，南瓜粉2g，苦瓜粉0.3g，牛磺酸0.12g。

实施例2本发明配方奶粉的制备(2)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉45g，全脂乳粉28g，海洋鱼皮胶原低聚肽粉18g，酶解酪蛋白6g，菊粉4.50g，燕麦粉4g，绿茶粉1g，南瓜粉3.82g，苦瓜粉0.2g，牛磺酸0.18g。

实施例3本发明配方奶粉的制备(3)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉48g，全脂乳粉25g，海洋鱼皮胶原低聚肽粉16g，酶解酪蛋白8g，菊粉5.08g，燕麦粉6g，绿茶粉3.6g，南瓜粉1.50g，苦瓜粉0.1g，牛磺酸0.23g。

实施例4本发明配方奶粉改善人肝癌细胞HepG-2胰岛素抵抗的效果

1、方法

1.1HepG-2细胞的培养

用含灭活的体积分数10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养HepG-2细胞，待细胞长满培养瓶瓶底后，先用PBS缓冲液洗2次，再加0.25％胰酶消化约两分钟至细胞开始脱落，加入DMEM完全培养基终止反应，将细胞吹打成细胞悬液，按1:3进行传代。

1.2胰岛素抵抗模型的建立

模型建立参考文献[刘志霞,韩淑英,李继安.人肝癌细胞胰岛素抵抗模型建立及有效中药成分的筛选.中国组织工程研究与临床康复,2011,15(28):5241～5244]并稍作调整。将HepG-2细胞按10⁵个/mL接种于96孔板中，100μL/孔，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，弃上清，用PBS缓冲液洗2次，再加新鲜配制的含10^-5，10^-6，10^-7，10^-8，10^-9，10^-10mol/L胰岛素的DMEM不完全培养基诱导细胞模型，100μL/孔，每组6个复孔，同时设正常培养的细胞作对照。各组加胰岛素培养24h，36h和48h后，再换不含胰岛素的不完全DMEM培养基继续培养24h，用葡萄糖氧化酶法分别测定各组细胞培养液中的葡萄糖水平(ΔG)，然后移出培养液，用PBS洗2次，加入MTT溶液100μL(终浓度0.5mg/mL)，继续培养4h，之后弃上清，每孔加入100μL DMSO，振荡，使结晶物充分溶解，用酶标仪检测波长为490nm时的OD值，代表各孔细胞数量的多少。以上清葡萄糖含量/OD值(ΔG/OD)为判断指标，对各孔细胞葡萄糖消耗量进行校正，比较各胰岛素组与正常对照组的ΔG/OD，其值越大，说明单位细胞消耗的葡萄糖越少，胰岛素抵抗越明显。通过ΔG/OD的计算及MTT细胞活力测定确定最佳胰岛素浓度和胰岛素作用时间，由此建立HepG-2细胞最佳胰岛素抵抗模型。

1.3实施例1制得的肽奶粉对HepG-2细胞增殖的影响

将HepG-2细胞用完全DMEM培养基接入96孔板中，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，将细胞分为空白对照组和奶粉样品组，更换含有奶粉样品(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)的无血清的DMEM培养液继续孵育24h，按照1.3所示方法进行MTT细胞活力检测，计算各组细胞增殖率，计算公式：

1.4实施例1制得的肽奶粉对胰岛素抵抗模型的影响

胰岛素抵抗模型建立成功后，将模型细胞分为模型组和样品组，同时设空白对照组。样品组加入含胰岛素和奶粉样品(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)的不完全DMEM培养基，每个质量浓度组设6个复孔。样品干预到最佳胰岛素作用时间后，换不完全DMEM培养基继续培养24h，检测细胞培养液中的葡萄糖含量，计算ΔG/OD。与模型相比，ΔG/OD值越小说明单位细胞消耗葡萄糖越多，所对应奶粉样品对胰岛素抵抗的改善效果越明显。

2结果与分析

2.1中老年肽奶粉基础理化性质分析

实施例1制得的奶粉基础理化指标结果见表4。奶粉中总蛋白含量占36.94±0.20％，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等较低分子量的蛋白水解物占12.480±0.238％，这些酸溶蛋白由于分子量小，极易被人体消化吸收。此结果表明，本发明实施例1制得的肽奶粉含有较高的小分子蛋白即生物活性肽，更易于补充中老年所需的蛋白质，发挥生理功效。

表4肽奶粉基础理化成分含量

2.2不同浓度胰岛素和不同作用时间对HepG-2细胞胰岛素抵抗模型的影响

肝脏及外周组织是产生胰岛素抵抗的主要部位，人源肝癌细胞HepG-2表面有大量胰岛素受体，是研究胰岛素抵抗最常用的细胞株。体内胰岛素必需首先与细胞表面受体结合，激活受体的酪氨酸激酶，进一步刺激胰岛素受体底物-1(IRS-1)发生磷酸化，引发磷酸化级联反应，传递信号到靶细胞，才能发挥其生理功效。细胞表面胰岛素受体处于不断循环，受体的减少或缺陷是造成胰岛素抵抗的主要原因。有研究表明高浓度的胰岛素可使HepG-2细胞表面受体数量减少，人体空腹时血浆中的胰岛素浓度约在3.6×10^-11～10^{- 10}mol/L，进餐后可提升5～10倍，在高浓度3.33×10^-7mol/L的胰岛素作用下，HepG-2细胞表面胰岛素受体数量会减少58％，0.8×10^-7mol/L的胰岛素作用下，HepG-2细胞表面胰岛素受体mRNA表达量会减少33.8％；同时，细胞与胰岛素接触早期会引起细胞膜表面受体数量下降，但随着时间延长循环返回细胞表面的受体数量会增多，且长时间接触高浓度胰岛素会抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡。

将HepG-2细胞分别与胰岛素共孵育24h、36h、48h，各孔细胞的ΔG/OD检测结果见图1。结果显示，胰岛素诱导HepG-2细胞24h后出现比较明显的胰岛素抵抗现象，而在36h和48h并没有出现胰岛素抵抗现象。在诱导24h后，10^-6、10^-7、10^-8、10^-9、10^-10mol/L的胰岛素均能产生极显著的胰岛素抵现象(P<0.01)。通过不同浓度胰岛素作用于细胞24h后，MTT法检测细胞活力，结果如图2，由图可知，10^-9、10^-10mol/L的胰岛素虽能诱导细胞产生极显著的胰岛素抵抗现象(P<0.01)，但该浓度对细胞生长有抑制作用。综合ΔG/OD和MTT检测结果，10^{- 7}mol/L的胰岛素浓度既能产生极显著的胰岛素抵抗作用，对细胞生长又没有影响，故确定10^-7mol/L浓度的胰岛素作用24h为最佳胰岛素抵抗细胞模型。

2.3肽奶粉对HepG-2细胞增殖的影响

实施例1制得的肽奶粉在3个浓度下对HepG-2细胞增殖的影响见图1，由图可知，在3个浓度下，奶粉对HepG-2细胞的增殖并没有影响。实施例2-3制得的肽奶粉在上述相同3个浓度下对HepG-2细胞增殖的影响同实施例1肽奶粉相似，无显著差异。

2.4奶粉对胰岛素抵抗的HepG-2细胞葡萄糖消耗量的影响

实施例1制得的奶粉对胰岛素抵抗的HepG-2细胞葡萄糖消耗量的影响见图4。由图可知，奶粉具有一定改善胰岛素抵抗的功效。在低浓度200μg/mL、中浓度400μg/mL时能够显著的提高胰岛素抵抗细胞的葡萄糖消耗量(P<0.05)，在高浓度800μg/mL的作用结果与预期结果相反。说明本发明的奶粉具有改善胰岛素抵抗的作用，可以在一定程度上增加细胞对胰岛素的敏感性。

本实施例体外构建了人肝癌细胞HepG-2的胰岛素抵抗模型，并通过实验分析实施例1制得的奶粉对胰岛素抵抗的改善作用相，评价奶粉的功能性。结果表明：综合胰岛素诱导细胞的葡萄糖消耗量和胰岛素对细胞增殖能力的MTT检测结果，10^-7mol/L的胰岛素诱导24h浓度既能产生极显著的胰岛素抵抗作用，对细胞生长又没有影响，故10^-7mol/L浓度的胰岛素作用24h为最佳胰岛素抵抗细胞模型。对模型细胞添加奶粉样品，奶粉组在低浓度200μg/mL、中浓度400μg/mL时的改善作用显著(P<0.05)，而在高浓度800μg/mL时的改善作用不理想。结果提示：本发明实施例1制得的肽奶粉具有改善人肝癌细胞HepG-2胰岛素抵抗的能力。实施例2-3制得的肽奶粉试验结果同实施例1肽奶粉相似，无显著差异，均具有改善人肝癌细胞HepG-2胰岛素抵抗的能力。

实施例5本发明配方奶粉的制备(4)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉48g，全脂乳粉23.68g，水解小麦蛋白肽粉11g，酶解酪蛋白5g，菊粉4g、水苏糖3g，燕麦粉2g，红茶粉1.3g，麦精1g，罗汉果粉0.02g。

实施例6本发明配方奶粉的制备(5)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉46g，全脂乳粉28g，水解小麦蛋白肽粉15g，酶解酪蛋白8g，菊粉5g、水苏糖4g，燕麦粉1g，红茶粉1g，麦精0.7g，罗汉果粉0.01g。

实施例7本发明配方奶粉的制备(6)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉55g，全脂乳粉22g，水解小麦蛋白肽粉8g，酶解酪蛋白10g，菊粉3g、水苏糖5g，燕麦粉1.5g，红茶粉0.9g，麦精1.4g，罗汉果粉0.15g。

实施例8本发明配方奶粉促进肠道菌粘附的效果

1、方法

1.1Caco-2细胞的培养

用含灭活的体积分数10％FBS、2％谷氨酰胺、1％非必须氨基酸和1％双抗的MEM完全培养基，在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养Caco-2细胞，待细胞长满培养瓶瓶底后，先用PBS缓冲液洗2次，再加0.25％胰酶消化约两分钟至细胞细胞分散为单个细胞，加入MEM完全培养基终止反应，将细胞吹打成细胞悬液，按1:3进行传代。

1.2菌悬液的制备

在37℃培养约12h的唾液乳杆菌菌悬液于4℃，8000rpm离心10分钟，用PBS(pH7.2)洗2次，并用细胞培养液重悬，得到约10⁹CFU/mL的菌悬液。

1.3实施例5制得的肽奶粉对Caco-2细胞增殖的影响

将Caco-2细胞用完全MEM培养基接入96孔板中，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，将细胞分为空白对照组和奶粉样品组，更换含有奶粉样品(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)的无血清的DMEM培养液继续孵育24h，采用MTT法计算各孔细胞活力，计算各组细胞增殖率，计算公式：

1.4实施例5制得的奶粉对肠道益生菌粘附能力的影响

Caco-2细胞以10⁵/孔的密度接入预先放置灭菌盖玻片的24孔板中，于37℃，5％CO₂，95％湿度的培养箱中培养至细胞连续致密单层。粘附前至少1h更换不完全新鲜培养液(无双抗)，每孔加入制备好的0.5mL菌悬液和0.5mL不完全培养液，再按200、400、800μg/mL的终浓度加入实施例3制得的奶粉，于4℃，5％CO₂，95％湿度的培养箱中共培养1.5h。取出甲醇固定、革兰氏染色，油镜下观察，随机选取20个视野下100个细胞上粘附的肠道益生菌的数量。

2结果与分析

2.1中老年奶粉基础理化性质分析

实施例5制得的肽奶粉基础理化指标结果见表5。奶粉中总蛋白含量占34.66±0.12％，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等较低分子量的蛋白水解物占6.888±0.849％，这些酸溶蛋白由于分子量小，极易被人体消化吸收。此结果表明，本发明实施例5制得的肽奶粉含有较高的小分子蛋白即生物活性肽，更易于补充中老年所需的蛋白质，发挥生理功效。

表5奶粉基础理化成分含量

2.2奶粉对Caco-2细胞增殖的影响

实施例5制得的奶粉在3个浓度下对Caco-2细胞增殖的影响见图5，由图可知，在3个浓度下，本发明实施例5制得的奶粉对Caco-2细胞的增殖并没有影响。实施例6-7制得的肽奶粉试验结果同实施例5肽奶粉相似，无显著差异，均对Caco-2细胞的增殖并没有影响。

2.3奶粉对Caco-2细胞粘附唾液乳杆菌数量的影响

肠道菌群结构的改变与肠道菌和上皮细胞间的黏附密切相关，而粘附是益生菌在肠道内定植、发挥益生功效的前提条件。实施例5制得的奶粉对肠道益生菌--唾液乳杆菌的粘附数量结果见图6。从图中可知，在3种浓度下，实施例5制得的肽奶粉均能极显著促进唾液乳杆菌的粘附(P<0.01)。图7A和图7B为肠道菌粘附图片，由图片亦可看出本发明奶粉具有促进肠道菌粘附的功效。相同试验进行下，实施例6-7的肽奶粉均能极显著促进唾液乳杆菌的粘附(P<0.01)。

由结果可知，本发明奶粉可极显著促进唾液乳杆菌的粘附定植(P<0.01)。说明本发明奶粉具有很好的促进肠道益生菌增殖的功效。

实施例9本发明配方奶粉的制备(7)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉52g，全脂乳粉21g，水解小麦蛋白肽粉11g，酶解酪蛋白5g，菊粉4g，水苏糖3.28g，赤藓糖醇3g、人参粉0.5g、山楂粉0.1g、牛磺酸0.12g。

实施例10本发明配方奶粉的制备(8)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉45g，全脂乳粉28g，水解小麦蛋白肽粉14g，酶解酪蛋白3g，菊粉2g，水苏糖5g，赤藓糖醇6g、人参粉0.7g、山楂粉0.08g、牛磺酸0.18g。

实施例11本发明配方奶粉的制备(9)

本发明的中老年配方奶粉配料为：脱脂乳粉48g，全脂乳粉24g，水解小麦蛋白肽粉10g，酶解酪蛋白8g，菊粉3g，水苏糖4.5g，赤藓糖醇3g、人参粉0.4g、山楂粉0.05g、牛磺酸0.15g。

实施例12本发明配方奶粉改善动脉粥样硬化的效果

1方法

1.1细胞培养

用含灭活的体积分数10％FBS的DMEM完全培养基，在37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养平滑肌细胞，待细胞长满培养瓶瓶底后，先用PBS缓冲液洗2次，再加0.25％胰酶消化3分钟，细胞开始脱落时加入DMEM完全培养基终止反应，将细胞吹打成细胞悬液，按1:3进行传代。

1.2ox-LDL诱导平滑肌细胞增殖模型的建立

平滑肌细胞增殖模型的建立参考文献[杨佩颖，吴薇，魏颖，程倩，蔡圣宝，籍保平，苏春元.刺玫果多酚对血管平滑肌细胞增殖的抑制作用.食品科技,2011,36(10):191～195,199]并稍作调整。将平滑肌细胞按2×10⁴个/mL接种于96孔板中，100μL/孔，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，弃上清，用PBS缓冲液洗2次，再加新鲜配制的含10、20、30、40、50μg/mL ox-LDL的DMEM不完全培养基诱导细胞增殖，100μL/孔，每组6个复孔，同时设正常培养的细胞作对照。各组加ox-LDL干预24h后，收集上清液，依据NO试剂盒说明书测定NO释放量，同时采用MTT法检测细胞增殖情况。以细胞增殖率和NO释放量为判断指标，比较各浓度ox-LDL组与正常对照组的细胞增殖率与NO释放量，增殖率越高，NO释放量越低，说明建立的细胞增殖模型越成功。

1.3实施例9制得的中老年肽奶粉对平滑肌细胞增殖的影响

将平滑肌细胞按2×10⁴个/mL接种于96孔板中，100μL/孔，于37℃，5％CO₂恒温培养箱中培养24h，将细胞分为空白对照组和奶粉样品组，更换含有各奶粉样品(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)的无血清的DMEM培养液继续孵育24h，MTT法检测细胞活力，计算各组细胞增殖率，计算公式：

1.4中老年肽奶粉对ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖的影响

细胞增殖模型建立成功后，将模型细胞分为样品组和模型组，同时设空白对照组。除对照组和模型组外，样品组加入含各奶粉样(终质量浓度分别为200、400、800μg/mL)的不完全DMEM培养基，每个质量浓度组设6个复孔。样品干预24h后，依据NO试剂盒说明书测定上清NO释放量，MTT法检测细胞增殖情况。与模型组相比增殖率越低，NO释放量越高，说明所对应奶粉样品预防动脉粥样硬化的功效越好。

2结果与分析

2.1中老年肽奶粉基础理化性质分析

由实验得出的中老年肽奶粉基础理化指标结果见表6，结果均为质量分数。实施例9制得的中老年肽奶粉中总蛋白含量占31.52±0.28％，其中酸溶蛋白即包括肽及氨基酸等较低分子量的蛋白水解物占5.741±0.067％，说明本发明实施例9制得的奶粉含有较高易于人体吸收的小分子蛋白，更易于中老年群体补充所需的蛋白质，发挥其生理功效。实施例10-11制得的肽奶粉基础理化成分含量与实施例9的肽奶粉类似，无显著差异。

表6中老年奶粉基础理化成分含量

2.2不同浓度ox-LDL对平滑肌细胞增殖模型的影响

动脉粥样硬化是血管壁对各种损伤的一种异常反应，其发病机制主要与体内血脂含量、炎症反应和氧化应激水平有关，其中平滑肌细胞的异常增殖是其病症的主要表现，ox-LDL是诱导平滑肌细胞增殖的关键因素，可通过促进细胞磷酸酯酶D和DNA的合成诱导平滑肌细胞增殖；低密度脂蛋白在血管内膜的聚集会促进巨噬细胞的分化形成，被其Toll样受体(Toll-like receptors，TLRs)和清道夫受体(scavenger receptor，SRs)识别，促进ox-LDL的形成，诱导动脉粥样硬化发展。同时，NO是血管平滑肌细胞的松弛因子，NO合成酶受损发生于动脉粥样硬化早期，提高NO的生物活性对治疗动脉粥样硬化有重要的作用。

本实验采用ox-LDL诱导平滑肌细胞增殖，通过MTT法检测各孔细胞的OD_490nm值来判断细胞增殖情况，NO检测试剂盒来检测各孔细胞NO释放量，OD_490nm值越高、NO释放量越少说明模型建立越成功。结果显示，ox-LDL在浓度为10、20、30μg/mL时诱导平滑肌细胞24h后会极显著的促进细胞增殖(P<0.01)。NO检测结果见图9，由图可知，ox-LDL在30和40μg/mL时会极显著的降低平滑肌细胞NO的释放(P<0.01)。综合MTT检测结果和NO释放量，30μg/mL的ox-LDL既能极显著的促进平滑肌细胞增殖，又能极显著的降低NO释放量，故确定30μg/mL的ox-LDL作用平滑肌细胞24h为最佳细胞增殖模型。

2.3奶粉对平滑肌细胞增殖的影响

实施例9制得的肽奶粉在3个浓度下对平滑肌细胞增殖的影响见图10，由图可知，在3个浓度下，本发明奶粉对平滑肌细胞的增殖并没有影响。实施例10-11制得的肽奶粉在上述相同3个浓度下对平滑肌细胞增殖的影响同实施例9肽奶粉的效果相似，无显著差异。

2.4奶粉对平滑肌细胞增殖模型的影响

通过建模过程中添加本发明实施例9的肽奶粉，奶粉组对模型细胞增殖的影响见图11。由图可看出，本发明肽奶粉具有抑制模型细胞增殖的功效，但在低浓度200μg/mL和高浓度800μg/mL时的抑制效果相对于模型组来说没有显著性差异，在中浓度400μg/mL可以显著抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞的增殖(P<0.05)。本发明实施例9肽奶粉中添加具有抗氧化功效的食源性生物活性肽，有研究表明抗氧化类药物可抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞的增殖与迁移，抑制平滑肌细胞由易于增殖的合成型向正常状态下增殖率极低的收缩型的转变，实施例9制得的肽奶粉对平滑肌细胞增殖模型的抑制作用可能与其含有的食源性活性肽相关。

中老年奶粉对ox-LDL诱导的平滑肌细胞NO释放量的结果如图12。由图可知，奶粉在3个浓度下均能极显著促进模型细胞NO的释放(P<0.01)，且奶粉随浓度的增加，NO释放量逐渐增加。

体外构建了平滑肌细胞增殖模型，并对实施例9-11制得的肽奶粉对平滑肌细胞增殖模型的作用结果进行了比较研究。结果表明：综合ox-LDL诱导平滑肌细胞增殖和NO释放量的检测结果，30μg/mL的ox-LDL诱导平滑肌24h既能极显著的促进细胞增殖，又能极显著的降低NO的释放(P<0.01)，故30μg/mL的ox-LDL作用24h为最佳平滑肌细胞增殖模型。对模型细胞添加奶粉样品，奶粉均能抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞的增殖，极显著的促进细胞NO的释放(P<0.01)。本研究结果提示：本发明实施例9-11的肽奶粉具有较好的抑制ox-LDL诱导的平滑肌细胞增殖和促进NO释放的作用，说明本发明奶粉具有相对较好的预防动脉粥样硬化的功效。

实施例13

对实施例1-3、5-7、9-11制得的肽奶粉进行使用后效果反馈及感官评价试验，共300名志愿者参与实验，每个试验组100名志愿者，按照说明书正常食用肽奶粉。

实施例1-3制得的肽奶粉：80％表示，餐后血糖稳定，身体体重增加，肌肉力量增强，肠道消化吸收及排便情况也有改善。95％志愿者反馈接受产品的口感和溶解性，类似奶粉的口感，优于市面常见蛋白粉和肽产品。

实施例5-7制得的肽奶粉：肠道方面80％志愿者表示，饮用后睡眠有所改善，胃口好了，腹胀嗳气的情况有所缓解。其中60名偏轻体重中有90％表示饮用后一个月体重提升0.5-1kg。30名正常体重人群中80％标识没有变化。10名超重人群标识体重有轻微下降，下降0.5-2kg不等。

实施例9-11制得的肽奶粉：75％志愿者表示，身体感觉轻松舒畅，身体压力感减轻，走路感觉更加情况，精神状态改善，血压稳定。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种中老年配方肽奶粉，其特征在于，含有以下重量份的原料：乳粉50-85份，生物活性肽5-30份，益生元2-15份。

2.根据权利要求1所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，含有以下重量份的原料：脱脂乳粉38-55份，全脂乳粉12-28份，生物活性肽10-26份，益生元5-12份。

3.根据权利要求1或2所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，所述生物活性肽粉为海洋鱼皮胶原低聚肽粉、水解小麦蛋白肽粉、酶解酪蛋白中的一种或多种；所述益生元为菊粉或水苏糖。

4.根据权利要求3所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，还含有燕麦粉、红茶粉、麦精、罗汉果粉；

所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-55份，全脂乳粉22-28份，水解小麦蛋白肽粉2-16份，酶解酪蛋白3-14份，菊粉1-8份、水苏糖1-8份，燕麦粉1-3份，红茶粉0.6-1.6份，麦精0.5-1.8份，罗汉果粉0.01-0.02份。

5.根据权利要求4所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，含有以下重量份的原料：脱脂乳粉48-52份，全脂乳粉22-25份，水解小麦蛋白肽粉5-12份，酶解酪蛋白4-10份，菊粉3-6份、水苏糖2-6份，燕麦粉1-2份，红茶粉0.8-1.3份，麦精0.6-1.4份，罗汉果粉0.01-0.02份。

6.根据权利要求3所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，还含有赤藓糖醇、人参粉、山楂粉、牛磺酸；

所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉40-55份，全脂乳粉16-28份，水解小麦蛋白肽粉7-16份，酶解酪蛋白3-10份，菊粉2-7份，水苏糖1-8份，赤藓糖醇1-9份、人参粉0.2-1.0份、山楂粉0.02-0.1份、牛磺酸0.1-0.3份。

7.根据权利要求6所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-52份，全脂乳粉20-28份，水解小麦蛋白肽粉9-14份，酶解酪蛋白3-8份，菊粉2-5份，水苏糖2-6份，赤藓糖醇2-8份、人参粉0.3-0.8份、山楂粉0.04-0.1份、牛磺酸0.1-0.2份。

8.根据权利要求3所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，所述益生元为菊粉，配方肽奶粉中还含有燕麦粉、牛磺酸、绿茶粉、南瓜粉、苦瓜粉；

所述中老年配方肽奶粉含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-50份，全脂乳粉20-28份，海洋鱼皮胶原低聚肽粉8-25份，酶解酪蛋白2-15份，菊粉3-8份，燕麦粉2-7份，绿茶粉1-5份，南瓜粉1-6份，苦瓜粉0.05-0.5份，牛磺酸0.05-0.4份。

9.根据权利要求8所述的中老年配方肽奶粉，其特征在于，含有以下重量份的原料：脱脂乳粉45-48份，全脂乳粉25-28份，海洋鱼皮胶原低聚肽粉10-20份，酶解酪蛋白2-10份，菊粉3-6份，燕麦粉2-6份，绿茶粉1-4份，南瓜粉1-4份，苦瓜粉0.1-0.3份，牛磺酸0.1-0.3份。

10.权利要求1‐9任一所述的中老年配方肽奶粉在制备中老年保健品中的应用。