CN103125275A - 一种蛹虫草的栽培方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物领域，具体而言，特别涉及一种蛹虫草的栽培方法，能够产生较大的虫草菌素量。该方法包括：分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基；将蛹虫草菌种接种到所述斜面培养基，并在23-25℃培养6-8天，得到斜面菌种；将所述斜面菌种转接到所述液体种子培养基上，在23-25℃下以250转/分钟摇床培养2-3天，得到种子液；将所述种子液转接到已灭菌的所述子实体栽培培养基上，并放置到已消毒的避光培养室进行暗培养，得到菌丝体；将所述菌丝体进行转色培养，并得到长有菌蕾的菌丝体；将所述长有菌蕾的菌丝体进行子实体培养，得到虫草菌素。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体而言，特别涉及一种蛹虫草的栽培方法。
背景技术
虫草菌素是由腺苷和碳支链的脱氧戊糖组成的一种核苷酸，因此也被称为3’-脱氧腺苷(3’-deoxyadenosine，3'-dA)，分子式为C10H13N5O3，分子量为251，熔点为230～23l℃，紫外光最大吸收波长为259nm，具有多种生理活性，如抑菌作用、抗肿瘤作用、抑制病毒作用、增强免疫功能和防治心脑血管疾病等。
蛹虫草cordyceps militaris（L.）Link隶属于真菌界(Fungi)、子囊菌门Ascomycota、子囊菌纲Ascomycetes、粪壳菌亚纲Sordariomycetidae、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitaceae、虫草属Cordyceps；蛹虫草是虫草菌素的主要产生菌，其虫草素含量为冬虫夏草的数十倍，是获得虫草素的主要来源。
目前，在相关技术中，通常都是以蛹虫草菌种作为来源通过培养繁殖，进而产生虫草菌素；而常见的培养蛹虫草菌种在培养的过程中，首先将菌种接到液体种子培养基后，26℃下以130转/分钟，震荡培养一定时间，得液体母种；再以4％的母种量接入发酵培养培养基中，在26℃下以190转/分摇瓶培养17天后得到虫草菌素；
菌种在生长的过程中用到了液体种子培养基及其发酵培养基；液体种子培养基包括：2％蛋白胨、2％蔗糖、0.05％MgSO4·7H2O、0.1％KH2PO4；发酵培养基包括：4％蔗糖、1.5％蛋白胨、0.05％MgSO4·7H2O、0.05％K2HPO4、4.0mg1NAA。
但是，目前相关技术采用的蛹虫草菌种的培养方法得到的虫草菌素的产量低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种蛹虫草的栽培方法，以解决上述的问题。
在本发明的实施例中提供了一种蛹虫草的栽培方法，包括，分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基；将蛹虫草菌种接种到所述斜面培养基，并在23-25℃培养6-8天，得到斜面菌种；将所述斜面菌种转接到所述液体种子培养基上，在23-25℃下以250转/分钟摇床培养2-3天，得到种子液；将所述种子液转接到已灭菌的所述子实体栽培培养基上，并放置到已消毒的避光培养室进行暗培养，得到菌丝体；将所述菌丝体进行转色培养，并得到长有菌蕾的菌丝体；将所述长有菌蕾的菌丝体进行子实体培养，得到虫草菌素。
在菌种培养的过程中，不同生长阶段的蛹虫草菌种采取不同的培养基进行培养，将菌种接种到斜面培养基之后，通过一定时间的培养之后，得到斜面菌种，再将得到的斜面菌种接种到液体种子培养基，培养一定时间后得到种子液；种子液经过子实体培养基培养，并进行暗培养之后，就会得到菌丝体，菌丝体通过转色培养以及子实体培养之后即得到虫草菌素，通过以上描述可以看出，本实施例提供的蛹虫草菌种的栽培方法，在培养的过程中，蛹虫草菌种在不同的生长阶段都采取了不同的培养条件，通过不同的培养条件进而控制了蛹虫草菌种不同时期的生长特性，使得菌种能够稳定、高效的生长和繁殖，因此，其产生的虫草菌素量较大。
附图说明
图1示出了本发明实施例1的蛹虫草的栽培方法的流程图。
具体实施方式
下面通过具体的实施例子并结合附图对本发明做进一步的详细描述。
请参考图1，本发明实施例一提供的蛹虫草的培养基，包括：步骤101：分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基；步骤102：将蛹虫草菌种接种到所述斜面培养基，并在26-28℃培养6-8天，得到斜面菌种；步骤103：将所述斜面菌种转接到所述液体种子培养基上，在26-28℃下以250转/分钟摇床培养2-3天，得到种子液；步骤104：将所述种子液转接到已灭菌的所述子实体栽培培养基上，并放置到已消毒的避光培养室进行暗培养，得到菌丝体；步骤105：将所述菌丝体进行转色培养，并得到长有菌蕾的菌丝体；步骤106：将所述长有菌蕾的菌丝体进行子实体培养，得到虫草菌素。
在菌种培养的过程中，不同生长阶段的蛹虫草菌种采取不同的培养基进行培养，将菌种接种到斜面培养基之后，通过一定时间的培养之后，得到斜面菌种，在将得到的斜面菌种接种到液体种子培养基，培养一定时间后就会得到种子液；种子液经过子实体培养基培养，并进行暗培养之后，就会得到菌丝体，菌丝体通过转色培养以及子实体培养之后即得到虫草菌素，通过以上描述可以看出，本实施例提供的蛹虫草菌种的栽培方法，在培养的过程中，蛹虫草菌种在不同的生长阶段都采取了不同的培养条件，通过不同的培养条件进而控制了蛹虫草菌种不同时期的生长特性，使得菌种能够稳定、高效的生长和繁殖，因此，其产生的虫草菌素量较大。
为了使得本发明实施例一的蛹虫草的栽培方法能够有效的得以实施，所以本发明实施例二在对应实施例一基础之上还做出了进一步的增加和限定，现做详细阐述和说明：
本发明实施例二提供的蛹虫草的栽培方法，具体的，在培养的过程中采取了斜面培养基、液体种子培养基、子实体栽培培养基；所述斜面培养基按照重量分数记，包括：马铃薯8-10份；葡萄糖0.8-1份、磷酸二氢钾0.08-0.1份、蚕蛹0.04-0.08份、琼脂1.4-1.5份、水88-89份；所述液体种子培养基按照重量分数记。包括：葡萄糖0.8-1、蛋白胨0.4-0.5份、酵母粉0.8-1份、磷酸二氢钾0.00004-0.00005份、硫酸镁0.00004-0.00005份、蝉蛹0.08-0.1份、氯化钠0.4-0.5份、维生素B10.00008-0.0001份、水97-97.5份；所述子实体栽培培养基按照重量分数记，包括：大米或麦子份2.5-3份、蚕蛹粉1.3-1.5份、蛋白胨0.1-0.15份、磷酸二氢钾0.08-0.1份、硫酸镁0.06-0.09份、葡萄糖0.1-0.15、维生素B10.01-0.02、水95-95.5份。
在具体配制的过程中，可选的，所述斜面培养基按照重量分数记，包括：马铃薯8.95份、葡萄糖0.9份、磷酸二氢钾0.09份、蚕蛹0.045份、琼脂1.41份、水88.6份：所述液体种子培养基按照重量分数记，包括：葡萄糖0.9份、蛋白胨0.45份、酵母粉0.9份、磷酸二氢钾0.000045份、硫酸镁0.000045份、蚕蛹0.09份、氯化钠0.45份、维生素0.000009份、水97.2份；
所述子实体栽培培养基按照重量分数记包括：大米2.86份、蚕蛹粉1.43份、蛋白胨0.14份、磷酸二氢钾0.09份、硫酸镁0.07份、葡萄糖0.14份、维生素B10.014份、水95.25份。
在蛹虫草菌种不同的生长阶段采取不同的培养基进行培养；斜面培养基、液体种子培养基、子实体栽培培养基分别为蛹虫草菌种在不同的生长阶段提供了营养物质，进而确保菌种的生长活力和适应栽培目标的需求，每种培养基都是按照不同营养成分按照优选的重量比例组合而成，且斜面培养基、液体种子培养基、子实体栽培培养基中均含有一定比例的蝉蛹成分，由于蝉蛹本身均有较高的营养价值，其主要以贡献氮源的方式为蛹虫草菌种的生长繁殖提供营养物质；此外，在斜面培养基中，葡糖糖和马铃薯为蛹虫草菌种提供了生长所需的碳源，磷酸二氢钾作为缓冲液，维持了菌种生长所需的酸碱度，通过斜面培养基培养之后得带斜面菌种；而液体种子培养基为斜面菌种的生长提供了营养物质，将斜面菌种通过培养之后，即产生了种子液，产生的种子液再通过子实体栽培培养基培养之后得到菌丝体；菌丝体进一步的生长之后得到高含量虫草菌素的子实体；由于三种培养基均含有供蛹虫草菌种生长的氮源和碳源等，因此，蛹虫草菌种在生长的过程中表现出良好的活性特征，并有利于虫草菌素较大量地合成。
在本实施例中，在斜面培养基中添加蚕蛹粉可使菌种的遗传特性得以良好保持；在液体种子培养基中添加蚕蛹可起到保持遗传特性和诱导重要代谢产物相关基因表达的作用。
各培养基的原料尤其是生物性原料，如蚕蛹粉、蛋白胨、大米都具有严格的品质要求，例如，马铃薯要求无腐烂、霉变、无发芽、无绿变，完整无损伤。淀粉鲜重含量不低于15%，蛋白质鲜重含量不低于2%；蛋白胨的总氮不低于15%，氨基酸不低于2.6%；大米优选籼米，无异味、无杂质、无霉变、无虫蛀，其直链淀粉含量不低于23%，蛋白质含量不低于5%等。
可选的，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制斜面培养基具体包括：称取90-110克马铃薯和0.4-0.6克蝉蛹后混合后加入900-1100毫升水，煎煮20分钟后滤掉残渣，得到上层液；将所述上层液补水至1000ml后分别加入15-17克琼脂粉、9-11克葡萄糖和0.5-1.5克磷酸二氢钾，溶解后分装并制成斜面，将所述斜面100-110℃灭菌。
在制备的过程中，各原料的质量和所占的比例都是经过严格控制的，例如马铃薯的质量以100克为最佳，为了使得其含有的有效的营养成分更好的释放，应该在配制的过程中将其切削成小块；此外，配制过程中所用的水可以是山泉水；琼脂粉主要用于培养基的凝固和定型作用，因此其量应该控制在15-17克之间，以16克为最佳值；灭菌时间应该控制在20分钟之内。
可选的，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制液体种子培养基具体包括：将0.8-1.2克蚕蛹粉加入900-1100毫升水中，煮沸25-35分钟后加入9-11克葡萄糖，4-6克蛋白胨、9-11克酵母粉、0.03-0.05克磷酸二氢钾、0.03-0.05克硫酸镁和4-6克NaCl，得到初培养基；将所述初培养基在108℃灭菌10-20分钟，冷却后加入0.05-0.15克维生素B1，得到液体种子培养基。
在配制液体种子培养基的过程中，首先将定量的蚕蛹粉煎煮，这样就会使其内部含有的氨基酸以及蛋白质得到溶解，然后再加入其它成分之后灭菌，最后再加入维生素B1，得到液体种子培养基，液体种子培用于培养斜面菌种，并产生种子液，以备后续培养所用。
可选的，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制子实体培养基具体包括：配制营养液和配制栽培培养基；所述配制营养液包括，将10-20克蚕蛹加入到900-1100毫升水中，并煎煮25-35分钟后，加入1-2克蛋白胨、0.9-1克磷酸二氢钾、0.7-0.8克硫酸镁、1-2克葡萄糖后，再加水至1000毫升，得到营养液；所述配制栽培培养基包括，取28-32克大米加入到35-45毫升所述营养液中，118℃-121℃灭菌25-35分钟后，待冷却后加入0.005克维生素B1，得到所述子实体栽培培养基。
可选的，所述暗培养的培养温度为16-20℃，培养时间为6-8天；
在暗培养的过程中，其温度和培养时间应该严格的控制，优选的，培养温度以18℃为最佳，而培养时间以7天为最佳，同时，在暗培养的过程中，应该对暗培养室预先消毒，以防其他微生物的污染。
所述转色培养包括：将所述菌丝体放置在18℃-22℃的通风房中，每天通风1-3小时、光照8-12小时培养5-8天；
暗培养完成之后，将菌丝体转移到可通风的房间内部，温度以20℃为最佳，每天通风2小时，保证光照时间，转色培养室的湿度应该控制在75%，转色培养完成之后，培养基的表面就会产生小米状的原基（又称菌蕾）。
所述子实体培养包括：将长有菌蕾的菌丝体在20℃-24℃培养30-37天，得到所述虫草菌素；
具体的，当培养瓶中培养基表面形成小米状原基（菌蕾）时，将温度调整为22℃，湿度调整为85%，每天通风2小时，光照8-12小时，培养5-7天，原基伸长为子座（又称为子实体），这时在培养瓶封口薄膜扎3-5个孔，继续培养25-30天，子实体长约8厘米，子实体表面有黄色粉末状物形成时即可采收；根据本实施例提供的蛹虫草菌种的栽培方法，其虫草菌素含量在1.2-1.6%。
所述蚕蛹为4-5龄鲜蚕蛹经55℃-65℃烘干并粉碎后的颗粒。
在配制不同培养基的过程中，为了使得蚕蛹能够迅速的溶解，本发明的实施例中所需的蝉蛹均可优选为4-5龄鲜蚕蛹经55℃-65℃烘干并粉碎后的颗粒。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种蛹虫草的栽培方法，其特征在于，包括：
分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基；
将蛹虫草菌种接种到所述斜面培养基，并在23-25℃培养6-8天，得到斜面菌种；
将所述斜面菌种转接到所述液体种子培养基上，在23-25℃下以250转/分钟摇床培养2-3天，得到种子液；
将所述种子液转接到已灭菌的所述子实体栽培培养基上，并放置到已消毒的避光培养室进行暗培养，得到菌丝体；
将所述菌丝体进行转色培养，并得到长有菌蕾的菌丝体；
将所述长有菌蕾的菌丝体进行子实体培养，得到虫草菌素。
2.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，
所述斜面培养基按照重量分数记，包括：马铃薯8-10份；葡萄糖0.8-1份、磷酸二氢钾0.08-0.1份、蚕蛹0.04-0.08份、琼脂1.4-1.5份、水88-89份；
所述液体种子培养基按照重量分数记，包括：葡萄糖0.8-1、蛋白胨0.4-0.5份、酵母粉0.8-1份、磷酸二氢钾0.00004-0.00005份、硫酸镁0.00004-0.00005份、蚕蛹0.08-0.1份、氯化钠0.4-0.5份、维生素B10.00008-0.0001份、水97-97.5份；
所述子实体栽培培养基按照重量分数记，包括：大米或麦子份2.5-3份、蚕蛹粉1.3-1.5份、蛋白胨0.1-0.15份、磷酸二氢钾0.08-0.1份、硫酸镁0.06-0.09份、葡萄糖0.1-0.15、维生素B10.01-0.02、水95-95.5份。
3.根据权利要求2所述蛹虫草的栽培方法，其特征在于，
所述斜面培养基按照重量分数记，包括：马铃薯8.95份、葡萄糖0.9份、磷酸二氢钾0.09份、蝉蛹0.045份、琼脂1.41份、水88.6份；
所述液体种子培养基按照重量分数记，包括：葡萄糖0.9份、蛋白胨0.45份、酵母粉0.9份、磷酸二氢钾0.000045份、硫酸镁0.000045份、蚕蛹0.09份、氯化钠0.45份、维生素0.000009份、水97.2份；
所述子实体栽培培养基按照重量分数记包括：大米2.86份、蚕蛹粉1.43份、蛋白胨0.14份、磷酸二氢钾0.09份、硫酸镁0.07份、葡萄糖0.14份、维生素B10.014份、水95.25份。
4.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制斜面培养基具体包括：
称取90-110克马铃薯和0.4-0.6克蚕蛹混合后加入900-1100毫升水，煎煮20分钟后滤掉残渣，得到上层液；将所述上层液补水至1000ml后分别加入15-17克琼脂粉、9-11克葡萄糖和0.5-1.5克磷酸二氢钾，溶解后分装并制成斜面，将所述斜面100-110℃灭菌。
5.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制液体种子培养基具体包括：
将0.8-1.2克蚕蛹加入900-1100毫升水中，煮沸25-35分钟后加入9-11克葡萄糖，4-6克蛋白胨、9-11克酵母粉、0.03-0.05克磷酸二氢钾、0.03-0.05克硫酸镁和4-6克NaCl，得到初培养基；将所述初培养基在108℃灭菌10-20分钟，冷却后加入0.05-0.15克维生素B1，得到液体种子培养基。
6.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，在分别配制斜面培养基、液体种子培养基和子实体栽培培养基的步骤中，配制子实体培养基具体包括：
将10-20克蚕蛹加入到900-1100毫升水中，并煎煮25-35分钟后，加入1-2克蛋白胨、0.9-1克磷酸二氢钾、0.7-0.8克硫酸镁、1-2克葡萄糖后，再加水至1000毫升，得到营养液；
取28-32克大米加入到35-45毫升所述营养液中，118℃-121℃灭菌25-35分钟后，待冷却后加入0.005克维生素B1，得到所述子实体栽培培养基。
7.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，所述暗培养的培养温度为16-20℃，培养时间为6-8天。
8.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，所述转色培养包括：将所述菌丝体放置在18℃-22℃的通风房中，每天通风1-3小时、光照8-12小时培养5-8天。
9.根据权利要求1所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，所述子子实体培养包括：将长有菌蕾的菌丝体在20℃-24℃培养30-37天，得到所述虫草菌素。
10.根据权利要求1-9任一项所述的蛹虫草的栽培方法，其特征在于，所述蝉蛹为4-5龄鲜蚕蛹经55℃-65℃烘干并粉碎后的颗粒。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
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| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
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Denomination of invention: Cultivation method of cordyceps militaris Effective date of registration: 20170103 Granted publication date: 20150610 Pledgee: Anshun Rural Commercial Bank West Branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Xiong Yan Registration number: 2016520000018 |
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| PLDC | Enforcement, change and cancellation of contracts on pledge of patent right or utility model | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PC01 | Cancellation of the registration of the contract for pledge of patent right |
Date of cancellation: 20190219 Granted publication date: 20150610 Pledgee: Anshun Rural Commercial Bank West Branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Xiong Yan Registration number: 2016520000018 |
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right |
Denomination of invention: Cultivation method of cordyceps militaris Effective date of registration: 20190228 Granted publication date: 20150610 Pledgee: Anshun Rural Commercial Bank West Branch of Limited by Share Ltd. Pledgor: Xiong Yan Registration number: 2019520000005 |
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| PP01 | Preservation of patent right |
Effective date of registration: 20210325 Granted publication date: 20150610 |
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| PD01 | Discharge of preservation of patent | ||
| PD01 | Discharge of preservation of patent |
Date of cancellation: 20240325 Granted publication date: 20150610 |