CN107173051A - 一种蛹虫草多孢杂交育种的方法及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种蛹虫草多孢杂交育种的方法及其应用，该方法包括：分别配制固体培养基、斜面试管培养基、液体种培养基和子实体培养基；将蛹虫草的孢子弹射到固体培养基上，并在20‑22℃培养2天；再将固体培养基的菌种转接到斜面试管培养基中，在20‑22℃培养7‑8天；将所述斜面菌种转接到液体培养液中，在20‑22℃下以200转/分钟摇床培养5‑6天得到种子液；将所述种子液转接到子实体培养基上，放置到暗培室避光培养8‑10天，得到菌丝体；将菌丝体转色，进行子实体培养，可得到高产、虫草素含量高的子实体。

Description

一种蛹虫草多孢杂交育种的方法及其应用

技术领域

本发明涉及应用生物技术原理人工培育真菌的技术领域，具体涉及蛹虫草的培育，更具体地涉及一种蛹虫草多孢杂交育种的方法及其应用。

背景技术

蛹虫草（Cordyceps militaris）隶属于真菌界（Fungi）、子囊菌门（Ascomycota）、子囊菌纲（Ascomycetes）、粪壳菌亚纲（Sordariomycetidae）、肉座菌目（Hypocreales）、麦角菌科（Clavicipitaceae）、虫草属（Cordyceps）。蛹虫草是非常著名的药食两用的子囊真菌，也是获得虫草素的主要来源，具有很高的开发利用价值。近年来，随着野生冬虫夏草资源的日渐枯竭，其价格不断攀升，从而促使人们寻找野生冬虫夏草的替代品。由于蛹虫草具有与冬虫夏草相近的药用与食用价值，加之蛹虫草更容易驯化，因此受到人们越来越多的关注。

蛹虫草的生物活性成分主要是虫草素、虫草酸和多糖。虫草素是蛹虫草的次生代谢产物，为腺苷酸类似物，是从真菌中分离出的第一个核苷酸类抗菌素，具有抑制肿瘤、抗惊厥、抗焦虑等多种药用价值。

在相关技术中，通常都是以蛹虫草的菌种开始培养繁殖，进而得到虫草素、多糖和虫草酸。常见的蛹虫草菌种在培养过程中，首先制作固体试管种再将试管种转接到液体培养液中，震荡培养一定时间，得到液体母种，得到的液体母种经过扩培后或直接接种到子实体培养基继续培养。一般而言，蛹虫草菌种在培养生长过程中会用到固体培养基、液体培养基及子实体培养基；其中固体培养基包括：20%马铃薯，5%葡萄糖，3%琼脂粉；液体培养基包括：20%马铃薯，2%葡萄糖，0.2%蛋白胨，0.09%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁；子实体固体培养基包括：25%大米或麦子，2.0%蛋白胨，0.07%磷酸二氢钾，0.04%硫酸镁。

此外，一方面，蛹虫草就是一种退化特别快的菌种，如果培养基营养不全，就会导致产量低、退化快；另一方面，蛹虫草的生长是一个退化的过程，是人工难以控制的。

为此，需要探索一种培育优良蛹虫草菌种的方法，并为其生长提供营养全面的培养基，以期获得有活力且退化慢的菌种，进而培育得到产量高、有益成分含量丰富的子实体。

发明内容

本发明提供一种蛹虫草多孢杂交育种的方法，包括以下步骤：

1）将蛹虫草的孢子弹射至固体培养基上，培养得到蛹虫草的多孢菌种；

2）将所述多孢菌种转接到斜面培养基中，培养得到斜面菌种；

3）将所述斜面菌种转接到液体培养基上，摇床培养得到种子液。

通过本发明获得的蛹虫草多孢杂交菌种活力高、发菌快，可减少菌种的退化，进一步培养可获得高产、虫草素含量高的子实体。

进一步，步骤1）所述的固体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，琼脂0.6-0.8份，水50-60份。

更进一步，步骤1）所述的固体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.4份，葡萄糖0.95份，琼脂0.7份，水56份。

进一步，步骤2）所述的斜面培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，琼脂0.8-1份，水50-60份。

更进一步，步骤2）所述的斜面培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.045份，琼脂0.82份，水56。

进一步，步骤3）所述的液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B1 0.0009-0.02份。

更进一步，步骤3）所述的液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B1 0.0112份。

进一步，所述培养基中的蛋白胨的总氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；所述培养基中的水为矿泉水或者蒸馏水，PH值为6-7。

本发明使用的培养基为能够为蛹虫草菌种或子实体的生长提供全面营养的培养基，其可市售获得，或者按照已有文献自制。作为一种更优的实施方式，优选其含有本发明所列的培养基组成，这些培养基提供了最合适的碳氮比，营养较其他现有的培养基更为全面，使蛹虫草在发菌过程中发菌快，稳定，减少了菌种的退化。

进一步，所述步骤1）在20-22℃培养2天。

进一步，所述步骤2）在20-22℃培养7-8天。

进一步，所述步骤3）在20-22℃下以200转/分钟摇床培养5-6天。

本发明还提供以上任一项所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法在蛹虫草培养中的应用。

本发明提供一种培育蛹虫草的方法，包括将以上任一项所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法制备的种子液接种到子实体培养基，继续进行培养。

进一步，所述子实体培养基按照重量份数计，包括：大米和/或麦子25-35份，蛋白胨0.27份，磷酸二氢钾0.096份，硫酸镁0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

更进一步，所述子实体培养基按照重量份数计，包括：大米和/或麦子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氢钾0.096份，硫酸镁0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

进一步，子实体培养包括以下步骤：

4）将所述种子液接种到子实体培养基，避光培养，长出菌丝体；

5）将所述菌丝体转色培养，得到长有原基的菌丝体；

6）将所述长有原基的菌丝体进行子实体培养，至采收。

进一步，所述步骤4）避光培养（例如置于暗培室中培养）的温度为20-22℃，培养8-10天。

进一步，所述步骤5）转色培养的温度为20-22℃，湿度为70%，每天通风（例如置于通风房中培养）4-5小时，光照12-16小时，培养4-5天。

进一步，所述步骤6）子实体培养的温度为20-25℃，培养35-40天。

具体实施方式

本发明提供的蛹虫草为有性繁殖，遗传性较好，孢子粉含量高、产量高，子实体粗壮品相好，其中含有的虫草素及多糖在抗炎、抗癌及增强免疫力等方面起到重要作用。具体地，本发明比现有菌种的培育方法和传统配方的培养基发菌快，污染率降低达15%，采收的子实体的虫草素含量为1.5%-2%，比无性繁殖的草高20%，产量比无性繁殖的草高10%-15%。

在多孢杂交育种的过程中，不同生长阶段的蛹虫草菌种采取不同的培养基进行培养。其中，将孢子弹射到固体培养基上之后，通过一定时间的培养，得到多孢子种，再将得到的多孢子种转接到斜面试管培养基中，通过培养一段时间后得到斜面菌种，再将斜面菌种转接到液体培养液中，通过培养一段时间得到液体菌种，将液体菌种再转接到子实体培养基中，并进行暗培养后就会得到菌丝体，菌丝体通过转色培养以及子实体培养之后即可得到产量高、虫草素高的子实体。通过以上描述可知，本发明提供的蛹虫草多孢杂交育种的栽培方法，在培养过程中，蛹虫草菌种在不同阶段采取了不同的培养条件，通过不同的培养条件，控制了蛹虫草菌种不同时期的生长特性，使得菌种能够稳定、高效的繁殖和生长，因此其产量高，虫草素含量大。

固体培养基、斜面试管培养基、液体培养液和子实体栽培培养基分别为蛹虫草在不同的阶段提供了不同的营养，进而确保菌种的生长活力和适应栽培的目标需求。每种培养基都是按照不同的营养成分按照优选的重量比例组合而成。固体培养基、斜面试管培养基、液体培养液和子实体栽培培养基主要以供应碳氮源的方式为蛹虫草不同阶段提供生长繁殖所需的营养。此外，在固体培养基中，葡萄糖和马铃薯为蛹虫草提供了生长所需要的碳源；而斜面培养基中加入了磷酸二氢钾，使酸碱度进行了缓冲，维持了更好的生长条件；接下来的液体培养液更全面为斜面菌种提供了营养物质，进而得到液体菌种再通过子实体培养基培养之后得到菌丝体；菌丝体转色培养后得到产量高、虫草素含量高的蛹虫草子实体。由于四种培养基均含有提供蛹虫草生长的碳源和氮源，因此培养基的营养会决定蛹虫草后期的活性和虫草素的形成。

在本发明中，液体培养基中添加蚕蛹粉可使菌种的遗传性得以良好的保持，减少菌种在不同培养基中的退化。

各培养基的原料都经过严格筛选，如蚕蛹粉、蛋白胨、大米和小麦都要求质量过关，并有正规的生产厂家；马铃薯的采购更严格，要求无腐烂、无霉变、无发芽、无损伤、无绿变、完整无损伤的新鲜马铃薯，其蛋白质含量不低于3%，淀粉含量不低于13%-15%；蛋白胨的总氮含量不低于13.5%，氨基酸含量不低于3%；选用的大米和小麦都无异味、无杂质、无霉变、无蛀虫，且淀粉含量不低于20%，蛋白质含量不低于3%-5%。

在一个具体的实施方案中，本发明提供一种蛹虫草多孢杂交育种及培育蛹虫草的方法，包括：分别配制固体培养基、斜面试管培养基、液体培养液和子实体栽培培养基；将蛹虫草的孢子弹射到固体培养基上，并在20-22℃培养2天；再将固体培养基的菌种转接到斜面试管培养基中，在20-22℃培养7-8天；将所述斜面菌种转接到液体培养液中，在20-22℃下以200转/分钟摇床培养5-6天得到种子液；将所述种子液转接到子实体培养基上，放置到暗培室避光培养8-10天，得到菌丝体；将菌丝体转色，进行子实体培养，培育可得到高产、虫草素含量高的子实体。

在一个更具体的实施方案中，所述固体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.4份，葡萄糖0.95份，琼脂0.7份，水56份；所述斜面培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.93份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.045份，琼脂0.82份，水56份；所述液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9.5份，葡萄糖0.96份，蛋白胨0.43份，酵母浸粉0.43份，磷酸二氢钾0.093份，硫酸镁0.047份，脱脂蚕蛹粉0.094份，水54份，维生素B1 0.0112份；所述子实体栽培培养基按照重量份数计，包括：大米和/或麦子30份，蛋白胨0.27份，磷酸二氢钾0.096份，硫酸镁0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

以下通过实施例对本发明作进一步详细的说明，但这些内容不应理解为对本发明的限制。其中未具体载明的操作方法依照本领域的常规操作进行，使用的试剂、原料和菌种等均市售获得。其中培养基的组分购自北京奥博星。

实施例

1）配制固体培养基，具体包括：称取马铃薯200g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至1190ml，然后分别加入20g葡萄糖、15g琼脂粉，溶解搅拌均匀分装在500L的三角瓶中，每瓶约90ml，将装有液体的三角瓶放置灭菌，121℃灭菌30分钟，然后取出待其凝固备用。

选取无菌培养的成熟的蛹虫草2株，将蛹虫草消毒，将消毒好的虫草倒挂在固体培养基三角瓶中，在避光培养2天便可孢子弹落，落在培养基的孢子经过2天的培养即可得到固体多孢子菌种。

各培养基的配制严格控制质量和数量，例如马铃薯以200g最佳，为了使其有效的营养得到更好的释放，应在制作过程中把马铃薯切成小块，此外配制所需要的水为矿泉水，灭菌时温度控制在121℃，灭菌时间不要超过30min。

2）配制斜面试管培养基，具体包括：称取马铃薯200g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至1180ml，然后分别加入葡萄糖19.6g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁0.95g、琼脂17.3g，溶解搅拌均匀分装在试管中，将装有液体的试管放置灭菌，121℃灭菌30分钟，然后取出15°斜放待其凝固备用。

将试管放置超净工作台上消毒30分钟，然后将固体多孢子菌种转接至斜面试管培养基中，在21℃培养7天，即可得到斜面试管种。

3）配制液体培养液，具体包括：称取马铃薯200g，煮30min后滤掉残渣，得到马铃薯液，将马铃薯液加水补至1137ml，然后分别加入葡萄糖20g、蛋白胨9g、酵母浸粉9g、磷酸二氢钾2.0g、硫酸镁1.0g、脱脂蚕蛹粉2g、B1 0.24g，溶解搅拌均匀分装在三角瓶中，将装有液体的三角瓶放置灭菌，121℃灭菌30分钟，然后取出放凉备用。其中，加入蚕蛹粉可使菌种的遗传性得以良好的保持，减少菌种在不同培养基中的退化。

将液体培养液放置超净工作台上消毒30分钟，然后将斜面试管菌种转接至液体培养液中，在21℃下以200转/分钟摇床培养6天得到种子液。

4）配制子实体培养基，包括：小麦300g，加入蛋白胨2.7g、磷酸二氢钾0.96g、硫酸镁0.96g、葡萄糖2.7g，搅拌加入水580ml，高温123℃灭菌50分钟，放凉后备用。

将子实体培养基放入超净工作台灭菌30分钟，然后将液体菌种转接到子实体培养基中，放置到暗培室避光培养9天，培养温度21℃，得到菌丝体。将菌丝体转移至可通风的房间转色，房间温度为20℃，每天通风4小时，光照11小时，培养2-3天。暗培养及转色的房间湿度控制在70%-80%，转色之后培养基就会出现原基分化，出现小刺芽，这时再培养30天，温度为20-22℃，即可得到高产的子实体。子实体长到约8-10cm，子实体表面有粉状物形成时即可采收。

根据本实施例提供的多孢杂交育种法，采收子实体的虫草素的平均含量为1.8%（由国家轻工业食品质量监督检测天津站测得），比市售无性繁殖的草高20%，子实体产量比无性繁殖的草高15%。

以上所述仅为本发明的优选实施方案，并不用于限制本发明，对于本领域的科技人员本发明可以有更多改变和变化，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进均包含在本发明内。

Claims (10)

1.一种蛹虫草多孢杂交育种的方法，包括以下步骤：

1）将蛹虫草的孢子弹射至固体培养基上，培养得到蛹虫草的多孢菌种；

2）将所述多孢菌种转接到斜面培养基中，培养得到斜面菌种；

3）将所述斜面菌种转接到液体培养基上，摇床培养得到种子液。

2.根据权利要求1所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法，其特征在于：步骤1）所述的固体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，琼脂0.6-0.8份，水50-60份。

3.根据权利要求1所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法，其特征在于：步骤2）所述的斜面培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，琼脂0.8-1份，水50-60份。

4.根据权利要求1所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法，其特征在于：步骤3）所述的液体培养基按照重量份数计，包括：马铃薯9-10份，葡萄糖0.9-1份，蛋白胨0.4-0.5份，酵母浸粉0.4-0.5份，磷酸二氢钾0.09-0.1份，硫酸镁0.04-0.05份，脱脂蚕蛹粉0.09-0.1份，水50-60份，维生素B1 0.0009-0.02份。

5.根据权利要求1所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法，其特征在于，

所述步骤1）在20-22℃培养2天；

所述步骤2）在20-22℃培养7-8天；

所述步骤3）在20-22℃下以200转/分钟摇床培养5-6天。

6.权利要求1至5任一项所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法在蛹虫草培养中的应用。

7.一种培育蛹虫草的方法，其特征在于，将权利要求1至5任一项所述的蛹虫草多孢杂交育种的方法制备的种子液接种到子实体培养基，继续进行培养。

8.根据权利要求7所述的培育蛹虫草的方法，其特征在于，所述子实体培养基按照重量份数计，包括：大米和/或麦子25-35份，蛋白胨0.27份，磷酸二氢钾0.096份，硫酸镁0.096份，葡萄糖0.27份，水58份。

9.根据权利要求7所述的培育蛹虫草的方法，其特征在于，子实体培养包括以下步骤：

4）将所述种子液接种到子实体培养基，避光培养，长出菌丝体；

5）将所述菌丝体转色培养，得到长有原基的菌丝体；

6）将所述长有原基的菌丝体进行子实体培养，至采收。

10.根据权利要求7所述的培育蛹虫草的方法，其特征在于，

所述步骤4）避光培养的温度为20-22℃，培养8-10天；

所述步骤5）转色培养的温度为20-22℃，湿度为70%，每天通风4-5小时，光照12-16小时，培养4-5天；

所述步骤6）子实体培养的温度为20-25℃，培养35-40天。