CN111226694A - 一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法 - Google Patents

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CN111226694A CN202010201823.6A CN202010201823A CN111226694A CN 111226694 A CN111226694 A CN 111226694A CN 202010201823 A CN202010201823 A CN 202010201823A CN 111226694 A CN111226694 A CN 111226694A
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Abstract

一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，将蛹虫草母种菌株接种于液体培养基，全温震荡摇床培养获得液体菌种；液体培养基配方为马铃薯18%~25%、葡萄糖1%~4%、KH2PO4 0.05%~0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%~0.2%、蛋白胨0.2%~0.5%、其余为水；向栽培瓶中加入黄粉虫幼虫，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液，封口，高温高压灭菌获得黄粉虫栽培培养基；将液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面；将栽培瓶放置于培养室架子上进行栽培，到蛹虫草子实体中上部密布子囊果但未散孢子前进行采收，将虫饼与蛹虫草子实体分离，获得蛹虫草子实体。工艺简化，易于产业化作业，以黄粉虫幼虫作为栽培主要原料，获取的蛹虫草子实体子囊果及子囊孢子丰富，虫草素、虫草多糖、SOD酶等营养成分含量更高。

Description

一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法
技术领域
本发明涉及食用菌培育领域，尤其与一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法相关。
背景技术
蛹虫草又称北冬虫夏草，子囊菌纲肉座菌目麦角菌科虫草属，为蛹虫草真菌寄生在鳞翅目昆虫蛹体上形成的子座与蛹体的结合，是虫草属的模式种。因其主要活性成分与冬虫夏草相近或高于冬虫夏草，并且已有较成熟的培养条件，现已成为冬虫夏草的有效替代品。
现有技术中，CN100392063C公开的以黄粉虫蛹为寄主的蛹虫草子实体及其培育方法，其黄粉虫蛹为寄主，注射接种不便于操作不利于工厂化生产，且子实体少；CN103688760A公开一种以黄粉虫为载体培养人工虫草的方法，通过注射接种，不便于操作，以收获染菌虫体为主，接种量小造成不产生子实体或极短小；CN103749149A公开一种以黄粉虫蛹为载体培养人工虫草的方法，其以虫蛹为寄主，只用酒精表面消毒后以注射式接种，虫蛹体内有携带致病菌风险，且子实体短小；CN105493899B公开一种以黄粉虫虫蛹为载体培养虫草产品的方法，其以黄粉虫蛹为寄主，注射接种，获得产品为虫草虫，无子实体；CN108184540A公开一种以活体黄粉虫幼虫为寄主培育蛹虫草的方法，其获得的子实体1.8-3cm，且是采用注射接种的方式。
在上述相关现有技术中，多采用注射侵染以简单的获取蛹虫草菌的菌丝体，一方面存在操作繁琐、生物学转换效率不理想、获得的实体营养成分缺失或欠佳，比如无子实体或子实体极少且子实体仅为1.8~3cm，另一方面现有的处理方式并不利于工业化生产。
发明内容
本申请主要针对相关现有技术的不足，提出一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，简化工艺，提高可操作性，利于实现规规模化和工业化的生产，通过以黄粉虫幼虫替代大米、小麦作为栽培主要原料，栽培获取的蛹虫草子实体子囊果及子囊孢子丰富，虫草素、虫草多糖、SOD酶等营养成分含量更高，使得蛹虫草子实体药用成分提高，更具有食、药用价值。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术：
一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，包括步骤：
将蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养后，获得菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的液体菌种；其中，所述液体培养基是由以下重量配比的原料制得：去皮马铃薯18%~25%、葡萄糖1%~4%、KH2PO4 0.05%~0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%~0.2%、蛋白胨0.2%~0.5%、其余为水；
向栽培瓶中加入黄粉虫幼虫，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液，用OPP封口膜及皮套封口，120~125℃、0.10~0.15MPa灭菌1~2h，获得黄粉虫栽培培养基；
将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面；
将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为18~22℃，菌丝封面8~10d；
将空气相对湿度提高到80~90%，并对栽培瓶进行补光处理，光照强度800~1100Lux，每日补光12h；
待黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基时，将封口膜划一个小口，进入子实体生长阶段；
子实体生长阶段，温度18~22℃，空气相对湿度80~90%，栽培室每日通风2次，每次0.5h~2h；
在蛹虫草子实体中上部密布子囊果但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于40℃~60℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
进一步，蛹虫草母种菌株，是通过采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，并于实验室中进行组织分离，筛选获得。
进一步，液体培养基制备，是将去皮马铃薯称重后切成2~3mm薄片，加入100℃~120℃沸水中煮制15~20分钟，煮至酥而不烂时；利用6~8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，120~125℃、0.10~0.15MPa灭菌0.5h~1h，制得。在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量以定容至与液体培养基总量匹配为准。以总量1000mL液体培养基配方为例：去皮马铃薯200克（20%）、葡萄糖20克（2%）、KH2PO4 1克（0.1%）、MgSO4·7H2O 1克（0.1%）、蛋白胨3克（0.3%），其余为水，熬制过程中因水蒸发减少，最后补水定容至1000mL后分装，120~125℃、0.10~0.13MPa灭菌0.5h~1h即成。
进一步，全温震荡摇床的参数为18℃~25℃、120r/min~160r/min，培养3d~5d。
进一步，栽培瓶为700mL~900mL容量时，加入黄粉虫幼虫为18g~25g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为10mL~20mL。
进一步，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面时，每瓶使用液体菌种5~6mL。
本发明有益效果在于：
1、以黄粉虫幼虫为栽培主要原料，并非简单获取侵染蛹虫草菌的菌丝体，而是以栽培生长获取蛹虫草子实体为主要目的；
2、以黄粉虫幼虫替代了大米、小麦作为栽培主要原料，栽培获取的蛹虫草子实体子囊果及子囊孢子丰富，虫草素、虫草多糖、SOD酶等营养成分含量更高，使得蛹虫草子实体药用成分提高，更具有食、药用价值；
3、18g~25g黄粉虫幼虫经栽培可获取蛹虫草子实体约9g~16g，栽培生育期70d~75d，生物学转化率基本在50%~72%之间。
4、现有技术以收获染菌虫体为目标，无子实体或子实体少且短小；同时，现有技术多采用注射式接种，不便于操作；本方案实例处理方式是以黄粉虫幼虫为培养基主料，通过改良菌种配方和接种方式，可获取长度10~15cm的子实体，为现有技术的5~10倍，并且本方案更加有利于产业化生产开发，是推进规模化生产的更优选择。
附图说明
图1为实施例一实施过程中从黄粉虫栽培培养基到蛹虫草子实体原基的实施图。
图2为实施例一栽培出草子实体的实物图。
图3为实施例一分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
图4为实施例二栽培出草子实体的实物图。
图5为实施例二分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
图6为实施例三栽培出草子实体的实物图。
图7为实施例三分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
具体实施方式
实施例一
1.蛹虫草母种的获取：自我国东北地区长白山余脉采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，于实验室中进行组织分离，筛选获取优质蛹虫草母种菌株。
2.液体培养基制备：培养基配方为去皮马铃薯18%、葡萄糖2%、KH2PO4 0.05%、MgSO4·7H2O 0.05%、蛋白胨0.4%、其余为水。在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量与液体培养基总量匹配。
将去皮马铃薯称重后切成2mm薄片，加入120℃沸水中煮制15分钟，煮至酥而不烂时，利用6层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，122℃、0.12MPa灭菌0.5h，制得，备用。
3.液体菌种扩繁：筛选优质蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养，全温震荡摇床的参数为18℃、160r/min，培养5d，可获取菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的优质液体菌种。
4.黄粉虫栽培培养基制备：向700mL容量的栽培瓶，加入黄粉虫幼虫为18g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为10mL，用耐高压OPP封口膜及皮套封口，122℃、0.13MPa灭菌1h，获得黄粉虫栽培培养基。
5.接种：在接种室内超净工作台上，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面，每瓶使用液体菌种约5mL。
6.栽培：
黄粉虫幼虫培养基经接种后将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为18℃，菌丝封面约需8d；
将空气相对湿度提高到80%，并利用日光灯对栽培瓶进行补光处理，光照强度800Lux，每日补光12h，以促进黄粉虫幼虫菌丝体转色以及子实体原基分化；
25d左右，黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基，用壁纸刀片将封口膜划一个小口，进入子实体生长管理阶段；实施过程的实物/实景图如图1所示；
子实体生长阶段温度18℃，空气相对湿度80%，栽培室每日通风2次，每次2h。
7.采收：子实体生长约37d后，蛹虫草子实体中上部密布子囊果，但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于40℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
如图2为实施例一栽培出草子实体的实物图。
如图3为实施例一分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
在本实例中，栽培生育期合计约70d，对应的部分试验结果如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
实施例二
1.蛹虫草母种的获取：自我国东北地区长白山余脉采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，于实验室中进行组织分离，筛选获取优质蛹虫草母种菌株。
2.液体培养基制备：培养基配方为去皮马铃薯25%、葡萄糖4%、KH2PO4 0.2%、MgSO4·7H2O 0.2%、蛋白胨0.5%、其余为水。在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量与液体培养基总量匹配。
将去皮马铃薯称重后切成3mm薄片，加入100℃沸水中煮制18分钟，煮至酥而不烂时，利用8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，120℃、0.15MPa灭菌1h，制得，备用。
3.液体菌种扩繁：筛选优质蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养，全温震荡摇床的参数为25℃、120r/min，培养3d，可获取菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的优质液体菌种。
4.黄粉虫栽培培养基制备：向900mL容量的栽培瓶，加入黄粉虫幼虫为25g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为20mL，用耐高压OPP封口膜及皮套封口，125℃、0.10MPa灭菌2h，获得黄粉虫栽培培养基。
5.接种：在接种室内超净工作台上，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面，每瓶使用液体菌种约6mL。
6.栽培：
黄粉虫幼虫培养基经接种后将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为22℃，菌丝封面约需10d；
将空气相对湿度提高到90%，并利用日光灯对栽培瓶进行补光处理，光照强度1100Lux，每日补光12h，以促进黄粉虫幼虫菌丝体转色以及子实体原基分化；
30d左右，黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基，用壁纸刀片将封口膜划一个小口，进入子实体生长管理阶段；
子实体生长阶段温度22℃，空气相对湿度90%，栽培室每日通风2次，每次0.5h。
7.采收：子实体生长约35d后，蛹虫草子实体中上部密布子囊果，但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于60℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
如图4为实施例二栽培出草子实体的实物图。
如图5为实施例二分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
在本实例中，栽培生育期合计约75d，对应的部分试验结果如下表：
Figure 885113DEST_PATH_IMAGE002
实施例三
1.蛹虫草母种的获取：自我国东北地区长白山余脉采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，于实验室中进行组织分离，筛选获取优质蛹虫草母种菌株。
2.液体培养基制备：培养基配方为去皮马铃薯20%、葡萄糖1%、KH2PO40.15%、MgSO4·7H2O 0.15%、蛋白胨0.3%、其余为水。在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量与液体培养基总量匹配。
将去皮马铃薯称重后切成3mm薄片，加入110℃沸水中煮制20分钟，煮至酥而不烂时，利用8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，125℃、0.10MPa灭菌0.75h，制得，备用。
3.液体菌种扩繁：筛选优质蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养，全温震荡摇床的参数为21℃、130r/min，培养4d，可获取菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的优质液体菌种。
4.黄粉虫栽培培养基制备：向750mL容量的栽培瓶，加入黄粉虫幼虫为20g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为15mL，用耐高压OPP封口膜及皮套封口，124℃、0.15MPa灭菌1.2h，获得黄粉虫栽培培养基。
5.接种：在接种室内超净工作台上，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面，每瓶使用液体菌种约6mL。
6.栽培：
黄粉虫幼虫培养基经接种后将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为20℃，菌丝封面约需10d；
将空气相对湿度提高到85%，并利用日光灯对栽培瓶进行补光处理，光照强度1000Lux，每日补光12h，以促进黄粉虫幼虫菌丝体转色以及子实体原基分化；
27d左右，黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基时，用壁纸刀片将封口膜划一个小口，进入子实体生长管理阶段；
子实体生长阶段温度21℃，空气相对湿度82%，栽培室每日通风2次，每次1h。
7.采收：子实体生长约36d后，蛹虫草子实体中上部密布子囊果，但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于50℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
如图6为实施例二栽培出草子实体的实物图。
如图7为实施例二分离虫饼与蛹虫草子实体的实物图。
在本实例中，栽培生育期合计约73d，对应的部分试验结果如下表：
Figure DEST_PATH_IMAGE003
实施例四
1.蛹虫草母种的获取：自我国东北地区长白山余脉采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，于实验室中进行组织分离，筛选获取优质蛹虫草母种菌株。
2.液体培养基制备：培养基配方为去皮马铃薯21%、葡萄糖3%、KH2PO4 0.1%、MgSO4·7H2O 0.1%、蛋白胨0.2%、其余为水。在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量与液体培养基总量匹配。
将去皮马铃薯称重后切成2mm薄片，加入100℃沸水中煮制15分钟，煮至酥而不烂时，利用7层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，124℃、0.13MPa灭菌0.6h，制得，备用。
3.液体菌种扩繁：筛选优质蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养，全温震荡摇床的参数为20℃、140r/min，培养4d，可获取菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的优质液体菌种。
4.黄粉虫栽培培养基制备：向800mL容量的栽培瓶，加入黄粉虫幼虫为22g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为18mL，用耐高压OPP封口膜及皮套封口，120℃、0.13MPa灭菌1.5h，获得黄粉虫栽培培养基。
5.接种：在接种室内超净工作台上，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面，每瓶使用液体菌种约5.5mL。
6.栽培：
黄粉虫幼虫培养基经接种后将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为20℃，菌丝封面约需9d；
将空气相对湿度提高到85%，并利用日光灯对栽培瓶进行补光处理，光照强度1000Lux，每日补光12h，以促进黄粉虫幼虫菌丝体转色以及子实体原基分化；
28d左右，黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基，用壁纸刀片将封口膜划一个小口，进入子实体生长管理阶段；
子实体生长阶段温度20℃，空气相对湿度85%，栽培室每日通风2次，每次1h。
7.采收：子实体生长约34d后，蛹虫草子实体中上部密布子囊果，但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于50℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
在本实例中，栽培生育期合计约71d，对应的部分试验结果如下表：
Figure 536674DEST_PATH_IMAGE004
本申请实施例利用18g~25g黄粉虫幼虫经栽培可获取蛹虫草子实体约9g~16g，栽培生育期70d~75d，生物学转化率基本在50%~72%之间。经过此方法获取的蛹虫草子实体子囊果及子囊孢子丰富，虫草素、虫草多糖、SOD酶等营养成分含量更高，使得蛹虫草子实体药用成分提高，更具有药用价值。
以实施例一的方式获得的120g虫草子实体，进行送样检测，按照GB 5009.93-2010、GB5413.13-2010、GB/T 5009.171-2003、GB/T 5009.84-2003、GB/T 5009.92-2003、GB/T 5009.82-2003等相关标准进行分析检测，获得检测结果如下表所示：
Figure DEST_PATH_IMAGE005
以实施例三的方式获得的180g虫草子实体，进行送样检测，按照GB 5009.93-2010、GB5413.13-2010、GB/T 5009.171-2003、GB/T 5009.84-2003、GB/T 5009.92-2003、GB/T5009.82-2003等标准进行分析检测，获得检测结果如下表所示：
Figure 988515DEST_PATH_IMAGE006
本申请实施例提供的栽培生产技术包含蛹虫草菌种制备以及各栽培环节管理要点，是一项通俗易懂、成效显著的获取蛹虫草子实体的新型技术方法，且生产工艺可模式化，有利于工厂化栽培生产。
以上实例仅用于说明本申请的技术手段，但不应该将本申请的技术手段限定于上述实例。

Claims (8)

1.一种以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，包括步骤：
将蛹虫草母种菌株，接种于液体培养基，全温震荡摇床培养后，获得菌球大小均匀、菌液粘稠挂壁、不浑浊的液体菌种；其中，所述液体培养基由以下重量配比的原料制得：去皮马铃薯18%~25%、葡萄糖1%~4%、KH2PO4 0.05%~0.2%、MgSO4·7H2O 0.05%~0.2%、蛋白胨0.2%~0.5%、其余为水；
向栽培瓶中加入黄粉虫幼虫，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液，用OPP封口膜及皮套封口，120~125℃、0.10~0.15MPa灭菌1~2h，获得黄粉虫栽培培养基；
将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面；
将栽培瓶放置于培养室架子上进行菌丝培养，培养温度为18℃~22℃，菌丝封面8d~10d；
将空气相对湿度提高到80%~90%，并对栽培瓶进行补光处理，光照强度800Lux~1100Lux，每日补光12h；
待黄粉虫培养基表面出现蛹虫草子实体原基时，将封口膜划一个小口，进入子实体生长阶段；
子实体生长阶段，温度18℃~22℃，空气相对湿度80%~90%，栽培室每日通风2次，每次0.5h~2h；
在蛹虫草子实体中上部密布子囊果但未散孢子前进行采收，采收时将虫饼与蛹虫草子实体分离，分别置于40℃~60℃温度条件下烘干，密封、避光、防潮保存，获得蛹虫草子实体。
2.根据权利要求1所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述蛹虫草母种菌株，是通过采集成熟但尚未散射孢子的野生蛹虫草个体，并于实验室中进行组织分离，筛选获得。
3.根据权利要求1所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述液体培养基制备，是将去皮马铃薯称重后切成2~3mm薄片，加入100℃~120℃沸水中煮制15~20分钟，煮至酥而不烂时；利用6~8层纱布过滤，向滤液中加入葡萄糖、KH2PO4、MgSO4·7H2O、蛋白胨、水，分装于容量为250mL的小输液瓶，装量为80mL/瓶，120~125℃、0.10~0.15MPa灭菌0.5h~1h，制得。
4.根据权利要求3所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，所述液体培养基制备，在制备过程中，需要补充蒸发减少的水分，补水量以定容至与液体培养基总量匹配为准。
5.根据权利要求1所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，全温震荡摇床的参数为18℃~25℃、120r/min~160r/min，培养3d~5d。
6.根据权利要求1所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，栽培瓶为700mL~900mL容量时，加入黄粉虫幼虫为18g~25g，加入pH=8且浓度为1%的葡萄糖溶液为10mL~20mL。
7.根据权利要求6所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法，其特征在于，将用无菌水稀释后的液体菌种均匀喷洒于黄粉虫栽培培养基表面时，每瓶使用液体菌种5~6mL。
8.一种蛹虫草子实体，其特征在于，通过如权利要求1~7任意一项所述的以黄粉虫幼虫为原料栽培获取蛹虫草子实体的方法获得。
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