CN112352945A - 一种抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，将光照培养的蛹虫草子实体加工制成蛹虫草胶囊剂、片剂、颗粒剂或散剂，即为抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，蛹虫草子实体经过以下步骤培养：(1)培养基的配制；(2)菌丝接种；(3)暗培养；(4)光照培养；(5)蛹虫草子实体采收，该蛹虫草食品应用于增强免疫力和/或缓解体力疲劳。与现有技术相比，本发明只需要蛹虫草本身就可以增强免疫力还可以缓解体力疲劳，不需要其他辅料。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品。
背景技术
免疫力就是机体抵抗外来侵袭，维护体内环境稳定性的能力。根据现代医学研究表明，人体95％的疾病跟免疫力低下有关，人体免疫力提高10％，癌症发生率将会降低45％，肝炎肺炎等传染性疾病发生率将会降低52％，感冒发生率降低66％，身体状态年轻9岁。强大的免疫系统是人类本身抵抗和预防各种疾病的天然屏障。
环境污染、压力过大、劳累过度、锻炼不够、人体的自然老化、营养不均衡等都会造成人体的免疫力降低。免疫力一旦低下，就会出现食欲不佳、失眠多梦、容易感到疲劳；精神不振、记忆力衰退；容易感冒或染上其他疾病，如各种传染病等；病后病程长，难以治愈，手术后伤口愈合慢；某些疾病尤其是各种慢性疾病等的发病率增高。
疲劳是一种综合性的生理过程，疲劳时的生化变化带有全身性的特点，伴有机体内环境的变化和不同生理机能的失调。人体长期处于高度紧张状态，大脑神经细胞活动紧张，耗氧量剧增，引起神经-体液调节及内分泌功能紊乱，易出现脑缺氧及兴奋性降低；其次，过度劳累，能量消耗加大，内环境失去平衡，体内酶活性及离子代谢紊乱，影响细胞化过程，乳酸堆积，出现酸痛与疲劳；再次，凡患慢性消耗性疾病的人，如贫血、失血、营养不良等，如过劳环境工作或超量训练，更加速了大脑中枢神经系统功能失调而导致免疫功能异常。
现代社会，生活节奏越来越快，人们面临的各种压力也越来越大，很多人都长期面临着疲劳的困扰，长时间的过度疲劳会引起身体潜藏的疾病急速恶化，比如导致高血压等基础疾病恶化引发脑血管病或者心血管病等急性循环器官障碍，甚至出现致命的症状。目前，我国大城市白领处于“过劳”状态的接近六成。疲劳将成为21世纪影响人类健康的一个重要问题。
目前，增强免疫力的方法通常都是通过西医注射免疫球蛋白等方法来完成，但注射免疫球蛋白也存在一定的不安全性。与此同时，市场上具有缓解体力疲劳功能的食品大致分为两类：一类是以能源物质、维生素、矿物质等配伍，通过补充人体所需要的能源和多种营养素从而起到缓解体力疲劳的作用，如脂肪、蛋白质、B族维生素、钙、磷、钾等；另一类则是以传统补益中药配伍，通过对机体多方面的调节作用起到缓解体力疲劳的作用，如人参、红景天、西洋参、枸杞子等。但是，同时具有增强免疫力和缓解体力疲劳的人工蛹虫草食品，目前市场上比较少见。
发明内容
本发明的目的就是为了克服上述现有技术存在的缺陷而提供一种可以增强免疫力还可以缓解体力疲劳的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品。
本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：
一种抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，该蛹虫草食品为100％的蛹虫草，所述的蛹虫草中虫草素含量可达4.24ωt％，虫草多糖含量可达19.93ωt％。
进一步地，所述的蛹虫草食品的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂或散剂。
进一步地，所述的蛹虫草，是将光照培养形成的蛹虫草子实体加工制成。加工方法是现有的常规技术，本发明的特色在于原材料的培养。
进一步地，所述的蛹虫草光照培养经过以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，将大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐等混合，经灭菌后，形成培养基；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒，配制操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中；此步操作中，灭菌可以采用75％乙醇喷洒擦拭，接种操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种蛹虫草菌液后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，在培养过程中进行消毒灭菌；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体，在培养过程中进行消毒灭菌；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的蛹虫草子实体收集。
进一步地，所述的培养基中大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐的质量体积比为750g:(20-40)g:(900-1000)ml:(50-100)ml:(1-2)g；所述的蛹虫草菌液与大米的体积质量比为(80-90)ml:750g。番茄汁本身具有一定的酸性，可以自主调节培养基中的pH值，达到5.5左右，这样一来，在虫草子实体培养的过程中可以抑制杂菌的生长，比如芽孢杆菌等，又可以给虫草子实体本身提供足够的营养物质，例如各种维生素，可以将光培养周期缩减至20-22天，提高了产能。
进一步地，所述的无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁或硫酸锰中的一种或多种。无机盐的品种和比例也非常重要。
进一步地，所述的无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，所述的磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)。
进一步地，所述的灭菌包括湿热灭菌，湿热灭菌温度为125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min；所述的暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天。
进一步地，所述的光照培养的光源的波长为510-550nm。光源影响了菌株有性世代和无性世代的转化、生命周期以及生长发育，在培养基的存续下，不同波长的光源蕴含着不同种类的电磁波辐射，只有一定范围内波长的光源才能激发培养基的全部潜能，促进菌株生长，提高相应提高代谢产物的产量，达到产能和品质的协同提升。
进一步地，所述的光照培养的光照强度为400-800lux，温度为20-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天。距离光源远的区域光照度弱，在光源正下方离光源近区域光照度强。
该蛹虫草子实体中腺苷的含量为0.12-0.16ωt％，粗多糖的含量为15.00-19.93ωt％，优选为17.42-19.93ωt％，虫草素的含量为1.10-4.24ωt％，优选为4.05-4.24ωt％。含量均为不含水分的干重含量。若活性成分虫草素和虫草多糖的含量不够，会导致提高机体免疫力和抗疲劳的作用不明显，若是活性成分虫草素和虫草多糖的含量过高，超出合理范围，也会在治疗过程中产生负作用，影响疗效。因此本发明的活性成分含量需要在合理范围内。
该蛹虫草食品应用于增强免疫力和/或缓解体力疲劳。蛹虫草食品的服用剂量为0.025g/(kgbw·d)，服用周期为10-60d。
本发明所述的蛹虫草中虫草素的含量约为冬虫夏草的300-500倍，具有抗肿瘤、抗菌、抗氧化、抗实验性心律失常及提高耐疲劳、耐缺氧能力的药用价值。
本发明在培养基的配制时采用了湿热灭菌，有助于杂菌的消灭，避免后期的培养过程中影响蛹虫草的品质；本发明在培养基中加入了无机盐，内含许多微量元素，有助于蛹虫草后期的光照培养，有利于蛹虫草品质和产量的提升；本发明培养基中的黄豆和大米的比例恰到好处，有利于蛹虫草达到高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量；在培养基中非常有特色地加入了番茄汁等营养成分，不仅可以促进虫草子实体的生长，还可以调节pH值，排出杂菌，提高产品质量；本发明在光照培养时，利用特定波长的光源和光照强度，在光照培养时促使虫草素、虫草多糖含和腺苷产生，进而达到高虫草素含量、高虫草多糖含量以及高腺苷含量的目的。
蛹虫草中的虫草素、虫草酸、多糖、腺苷等多种有效成分，还能在降血脂，防止动脉硬化，保护心、脑组织，镇静催眠，增强巨噬细胞的活性，抗炎、抗癌、抗菌、抗衰老等方面都有良好药用功效。
其中，虫草素能明显促进人外周血液单核细胞IL-10的分泌和IL-10mRNA的表达，同时对诱导产生IL-2的植物血球凝集素和外周血液单核细胞扩增都有抑制作用，抗IL-10中性抗体也不能完全阻止虫草素对IL-2产生的抑制作用。在虫草素作用下成熟树突状细胞能诱导调节性T细胞增殖，而且还能抑制细胞分裂，促进细胞的分化，改变胞膜上物质结构分布，对T淋巴细胞转化有促进作用，它还可以提高机体单核巨噬细胞系统的吞噬功能，激活巨噬细胞产生细胞毒素直接杀伤癌细胞。此外，虫草素还能抑制蛋白质激酶活性，抗核苷磷酸化酶糖基的裂解，对体液免疫有调节作用。虫草多糖是一种有效的免疫调节剂，具有广泛的免疫药理学作用，可调节机体的免疫功能，其作用主要表现为免疫增强和刺激作用。可活化巨噬细胞，增强单核巨噬细胞的吞噬能力，刺激抗体的产生，增强细胞免疫和体液免疫，从而提高人体免疫力。虫草多糖能显著增强肝脏超氧化物岐化酶活性，促进超氧化物歧化酶酶活力，有明显的抗氧化、清除氧自由基和羟自由基的作用，对延缓衰老有显著意义。研究证实，蛹虫草多糖能促进SOD酶活力，具有明显抗衰老作用。同时能提高老龄大鼠SOD、GSH、Px(谷胱甘肽过氧化物酶)活性和明显降低体内脂质过氧化物含量，从而提示蛹虫草多糖的抗衰老作用是通过抗氧化作用实现的。
本发明的蛹虫草可以提升血清抗体积数、肝脏匀浆(10％)中白介素-6含量，促进淋巴细胞的自然增殖作用，同时增加血清溶血素水平，对免疫器官、细胞免疫功能和巨噬细胞功能有明显的增强作用，还能显著提高过度运动大鼠血红蛋白和睾酮值，提高机体运动能力和免疫能力；也能使免疫运动抑制IFN-γ/IL-4比值基本保持不变，具有很好的提高免疫力作用。
本发明的蛹虫草能够通过调节机体能量消耗、代谢的紊乱、中枢神经系统和内分泌系统的功能失调，能显著降低体内肌酸激酶和尿素氮含量，能在运动中对血清睾酮、皮质酮、胰岛素、胰高血糖素、生长激素有一定的调节作用，在某种程度上可以改善运动造成的内分泌紊乱，提高跑台运动能力，还能显著提高血睾酮水平，对血红蛋白的恢复和尿素氮的减少有明显作用，对血乳酸的消除有一定的作用，因而具有很好的抗疲劳作用。也可以使血中尿素氮水平降低，肝糖原含量升高，耳肿胀度、碳廓清指数a升高，同时起到抗疲劳和增强免疫力的作用。
在温度：38±1℃，相对湿度：75％条件下，放置三个月，进行加速稳定性试验，测定功效成分指标和卫生性指标，是否符合要求，经过安全性评价试验结果表明，本发明的蛹虫草食品安全无毒副作用；经过稳定性考察结果表明，本发明的蛹虫草食品在有效期内质量稳定可靠。本发明选用蛹虫草粉为主要原料、经过科学合理的现代生产工艺生产的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，将它应用在增强免疫力、缓解体力疲劳上，旨在提高人们的健康水平，改善免疫力低下者和体力易疲劳者的生活质量。
与现有技术相比，本发明具有以下优点：
(1)本发明可以提升生物体迟发型变态反应能力、淋巴细胞转化能力、血清半数溶血值、抗体生成细胞数、增加NK细胞活性，进而提升生物体免疫力；
(2)本发明在单核-巨噬细胞碳廓清能力及巨噬细胞吞噬鸡红细胞能力上没有负作用，也可以间接提升生物体免疫力；
(3)本发明可以通过延长负重游泳时间、增加肝糖原储备量、降低小鼠运动后血清尿素水平，进而提升生物体抗疲劳能力；
(4)本发明在血乳酸曲线下面积这个指标上没有负作用，也可以间接提升生物体抗疲劳能力；
(5)本发明经过稳定性考察结果表明，在有效期内质量稳定可靠，并在增强免疫力、缓解体力疲劳上具有巨大应用价值，能够提高人们的健康水平，改善免疫力低下者和体力易疲劳者的生活质量；
(6)本发明的活性成分包括腺苷、粗多糖和虫草素，它们的含量均比现有产品高，意味着本发明仅需蛹虫草这一个组分就能起到改善免疫力低下者和体力易疲劳的作用，不需要添加任何辅料。
具体实施方式
下面对本发明的实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
各个实施例中
蛹虫草子实体的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，每盒培养基中包括750g大米、(20-40)g黄豆粉、(900-1000)ml水、(50-100)ml番茄汁和(1-2)g无机盐，经125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min湿热灭菌后，形成培养基；大米主要提供碳源、黄豆粉主要提供氮源、无机盐提供微量元素；无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)；此步操作中，灭菌还可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒，配制操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中，菌液接种量为85ml/盒；此步操作中，灭菌可以采用75％乙醇喷洒擦拭，接种操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种菌丝后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体；光源波长为510-550nm、光照强度为400-800lux，温度为21-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的蛹虫草子实体收集。
几种典型的虫草子实体的培养方案和培养结果如下所示，也表示了各种子实体的性能指标：
子实体1
蛹虫草子实体的培养方法，该方法包括以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，每盒培养基中包括750g大米、30g黄豆粉、950ml水、75ml番茄汁和1g无机盐，经125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min湿热灭菌后，形成培养基；大米主要提供碳源、黄豆粉主要提供氮源、无机盐提供微量元素；无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)；此步操作中，灭菌还可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒，配制操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中，菌液接种量为85ml/盒；此步操作中，灭菌可以采用75％乙醇喷洒擦拭，接种操作前后各开启紫外灯消毒30min；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种菌丝后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体；光源波长为510-530nm、光照强度为600lux，温度为21-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天；此步操作中，灭菌可以采用0.2％新洁尔灭溶液喷洒擦拭，每日开启紫外灯消毒30min，开启臭氧15min；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的蛹虫草子实体收集。
子实体2
与子实体1不同之处在于，光照培养的光源波长为530-550nm。
子实体3
与子实体1不同之处在于，光照培养的光照强度为400lux。
子实体4
与子实体1不同之处在于，光照培养的光照强度为800lux。
子实体5
与子实体1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为50ml。
子实体6
与子实体1不同之处在于，培养基中番茄汁的体积为100ml。
各种子实体的性能指标
| 子实体1 | 子实体2 | 子实体3 | 子实体4 | 子实体5 | 子实体6 | |
| 单盒干重/g·盒<sup>-1</sup> | 55.1 | 55.7 | 52.4 | 53.5 | 55.4 | 53.2 |
| 虫草素含量/ωt％ | 4.18 | 4.12 | 4.24 | 4.16 | 4.07 | 4.05 |
| 腺苷/ωt％ | 0.15 | 0.16 | 0.15 | 0.16 | 0.12 | 0.13 |
| 虫草多糖/ωt％ | 19.93 | 17.54 | 19.31 | 18.36 | 17.42 | 18.85 |
由于每个步骤均严格执行了灭菌步骤，使得虫草子实体产品能够达到色泽、气味和形状均质美观，杂质少，有害成分含量低，杂菌少等一系列优点，具体指标如下所示：
本发明虫草子实体性能指标
实施例1
将采用光照培养的蛹虫草子实体利用现有方法制备抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品胶囊剂。以每日3次，每次一粒，成人体重按60kg计算，折合剂量0.025g/kgbw·d的剂量服用，服用周期为30d，服用时将蛹虫草食品胶囊用白开水送服。
具体而言，将上述各种蛹虫草子实体1-6组合充分干燥后，碾碎成粉，制成胶囊剂，每粒胶囊含虫草粉末0.5g。胶囊是指将一定量的药物(或药材提取物)及适当的辅料(也可不加辅料)制成均匀的粉末和颗粒，填装于空心硬胶囊中而制成。原料蛹虫草粉为固体粉末，具有良好的流动性，可直接填充胶囊，且粉末直接填充胶囊具有工艺简单、省时、节能、成本低等优点，因此，本发明综合考虑原料的性质、工艺的可行性和生产成本，可以采用粉末直接填充胶囊的工艺进行制备。工艺路线设计为：过筛→填充胶囊→抛光、筛选→包装。
实施例2
与实施例1的不同之处在于，所用的蛹虫草子实体1-4组合。
实施例3
与实施例1的不同之处在于，所用的蛹虫草子实体1和/或子实体3组合。
对比例1
与实施例1的不同之处在于，所用的蛹虫草子实体为现有技术蛹虫草子实体，虫草素含量2-0％，虫草多糖含量10-15％。
对比例2
与实施例1的不同之处在于，所用的蛹虫草子实体为现有技术蛹虫草子实体，虫草素含量10-30％，虫草腺苷含量1-5％，虫草多糖含量20-40％。
对照例
与实施例1的不同之处在于，不服用抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品粉剂，仅服用等体积白开水。
一、免疫性能、抗疲劳性能的动物测试
将40只小鼠体重18-22g，按体重随机分为4小组，即对照组和低、中、高剂量组，每组10只小鼠。
实验条件：为屏障环境，实验期间环境温度21-23℃，湿度50-56％。剂量选择及样品处理：据人体口服推荐量，设低、中、高剂量分别为0.125g/kg·bw,0.250g/kg·bw,0.750g/kg·bw(分别相当于人体推荐剂量的5、10、30倍)。试验时，分别取实施例1的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品1.25g,2.50g,7.50g，加蒸馏水定容至200ml，按0.2ml/10g·bw体积给小鼠灌胃，对照组灌胃予以等体积的蒸馏水。每天一次，连续灌胃至少30天。
实验数据统计：用Excel、Spss软件进行数据转化和统计分析。用Spss软件分析时，先对数据进行方差齐性检验，若方差齐，采用单因素方差分析进行总体比较，发现差异再用Dunnett法进行多个剂量组与一个对照组均数间的两两比较。若方差不齐则对原始数据进行适当的变量转换，满足方差齐性检验后,用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到方差齐，则改用秩和检验进行统计，发现总体比较有差异，则采用不要求方差齐性的Tamane'sT2检验进行两两比较。
1、抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品的免疫性能测试
(1)迟发型变态反应实验，结果如表1所示
实验方法：小鼠腹腔注射2％(v/v)SRBC(0.2ml/每鼠)致敏后4天，测量左后足跖部厚度，然后在测量部位皮下注射2％(v/v)SRBC(20μl/每鼠)，于注射后24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。以攻击前后足跖厚度差值(足跖肿胀度)来表示DTH的程度。
表1抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠迟发型变态反应(DTH)的影响
由上表可见，高剂量组小鼠迟发型变态反应能力与对照组比较具有极为显著提高(P<0.01)，表明本发明具有增强免疫力的功能。
(2)半数溶血值(HC50)的测定，结果如表2所示
实验方法：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每只鼠经腹腔注射2％(v/v，用生理盐水配制)SRBC 0.2mL进行免疫。4天后，摘除眼球取血于离心管内，放置约1h，将凝固血与管壁剥离，使血清充分析出，2000rpm离心10min，收集血清。用SA缓冲液将血清稀释为200倍，取1mL置试管内,依次加入10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 0.5mL，补体1mL(用SA缓冲液按1:8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替)。置37℃恒温水浴中保温30min后，冰浴终止反应。2000rpm离心10min，取上清1mL，加都氏试剂3mL。同时取10％(v/v，用SA缓冲液配制)SRBC 0.25mL，加都氏试剂至4mL于另一试管中，充分混匀，放置10min后，于540nm处以对照管作空自，分别测定各管光密度值。
溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示，按下式计算：半数溶血值(HC50)＝样品光密度值SRBC半数溶血时的光密度值×稀释倍数。
表2抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
由此可见，高剂量组小鼠半数溶血值(HC50)与对照组比较具有极为显著的提高(P<0.01)，表明本发明对提高机体免疫力具有潜力。
(3)抗体生成细胞数的测定，结果如表3所示
抗体生成细胞检测(Jerne改良玻片法)：取羊血，用生理盐水洗涤3次，每次离心(2000r/min)10min，将压积SRBC用生理盐水配成2％(v/v)的细胞悬液，每鼠腹腔注射0.2ml。4天后将小鼠处死，取脾，轻轻磨碎，用Hanks液制成细胞悬液，200目筛网过滤，洗涤、离心2次，最后将细胞悬浮在8ml Hanks液中，计数细胞，并将细胞浓度调整为5×106个/mL。将表层培养基加热溶解后与等量的pH＝7.4，2倍浓度的Hanks液混合，分装小试管，每管0.5ml，再向管内加入用SA液配制的10％SRBC 50μl(v/v)、20μl脾细胞悬液(5×106个/mL)，迅速混匀后倾倒于已刷薄层琼脂糖的玻片上，待琼脂糖凝固后将玻片水平扣放在玻片架上，放入二氧化碳培养箱中温育1.5h，然后用SA液稀释的补体(1:8)加入到玻片凹槽内,继续温育1.5h后计数溶血空斑数。
表3抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠抗体生成细胞数的影响
由此可见，高剂量组小鼠抗体生成细胞数与对照组比较具有极为显著提高(P<0.01)，表明本发明对提高机体免疫力具有潜力。
(4)ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验，结果如表4所示
实验方法：ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化实验(MTT法)：无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液的小平皿中，制成细胞悬液，经200目筛网过滤。用Hank's液洗2次，每次离心10分钟(1000r/min)。然后将细胞悬浮于1mL完全培养液中，计数活细胞，用RPM1640培养液调整细胞浓度为3×106个/mL。再将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，在其中一孔加75μL CONA液(相当于7.5μg/mL)，另一孔作为对照，置5％二氧化碳，37℃培养72h。培养结束前4h每孔轻轻吸去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养液，同时加入MTT(5mg/mL)50μL/孔，继续培养4h。培养结東后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以570nm波长测定光密度值。淋巴细胞的增殖能力用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值表示。
表4抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠NK细胞活性的影响
由上表可见，中、高剂量组小鼠NK细胞活性与对照组比较具有极其显著提高(P<0.01)，表明本发明具有增强免疫力的功能。
(5)NK细胞的活性测定，结果如表5所示
细胞活性的测定(乳酸脱氢酶测定法)：受试小鼠颈椎脱臼处死，无菌取脾，制成脾细胞悬液，用Hank's液洗2次，每次离心10min(1000r/min)，弃上清将细胞浆弹起，加入0.5ml灭菌水20秒，裂解红细胞后再加入0.5ml，2倍Hank's液及8ml Hank's液，1000rpm离心10min，用1mL含10％小牛血清的RPM1640完全培养液重悬，用1％冰醋酸稀释后计数，用台酚兰染色计数活细胞数(活细胞数应在95％以上)，调整细胞浓度为2×107个/mL此为效应细胞；取传代后24h生长良好的YAC-1细胞用RPMI140完全培养液调整细胞浓度为4×105个/ml此为靶细胞；取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比50:1)，加入U孔加靶细胞和2.5％Triton各100μl；上述各项均设三个平行孔，于37℃，5％二氧化碳培养箱中培养4h，然后将96孔培养板以1500r/min离心5min，每孔吸取上清100μl置平底96孔培养板中，同时加入LDH基质液100μl，根据室温反应3-10min，每孔加入1mol/L的HCl 30μl，在酶标仪490nm处测定光密度(OD)。
NK细胞活性＝[(反应孔OD-自然释放孔OD)/(最大释放孔OD-自然释放孔OD)]×100％
表5抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠淋巴细胞转化能力的影响
由上表可见，高剂量组小鼠淋巴细胞转化能力与对照组比较显著提高(P<0.05)，表明本发明具有增强免疫力的功能。
综上，在环境温度为21-23℃，湿度为50-56％的条件下，经口给予小鼠0.125g/kg·bw、0.250g/kg·bw、0.750g/kg·bw剂量的本发明蛹虫草食品30天，其中，0.750g/kg·bw剂量能增加小鼠迟发型变态反应能力、淋巴细胞转化能力、血清半数溶血值、抗体生成细胞数，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)；0.250g/kg·bw、0.750g/kg·bw剂量能增加NK细胞活性，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)；可以判定，本发明的蛹虫草食品具有增强免疫力的功能。
2、抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品的抗疲劳性能测试
(1)负重游泳实验，结果如表6所示
实验方法：负重游泳试验：末次给小鼠受试物30min后，置于游泳箱中游泳，水深约30cm，水温25℃±1.0℃，鼠尾根部负荷5％体重的铅皮。记录小鼠自游泳开始至死亡的时间作为负重游泳时间(s)。游泳时间为计量资料，若受试物组游泳时间明显长于对照组游泳时间，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物有延长小鼠负重游泳时间的作用。
表6抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对小鼠负重游泳时间的影响
由上表可见，高剂量组小鼠负重游泳时间与对照组比较延长，差异具有显著性(P<0.05)，表明本发明具有缓解疲劳的功能。
(2)血清尿素的测定，结果如表7所示
实验方法：血清尿素测定：末次给小鼠受试物30min后，在温度为30℃的水中不负重游泳90min，休息60min后拔眼球采血。于4℃静置3h后2000转/分离心15min，取血清用全自动生化分析仪测定血清尿素。所得数据为计量资料，若受试物组血清尿素含量明显低于对照组，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物有减少疲劳的作用。
表7抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对疲劳小鼠血清尿素的影响
由上表可见，中、高剂量组小鼠血清尿素显著低于对照组(P<0.01)，可判定本发明有减少疲劳的作用。
(3)肝糖原的测定，结果如表8所示
实验方法：肝糖原测定(蒽酮法)：末次给小鼠受试物30min后，处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，称取肝脏100mg，余下操作按试剂盒说明书进行肝糖原测定。所得数据为计量资料，若受试物组肝糖原含量明显高于对照组，且差异有显著性(P<0.05)，可判定该受试物有促进小鼠肝糖原储备的作用。
表8抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对肝糖原储备量的影响
由上表可见，高剂量组小鼠的肝糖原储备量明显高于对照组，差异有显著性(P<0.01)，可判定本发明有减少疲劳的作用。
综上，在环境温度为21-23℃，湿度为50-56％的条件下，经口给予小鼠0.125g/kg·bw、0.250g/kg·bw、0.750g/kg·bw剂量的本发明蛹虫草食品，其中，0.750g/kg·bw剂量能明显延长小鼠的负重游泳时间、增加小鼠肝糖原储备量，0.250g/kg·bw、0.750g/kg·bw剂量能降低小鼠运动后血清尿素水平，与对照组比较差异有显著性(P<0.05)，于是可以判定本发明具有缓解体力疲劳功能的作用，具有缓解体力疲劳功能。
二、免疫性能、抗疲劳性能的临床疗效总结
1、抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品的免疫性能临床结果
(1)群体实验
100例免疫力低下的患者(主要症状：经常感冒，总感觉倦怠体乏无力头晕，眼睛干涩，视物不明，且失眠多梦，易燥)，年龄分布在25-75岁，平均分为6组，每组25人，男女各半。
分别给予本发明的人工蛹虫草食品，每天按实施例1-3和对比例1-2的剂量服用，最后一组不服用抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，仅服用等体积白开水，连续服用一个月后，按照以下标准评定其作用效果，其结果如表9所示。
效果评定标准：
显效：免疫力明显提高，体质明显增强，四肢有力，精力充沛，脸色明显改善，色斑、肌肤暗沉等症状消失或者明显改善，睡眠和消化等方面的亚健康状态明显改善；
好转：免疫力有所提高，体质有所增强，四肢较有力，精力和脸色均有一定好转，色斑、肌肤暗沉等症状有所改善，睡眠和消化等方面的亚健康状态也有所改善；
无效：症状及各项检查未见改善。
表9本发明抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对免疫力的影响
| 显效 | 好转 | 无效 | 有效率 | |
| 对照例 | 0 | 1 | 24 | - |
| 对比例1 | 9 | 1 | 15 | 40％ |
| 对比例2 | 13 | 2 | 10 | 60％ |
| 实施例1 | 20 | 1 | 4 | 84％ |
| 实施例2 | 22 | 2 | 3 | 90％ |
| 实施例3 | 24 | 0 | 1 | 96％ |
表9可以看出，本发明的人工蛹虫草食品显著提高机体免疫力，其总有效率高达96％。现有技术中，若活性成分虫草素和虫草多糖的含量不够，会导致提高机体免疫力的作用不明显，若是活性成分虫草素和虫草多糖的含量过高，超出合理范围，也会在治疗过程中产生负作用，影响疗效。
(2)典型案例
李某，男，37岁，于2016年5月初诊。自述是高校教授，在高校担任领导，压力很大。最近经常感冒，头疼脑热，神志不清。且经常失眠多梦，容易发怒，情绪难以控制。
对症而言，病人因工作紧张，生活、饮食不规律，心理压力大，进而加重了机体的消耗，所以感觉精神萎靡、疲乏无力、夜尿频多、食欲降低、睡眠障碍；生病、打针吃药便成了家常便饭。每次感冒都要很长时间才能恢复。
服用本发明抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品一周后，患者自觉诸症改善，睡眠障碍减低，精神萎靡、疲乏无力改善，免疫力改善。继续服用一周，睡眠好，精神状态好，食欲有明显提升，免疫力显著提高。连续服用一个月后，体质增强，情绪容易掌控，免疫力完全改善，感冒发烧频率明显降低。
2、抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品的抗疲劳性能临床结果
选取750例患者，全部诊断为：肾伤疲劳症(表现为：肢体酸懒、耳鸣、精神昏愦、记忆力减退、或有腰膝酸软，足跟酸痛。舌质偏淡、苔薄少或光红无苔，脉细数或濡细)；年龄分布在25-75岁，平均分为4组，每组125人，男女各半。
给患者每天按照实施例1-3和对比例1-2的剂量服用本发明抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，饭后服用，观察期间停止服用其他保健品和药品，三周后检测血常规及血生化指标。最后一组不服用抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，仅服用等体积白开水，结果见表10。
疗效判定：
①痊愈：临床症状消失或恢复正常，血常规，血生化指标(包括：白细胞计数(WBC)；红细胞计数(RBC)；血小板计数(PLT)；淋巴细胞计数(LY)；ALT(谷丙转氨酶)；AST(谷草转氨酶)；ALB(白蛋白)；A/G(血清白/球蛋白)；IgA(免疫球蛋白)；IgG(免疫球蛋白)；IgM(免疫球蛋白)；C.C.R(肌酐清除率)等)全部正常者；
②显效：临床症状明显改善或接近正常，血常规及血生化：大多数指标明显改善或趋于正常；
③有效：临床症状部分好转，血常规及血生化个别指标有明显改善或趋于正常。
④无效：症状及各项检查未见改善。
表9本发明抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品对抗疲劳的影响
| 痊愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 痊愈率 | |
| 对照例 | 0 | 0 | 1 | 124 | - |
| 对比例1 | 55 | 40 | 12 | 18 | 44.0％ |
| 对比例2 | 74 | 32 | 10 | 9 | 59.2％ |
| 实施例1 | 99 | 20 | 2 | 4 | 79.2％ |
| 实施例2 | 108 | 12 | 4 | 3 | 86.4％ |
| 实施例3 | 120 | 3 | 1 | 1 | 96.0％ |
表9可以看出，本发明的人工蛹虫草食品显著提高机体抗疲劳性，其痊愈率高达96％。现有技术中，若活性成分虫草素和虫草多糖的含量不够，会导致抗疲劳的作用不明显，若是活性成分虫草素和虫草多糖的含量过高，超出合理范围，也会在治疗过程中产生负作用，影响疗效。
综上所述，本发明经过稳定性考察结果表明，在有效期内质量稳定可靠，并在增强免疫力、缓解体力疲劳上具有巨大应用价值，能够提高人们的健康水平，改善免疫力低下者和体力易疲劳者的生活质量。
Claims (10)
1.一种抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，该蛹虫草食品为100％的蛹虫草，所述的蛹虫草中虫草素含量可达4.24ωt％，虫草多糖含量可达19.93ωt％。
2.根据权利要求1所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的蛹虫草食品的剂型包括胶囊剂、片剂、颗粒剂或散剂。
3.根据权利要求1所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的蛹虫草，是将光照培养形成的蛹虫草子实体加工制成。
4.根据权利要求3所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的蛹虫草光照培养经过以下步骤：
(1)培养基的配制：在一万级净化条件下，将大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐混合，经灭菌后，形成培养基；
(2)菌丝接种：在百级净化条件下，将蛹虫草菌液接种至培养基中；
(3)暗培养：在十万级净化条件下，将接种蛹虫草菌液后的培养基放置于培养室，在避光条件下进行培养，在培养过程中进行消毒灭菌；
(4)光照培养：当暗培养的培养基上长出白色菌丝后，在十万级净化条件下，将培养室置于光照条件下进行培养，逐渐生成蛹虫草子实体，在培养过程中进行消毒灭菌；
(5)蛹虫草子实体采收：将培养完成的蛹虫草子实体收集。
5.根据权利要求4所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的培养基中大米、黄豆粉、水、番茄汁和无机盐的质量体积比为750g:(20-40)g:(900-1000)ml:(50-100)ml:(1-2)g；所述的蛹虫草菌液与大米的体积质量比为(80-90)ml:750g。
6.根据权利要求4所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的无机盐包括磷酸氢二钾、硫酸镁或硫酸锰中的一种或多种。
7.根据权利要求6所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的无机盐为磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，所述的磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰的质量浓度之比为(2-3):(0.2-0.4):(0.03-0.05)。
8.根据权利要求4所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的灭菌包括湿热灭菌，湿热灭菌温度为125-130℃，压力为0.1-0.2MPa，时间为35-40min；所述的暗培养的温度为18-20℃，空气相对湿度为60-75％，时间为5-6天。
9.根据权利要求4所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的光照培养的光源的波长为510-550nm。
10.根据权利要求4所述的抗疲劳、提高免疫力的人工蛹虫草食品，其特征在于，所述的光照培养的光照强度为400-800lux，温度为20-23℃，空气相对湿度65-75％，光照时长为8-9h/天，培养时间为20-22天。
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