CN114891742A - 一种强杀伤性nk细胞的培养基及体外扩增方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种强杀伤性NK细胞培养基。本发明公开了一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5‑15μg/mL抗Her‑2单克隆抗体、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mLIGF‑1等，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、900‑1100U/mL重组人IL‑2、25‑35ng/mL重组人IL‑15、5‑15ng/mL重组人IL‑21，继续培养；培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
Description
技术领域
本发明涉及NK细胞培养技术领域，尤其涉及一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法。
背景技术
随着肿瘤学、免疫学以及分子生物学等相关学科的迅速发展和交叉渗透，肿瘤免疫治疗的研究突飞猛进，以免疫学原理为基础、以细胞生物学技术为方法而建立起来的肿瘤免疫细胞治疗，已经从实验室研究逐渐向有效、安全的临床应用过渡。
NK细胞是除T、B细胞之外的第三类淋巴细胞，具有独特功能的细胞亚群。NK细胞是机体重要的免疫效应细胞，在抵抗肿瘤和病毒感染等方面起着非常重要的作用。近年来，关于NK细胞及其抗肿瘤功能的研究已经成为免疫学和肿瘤学研究的热点内容之一。
在外周血淋巴细胞中NK细胞含量只有10％左右，NK细胞在外周血中的含量远不能满足临床需要，目前主要利用细胞因子的刺激来扩增NK细胞，但上述方法扩增的NK细胞与临床需求仍存在一定的差距。
虫草素又称冬虫夏草素、虫草菌素、蛹虫草菌素，别名3’-脱氧腺苷，目前发现其具有抗菌、抗炎、抗病毒、抗肿瘤及免疫调节等多种药理活性；目前还未报道其对NK细胞的杀伤活力和增质的影响。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术中存在的缺点，而提出的一种强杀伤性NK细胞的培养基及体外扩增方法。
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为8-12g/L，尼克酰胺浓度为2.5-7.5mmol/L，来那度胺浓度为0.5-2.0μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为8-16mmol/L，虫草素浓度为0.1-0.5g/L。
优选地，虫草素和来那度胺的质量比为2000-4000：2.59-4.66。
优选地，尼克酰胺和来那度胺的摩尔比为4500-6500：1-1.8
优选地，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为10-14mmol/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；
继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5-15μg/mL抗Her-2单克隆抗体、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL IGF-1、5-15ng/mL OKT-3，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL重组人IL-15、5-15ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
优选地，S2中，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％。
优选地，S2中，抗Her-2单克隆抗体浓度为5-15μg/mL
优选地，S2中，OKT-3浓度为8-12ng/mL。
优选地，S3中，重组人IL-2浓度为950-1050U/mL。
优选地，S3中，重组人IL-15浓度为28-32ng/mL。
本发明的技术效果如下所示：
本申请人通过大量的试验发现，虫草素不仅可显著促进NK细胞的体外增殖，同时配合来那度胺作用，两者协调作用，可显著提高NK细胞的杀伤活性。相比单独添加来那度胺或虫草素，NK细胞经过14天培养可最高扩增至2700倍；同时来那度胺与虫草素复配对K562的杀伤活性在40：1的效靶比时达到了92.5％。
利用本发明的NK细胞培养基及体外扩增NK细胞的方法，不仅可扩增出数量大、活性高、杀伤性强的NK细胞，同时扩增方法简单，适于推广应用。
附图说明
图1为实施例5和对比例的增殖曲线对比图。
图2为实施例5扩增方法培养14天的NK细胞稀释2000倍后的照片及分析结果图。
图3为实施例5和对比例的杀伤活性对比图。
图4为实施例5的细胞流式散点图。
图5为实施例5和对比例的纯度对比图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步解说。
实施例1
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为8g/L，尼克酰胺浓度为7.5mmol/L，来那度胺浓度为0.5μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为16mmol/L，虫草素浓度为0.1g/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及15μg/mL抗Her-2单克隆抗体、900U/mL重组人IL-2、35ng/mL IGF-1、5ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、1100U/mL重组人IL-2、25ng/mL重组人IL-15、15ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
实施例2
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为12g/L，尼克酰胺浓度为2.5mmol/L，来那度胺浓度为2.0μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为8mmol/L，虫草素浓度为0.5g/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5μg/mL抗Her-2单克隆抗体、1100U/mL重组人IL-2、25ng/mL IGF-1、5-15ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、1100U/mL重组人IL-2、25ng/mL重组人IL-15、15ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
实施例3
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为9g/L，尼克酰胺浓度为6.5mmol/L，来那度胺浓度为1μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为14mmol/L，虫草素浓度为0.2g/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及12μg/mL抗Her-2单克隆抗体、950U/mL重组人IL-2、32ng/mL IGF-1、8ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、1050U/mL重组人IL-2、28ng/mL重组人IL-15、12ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
实施例4
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为11g/L，尼克酰胺浓度为4.5mmol/L，来那度胺浓度为1.8μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为10mmol/L，虫草素浓度为0.4g/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及8μg/mL抗Her-2单克隆抗体、1050U/mL重组人IL-2、28ng/mL IGF-1、12ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、950U/mL重组人IL-2、32ng/mL重组人IL-15、8ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
实施例5
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；人血清白蛋白浓度为10g/L，尼克酰胺浓度为5.5mmol/L，来那度胺浓度为1.4μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为12mmol/L，虫草素浓度为0.3g/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及10μg/mL抗Her-2单克隆抗体、1000U/mL重组人IL-2、30ng/mL IGF-1、10ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、1000U/mL重组人IL-2、30ng/mL重组人IL-15、10ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
对比例
一种强杀伤性NK细胞培养基，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸；人血清白蛋白浓度为10g/L，尼克酰胺浓度为5.5mmol/L，来那度胺浓度为1.4μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为12mmol/L。
一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于上述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及10μg/mL抗Her-2单克隆抗体、1000U/mL重组人IL-2、30ng/mL IGF-1、10ng/mL OKT-3，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加上述强杀伤性NK细胞培养基、1000U/mL重组人IL-2、30ng/mL重组人IL-15、10ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
配制0.4％台盼蓝溶液，调节其pH值至7.0～7.2，分别取实施例5和对比例的扩增方法培养的NK细胞，分别在第0天、第1天、第3天、第5天、第7天，第9天、第11天、第14天取50μLNK细胞悬液，加入50μL台盼蓝混合，细胞染色4min，细胞计数板计数细胞总数量。
其增殖曲线如图1所示，NK细胞从第7天左右迅猛增长，而实施例5的NK细胞增殖速度明显优于对比例。采用实施例5扩增方法培养14天，将所收集的NK细胞稀释2000倍后进行拍照、分析，如图2所示。
采用96孔平底培养板，设实验孔、单纯效应细胞孔、单纯靶细胞孔各3个，并设空白孔。于实验孔及单纯靶细胞孔，加入K562。在实验孔及单纯效应细胞孔中分别加入实施例1和对比例培养14天的NK细胞，效靶比设为5：1、10：1、20：1和40：1四组，培养24h。加入20μLWST，继续培养4h，酶标仪检测OD值。
杀伤活性(％)＝[1-(实验组OD值-单纯效应细胞组OD值)×单纯靶细胞OD值]×100％。
由图3可以看出，在5：1～40：1效靶比范围内，各组NK细胞具有较强的杀伤活性，并且效靶比越高，其杀伤活性越强；同时实施例5的杀伤活性在相同效靶比时始终高于对比例。
分别取实施例5和对比例方法培养的NK细胞，采用流式检测仪进行细胞纯度检测，具体操作如下：
(1)单细胞悬液的制备：将1×105-1×107的细胞放入1.5mL离心管中3000r/min转速下离心5分钟，弃去上清，加入FACS缓冲液100μL悬浮细胞；
(2)荧光抗体20μL，避光30分钟；
(3)洗细胞去除游离的荧光抗体；加入FACS缓冲液350μL，轻轻混匀，于3000r/min条件下离心5分钟，弃上清；
(4)上样前处理：取100μL仪器缓冲液加入步骤(3)获得的细胞沉淀中，轻轻混匀悬浮细胞，将细胞悬液移入FACS专用管中，准备进行仪器检测和分析，结果如图4和图5所示，采用实施例5方法扩增的NK细胞纯度远高于对比例。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种强杀伤性NK细胞培养基，其特征在于，以Cellgro基础培养基为基础，向其中添加人血清白蛋白、尼克酰胺、来那度胺、4-羟乙基哌嗪乙磺酸和虫草素；
人血清白蛋白浓度为8-12g/L，尼克酰胺浓度为2.5-7.5mmol/L，来那度胺浓度为0.5-2.0μmol/L，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为8-16mmol/L，虫草素浓度为0.1-0.5g/L。
2.根据权利要求1所述强杀伤性NK细胞培养基，其特征在于，虫草素和来那度胺的质量比为2000-4000：2.59-4.66。
3.根据权利要求1所述强杀伤性NK细胞培养基，其特征在于，尼克酰胺和来那度胺的摩尔比为4500-6500：1-1.8 。
4.根据权利要求1所述强杀伤性NK细胞培养基，其特征在于，4-羟乙基哌嗪乙磺酸浓度为10-14mmol/L。
5.一种强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1、将外周血进行分离得到PBMC细胞；将PBMC细胞进行磁珠分选得到NK细胞；
S2、将NK细胞悬于如权利要求1-4所述强杀伤性NK细胞培养基中，然后转移至细胞培养瓶中；
继续向细胞培养瓶中加入自体血浆及5-15μg/mL抗Her-2单克隆抗体、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL IGF-1、5-15ng/mL OKT-3，然后将细胞培养瓶置于培养箱中培养；
S3、每隔3天补加如权利要求1-4所述强杀伤性NK细胞培养基、900-1100U/mL重组人IL-2、25-35ng/mL重组人IL-15、5-15ng/mL重组人IL-21，继续培养；
S4、培养14天后，从培养袋中取出细胞，获得强杀伤性NK细胞。
6.根据权利要求5所述强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，S2中，自体血浆体积占细胞培养瓶体积为20％。
7.根据权利要求5所述强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，S2中，抗Her-2单克隆抗体浓度为5-15μg/mL。
8.根据权利要求5所述强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，S2中，OKT-3浓度为8-12ng/mL。
9.根据权利要求5所述强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，S3中，重组人IL-2浓度为950-1050U/mL。
10.根据权利要求5所述强杀伤性NK细胞的体外扩增方法，其特征在于，S3中，重组人IL-15浓度为28-32ng/mL。
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