CN105695529A - 一种制备灵芝胞外多糖的方法 - Google Patents

一种制备灵芝胞外多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种制备灵芝胞外多糖的方法。本发明提供的制备灵芝胞外多糖的方法，包括如下步骤：将灵芝菌种接种于发酵培养基中，培养；所述发酵培养基由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。本发明还保护一种用于制备灵芝胞外多糖的发酵培养基，由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。本发明的优势在于：(1)在培养基中添加木质素类物质，可有效地提高发酵液中胞外多糖的产量；(2)发酵工艺简单，发酵时间相对较短，生产效率相对较高，适合工业化生产；(3)栎木粉是培养灵芝子实体原料的废弃物，汉麻杆是去除汉麻皮和汉麻叶后的废弃物，且均无毒副作用，添加量较少，原料成本较低。

Description

一种制备灵芝胞外多糖的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种制备灵芝胞外多糖的方法，具体涉及一种微生物液态深层培养过程中提高胞外多糖产量的发酵工艺。
背景技术
灵芝(GanodermaLucidum)别名“瑞芝”、“仙草”，是一种药食两用的真菌，在我国灵芝入药已有两千多年的历史。灵芝中含有多种生物活性成分，如多糖、三萜类化合物、核苷类、生物碱类和甾醇类等，具有抗肿瘤、调节免疫、抗氧化和清除自由基的作用，且对于慢性支气管炎、冠心病、糖尿病、神经衰弱等疾病都有一定的疗效。灵芝多糖是灵芝主要的活性成分之一，具有调节机体免疫力、抗肿瘤、消除体内自由基、抗氧化、抗衰老、保肝护肝、利胆清热、活血化瘀等功效。
灵芝多糖的来源主要有两种：人工栽培的灵芝子实体和孢子粉、液态发酵的灵芝菌丝体。液态发酵灵芝菌丝体与人工栽培灵芝相比，具有周期短、产量大、产品质量稳定等特点，且通过液体深层发酵培养灵芝菌丝体，所得的产品苦味小，营养价值及有效成分不低于子实体甚至有些指标高于子实体，其中菌丝体中的粗多糖及多糖含量均高于子实体。因此，灵芝液态发酵是目前国内外应用的一种工业化生产灵芝多糖的方法。近年来，灵芝液态发酵的研究取得了很大的进展，但如何更进一步的提高灵芝多糖的产量，降低生产成本，提高经济效益，成为一个亟待解决的问题。
可通过两种方法提高灵芝多糖的产量：一是对发酵培养基及发酵过程进行优化，不同的培养基配方和培养条件能够影响菌丝体生长和活性成分如胞外多糖的积累。适当的碳源、氮源、无机盐离子和生长因子种类和浓度，合适的培养基配比以及初始pH值均有利于灵芝菌丝体的发酵和多糖的合成；二是在培养基中添加外源物质来促进胞外多糖的合成，提高胞外多糖的产量。如HailongYang等(StimulatoryeffectsofCoixlacryma-jobioilonthemycelialgrowthandmetabolitesbiosynthesisbythesubmergedcultureofGanodermalucidum.BiochemicalEngineeringJournal76(2013)77–82)研究表明在发酵培养基中添加2％的薏米油，胞外多糖产量是未添加薏米油时的2.2倍；谭才邓等(灵芝液体发酵产胞内多糖的培养基优化.现代食品科技，2013，29(3)：549-552.)研究发现维生素B1对灵芝菌丝生长与多糖含量影响较大，且维生素B1的最佳使用浓度为0.1％，此时菌丝生物量和多糖产量均达到最高。
发明内容
本发明的目的是提供一种制备灵芝胞外多糖的方法。
本发明提供的制备灵芝胞外多糖的方法，包括如下步骤：
将灵芝菌种接种于发酵培养基中，培养；
所述发酵培养基由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
所述碳源具体可为葡萄糖。
所述氮源具体可为酵母粉。
所述无机盐具体可为镁盐和钾盐。所述镁盐具体可为MgSO4和/或水合MgSO4。所述钾盐具体可为KH2PO4和/或水合KH2PO4。所述水合MgSO4具体可为MgSO4·7H2O。
所述提供木质素的原料具体可为汉麻杆粉或栎木粉。
所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.0-4.0％，酵母粉的质量百分含量可为1.0-3.0％，镁盐的质量百分含量可为0.05-0.2％，钾盐的质量百分含量可为0.1-0.3％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为0.5-5.0％。
所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.5-3.0％，酵母粉的质量百分含量可为1.5％，镁盐的质量百分含量可为0.1％，钾盐的质量百分含量可为0.2％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为1.0-3.0％。
所述发酵培养基具体可为如下(Ⅰ)至(Ⅷ)中的任意一种：
(Ⅰ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅱ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅲ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅳ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅴ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅵ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅶ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅷ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水。
所述培养的条件可为：25-30℃、130-180rpm振荡培养4-7天。
所述培养的条件具体可为：28℃、180rpm振荡培养5天。
所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，收集液相，进行乙醇沉淀并收集沉淀。所述乙醇沉淀的方法具体可为：将1体积份所述液相与4体积份95％(质量百分含量)乙醇水溶液混合，然后4℃静置12小时。
所述收集沉淀的方法具体可为：10000rpm离心20min。
所述方法中，所述“将灵芝菌种接种于发酵培养基中”指的是将种子液接种于发酵培养基中。所述种子液的制备方法为：将灵芝菌种接种至种子培养基，28℃，180rpm振荡培养，得到菌浓度为3-4mg/mL的种子液(3-4mg指的是菌体干重)。种子培养基(pH6.0)：葡萄糖20g/L、酵母粉5.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L，余量为水。所述方法中，具体将15mL所述种子液接种至135mL所述发酵培养基。
本发明还保护一种用于制备灵芝胞外多糖的发酵培养基，由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
所述碳源具体可为葡萄糖。
所述氮源具体可为酵母粉。
所述无机盐具体可为镁盐和钾盐。所述镁盐具体可为MgSO4和/或水合MgSO4。所述钾盐具体可为KH2PO4和/或水合KH2PO4。所述水合MgSO4具体可为MgSO4·7H2O。
所述提供木质素的原料具体可为汉麻杆粉或栎木粉。
所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.0-4.0％，酵母粉的质量百分含量可为1.0-3.0％，镁盐的质量百分含量可为0.05-0.2％，钾盐的质量百分含量可为0.1-0.3％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为0.5-5.0％。
所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量可为2.5-3.0％，酵母粉的质量百分含量可为1.5％，镁盐的质量百分含量可为0.1％，钾盐的质量百分含量可为0.2％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量可为1.0-3.0％。
所述发酵培养基具体可为如下(Ⅰ)至(Ⅷ)中的任意一种：
(Ⅰ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅱ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅲ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅳ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅴ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅵ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅶ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅷ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水。
以上任一所述灵芝具体可为“沪农灵芝1号”(即上海市农业科学院食用菌研究所的“沪农灵芝1号”)。
以上任一所述栎木粉具体可为：将干燥的栎树木材粉碎成粒径为50-150目的粉末。
以上任一所述汉麻杆粉具体可为：将干燥的汉麻杆粉碎成粒径为50-150目的粉末。
本发明的优势在于：
(1)在培养基中添加木质素类物质，可有效地提高发酵液中胞外多糖的产量，其胞外多糖产量是未添加木质素类物质的1-2倍；
(2)发酵工艺简单，发酵时间相对较短，生产效率相对较高，适合工业化生产；
(3)栎木粉是培养灵芝子实体原料的废弃物，汉麻杆是去除汉麻皮(主要为麻纤维)和汉麻叶(用作提取)后的废弃物，且均无毒副作用，添加量较少，原料成本较低。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中所用的灵芝(Ganodermalucidum)为上海市农业科学院食用菌研究所的“沪农灵芝1号”。栎木粉：将干燥的栎树木材粉碎成粒径为50-150目的粉末。汉麻杆粉：将干燥的汉麻杆粉碎成粒径为50-150目的粉末。
种子液：灵芝菌种接种至种子培养基，28℃，180rpm振荡培养，得到菌浓度为3-4mg/mL的种子液(3-4mg指的是菌体干重)。种子培养基(pH6.0)：葡萄糖20g/L、酵母粉5.0g/L、KH2PO41.0g/L、MgSO4·7H2O1.0g/L，余量为蒸馏水。
实施例中所用的溶液，如无特殊说明，均为水溶液。
实施例中采用苯酚-硫酸法检测胞外多糖，描述有苯酚-硫酸法的参考文献如下：范传颍,陶正明,吴志刚.苯酚硫酸法与蒽酮硫酸法测定铁皮石斛中多糖含量的比较[J].浙江农业科学，2013(7)：799-801。
实施例1、
液体培养基Ⅰ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、栎木粉1.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅰ：不含有栎木粉，其它同液体培养基Ⅰ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅰ(或对照培养基Ⅰ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅰ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.05mg/mL。采用液体培养基Ⅰ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.62±0.08mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅰ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅰ的1.2倍。
实施例2、
液体培养基Ⅱ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、栎木粉2.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅱ：不含有栎木粉，其它同液体培养基Ⅱ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅱ(或对照培养基Ⅱ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅱ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅱ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为2.0±0.03mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅱ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅱ的1.5倍。
实施例3、
液体培养基Ⅲ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、栎木粉3.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅲ：不含有栎木粉，其它同液体培养基Ⅲ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅲ(或对照培养基Ⅲ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅲ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅲ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为2.40±0.03mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅲ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅲ的1.8倍。
实施例4、
液体培养基Ⅳ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、汉麻杆粉1.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅳ：不含有汉麻杆粉，其它同液体培养基Ⅳ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅳ(或对照培养基Ⅳ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅳ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅳ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.75±0.05mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅳ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅳ的1.3倍。
实施例5、
液体培养基Ⅴ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、汉麻杆粉2.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅴ：不含有汉麻杆粉，其它同液体培养基Ⅴ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅴ(或对照培养基Ⅴ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅴ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL)。采用液体培养基Ⅴ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为2.0±0.03mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅴ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅴ的1.5倍。
实施例6、
液体培养基Ⅵ(％代表质量百分含量)：葡萄糖3.0％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、汉麻杆粉3.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅵ：不含有汉麻杆粉，其它同液体培养基Ⅵ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅵ(或对照培养基Ⅵ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅵ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅵ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为2.56±0.05mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅵ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅵ的1.9倍。
实施例7、
液体培养基Ⅶ(％代表质量百分含量)：葡萄糖2.5％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、栎木粉1.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅶ：不含有栎木粉，其它同液体培养基Ⅶ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅶ(或对照培养基Ⅶ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅶ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅶ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.73±0.10mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅶ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅶ的1.3倍。
实施例8、
液体培养基Ⅷ(％代表质量百分含量)：葡萄糖2.5％、酵母粉1.5％、MgSO4·7H2O0.1％、KH2PO40.2％、汉麻杆粉1.0％，余量为蒸馏水。
对照培养基Ⅷ：不含有汉麻杆粉，其它同液体培养基Ⅷ。
1、将15mL种子液接种至装有135mL液体培养基Ⅷ(或对照培养基Ⅷ)的500mL摇瓶中，28℃、180rpm振荡培养5天。
2、完成步骤1后，取整个发酵体系，进行抽滤并收集液相(收集到的液相的体积为140-146mL)。
3、取5mL步骤2得到的液相，加入4倍体积的95％(体积百分含量)乙醇水溶液，4℃静置12小时，然后10000rpm离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3得到的沉淀，用100mL蒸馏水复溶，得胞外多糖溶液。
5、取步骤4得到的胞外多糖溶液，检测其中的胞外多糖含量。
设置五次重复实验，结果取平均值。
采用对照培养基Ⅷ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.35±0.5mg/mL。采用液体培养基Ⅷ进行上述步骤，步骤4得到的胞外多糖溶液中的胞外多糖浓度为1.87±0.06mg/mL。结果表明，采用液体培养基Ⅷ的胞外多糖产量是采用对照培养基Ⅷ的1.4倍。

Claims (10)

1.一种制备灵芝胞外多糖的方法，包括如下步骤：
将灵芝菌种接种于发酵培养基中，培养；
所述发酵培养基由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：
所述碳源为葡萄糖；
所述氮源为酵母粉；
所述无机盐为镁盐和钾盐；所述镁盐为MgSO4和/或水合MgSO4；所述钾盐为KH2PO4和/或水合KH2PO4；
所述提供木质素的原料为汉麻杆粉或栎木粉。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量为2.0-4.0％，酵母粉的质量百分含量为1.0-3.0％，镁盐的质量百分含量为0.05-0.2％，钾盐的质量百分含量为0.1-0.3％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量为0.5-5.0％。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基中，葡萄糖的质量百分含量为2.5-3.0％，酵母粉的质量百分含量为1.5％，镁盐的质量百分含量为0.1％，钾盐的质量百分含量为0.2％，汉麻杆粉或栎木粉的质量百分含量为1.0-3.0％。
5.如权利要求4所述的方法，其特征在于：所述发酵培养基为如下(Ⅰ)至(Ⅷ)中的任意一种：
(Ⅰ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅱ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅲ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅳ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅴ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为2.0％，余量为水；
(Ⅵ)：葡萄糖的质量百分含量为3.0％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为3.0％，余量为水；
(Ⅶ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、栎木粉的质量百分含量为1.0％，余量为水；
(Ⅷ)：葡萄糖的质量百分含量为2.5％、酵母粉的质量百分含量为1.5％、MgSO4·7H2O的质量百分含量为0.1％、KH2PO4的质量百分含量为0.2％、汉麻杆粉的质量百分含量为1.0％，余量为水。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：
所述培养的条件为：25-30℃、130-180rpm振荡培养4-7天。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：
所述培养的条件为：28℃、180rpm振荡培养5天。
8.如权利要求1至7中任一所述的方法，其特征在于：所述方法还包括如下步骤：完成所述培养后，收集液相，进行乙醇沉淀并收集沉淀。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于：
所述乙醇沉淀的方法为：将1体积份所述液相与4体积份95％乙醇水溶液混合，然后4℃静置12小时；
所述收集沉淀的方法为：10000rpm离心20min。
10.一种用于制备灵芝胞外多糖的发酵培养基，由碳源、氮源、无机盐、提供木质素的原料和水组成。
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