CN110894468A - 一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法 - Google Patents

一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种基于中国被毛孢代谢途径的培养方法。所述方法包括：将中国被毛孢菌种接种至发酵培养基，所述发酵培养基中添加关键差异代谢物质，在10～25℃、100～250rpm条件下培养培养216～240h，发酵结束后，发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后进行虫草酸、虫草素提取。本发明通过在中国被毛孢发酵培养前添加各种关键差异代谢物，可有效提高其主要活性化合物虫草酸与虫草素的含量。从本发明实施例中可以看出，在培养基中添加山梨糖醇可以使虫草酸的含量由59.28mg/g提高至149.38mg/g；在培养基中添加L‑脯氨酸或反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸可使虫草素含量分别由0.1103mg/g提高至0.1622mg/g或0.1687mg/g。

Description

一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法
(一)技术领域
本发明涉及一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法，属于微生物发酵工程技术领域。
(二)背景技术
冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)是冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanus Oberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。冬虫夏草是一类珍惜的传统真菌药材资源，具有代谢产物和生物活性多样的特点，在生物医药领域展现出巨大的应用和发展前景。冬虫夏草因药用功效广泛、明显而备受关注，在世界范围内备受推崇。中医认为，冬虫夏草入肺肾二经，既能补肺阴，又能补肾阳，主治肾虚，阳痿遗精，腰膝酸痛，病后虚弱，久咳虚弱，劳咳痰血，自汗盗汗等，是唯一的一种能同时平衡、调节阴阳的中药。现代药理学已证实，冬虫夏草具有免疫调节、抗菌、抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖血脂、性激素样作用等广泛的生物活性。冬虫夏草菌是一种子囊菌，在其生活史中具有分生孢子阶段(无性型)和子囊孢子阶段(有性型)。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。国内外学者在冬虫夏草资源调查、无性型确证、活性成分分离分析和作用机理、开发应用方面做了大量工作。冬虫夏草中国被毛孢已被证明是冬虫夏草的无性型存在形式，具有与天然冬虫夏草相同的活性成分和药效。天然冬虫夏草生长周期长，生长的环境较为特殊，自然环境也遭到破坏，再加上人为的过度挖掘，使得野生虫草资源面临枯竭，因此人工发酵培养的中国被毛孢菌丝体可作为其替代品。
代谢组学专注于生物系统中的综合代谢物分析，可以为细胞代谢提供独特的见解。许多研究人员利用它来识别代谢物在发酵过程中枯竭或积累，从而制定优化流程和策略以增加产品滴度。目前还没有基于代谢组学和代谢途径分析方法在中国被毛孢中的应用。
(三)发明内容
为了有效提升中国被毛孢活性化合物虫草酸、虫草素的产量，本发明提供了一种基于中国被毛孢代谢途径的培养方法。
本发明采用的技术方案是：
一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法，所述方法包括：将中国被毛孢菌种接种至发酵培养基，所述发酵培养基中添加关键差异代谢物质，在10～25℃、100～250rpm条件下培养培养216～240h，发酵结束后，发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后进行虫草酸、虫草素提取；所述的关键差异代谢物为下列之一：海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸；所述β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加浓度各自独立为3～5mmol/L，海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇的添加浓度各自独立为30～50g/L。所述关键差异代谢物是根据多维分析OPLS-DA，进行VIP值分析后筛选获得的。VIP值大于1的代谢物为差异性较大的代谢物，可以作为显著标志物进行后续分析。海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的VIP值参见图1。实验发现，添加海藻糖、麦芽糖或山梨糖醇可显著提高虫草酸含量，添加氨基酸类物质可显著提高虫草素含量。
所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～60g/L、玉米粉10～30g/L、糊精5～10g/L、酵母粉5～20g/L、麸皮10～30g/L、蚕蛹粉20～40g/L、蛋白胨10～30g/L、硫酸镁0.5～2g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、溶剂为蒸馏水，pH值6～8。
优选的，所述关键差异代谢物为下列之一：L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸或山梨糖醇。
所述L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸优选添加量分别为4mmol/L，山梨糖醇优选添加量为40g/L。
通常的，所述中国被毛孢在发酵培养前先进行活化培养和种子培养获得种子液，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基进行发酵培养。
所述活化培养为：将冬虫夏草中国被毛孢ZJB18002接种至斜面培养基，16℃培养10天，取孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液进行下一步种子培养；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、土豆汁5g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、琼脂粉10g/L，溶剂为双蒸水，pH值自然。
所述种子培养为：将孢子悬液接种至种子培养基中，16℃，150rpm培养96h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、溶剂为蒸馏水，pH值自然。
所述发酵培养获得发酵产物进一步进行虫草酸的提取，提取方法如下：发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后，加入体积浓度20～30％的乙醇水溶液，乙醇水溶液体积用量以干燥沉淀重量计为30～60ml/g沉淀物，30～40℃水浴浸提1～2h，过滤后再重复浸提两次，合并滤液，得到含虫草酸或的提取液。
所述发酵培养获得发酵产物进一步进行虫草素的提取，提取方法如下：发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后，加入无水甲醇，甲醇体积用量以干燥沉淀重量计为50～100ml/g沉淀物，超声破碎，得到含虫草素的提取液。
本发明的有益效果主要体现在：通过在中国被毛孢发酵培养前添加各种关键差异代谢物，可有效提高其主要活性化合物虫草酸与虫草素的含量。从本发明实施例中可以看出，在培养基中添加山梨糖醇可以使虫草酸的含量由59.28mg/g提高至149.38mg/g；在培养基中添加L-脯氨酸或反式-4-羟基-L-脯氨酸可使虫草素含量分别由0.1103mg/g提高至0.1622mg/g或0.1687mg/g。
(四)附图说明
图1为海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的VIP值；
图2为海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对中国被毛孢干重的影响；
图3为海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对虫草酸含量的影响；
图4为海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对虫草素含量的影响；
图5为山梨糖醇的不同添加浓度对虫草酸含量的影响；
图6为L-脯氨酸的不同添加浓度对虫草素含量的影响；
图7为L-丝氨酸的不同添加浓度对虫草素含量的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
对比例：
本发明实施例中所用的菌种为中国被毛Hirsutella sinensis ZJB18002(CCTCCNo：M 2018108)，来自中国典型培养物保藏中心。
中国被毛孢的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
将冬虫夏草中国被毛孢ZJB18002接种至斜面培养基，16℃培养10天，取孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液；将孢子悬液接种至种子培养基中，16℃，150rpm培养96h，获得种子液；
斜面培养基最终浓度组成：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、土豆汁5g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、琼脂粉10g/L，溶剂为双蒸水，pH值自然；
种子培养基终浓度组成：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、溶剂为蒸馏水，pH值自然。
(2)Hirsutella sinensis ZJB 18002发酵培养：
将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在16℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基与种子培养基一致，115℃灭菌30min。
在发酵培养9天时结束发酵，过滤干燥研磨成粉末，称重得干重为7.94g/L。
菌丝体中虫草酸含量检测采用比色法。样品预处理：在10-25℃、150rpm条件下发酵培养，过滤，烘干后提获得虫草酸，具体提取方法为：沉淀干燥后，加入25％(V/V)乙醇水溶液(乙醇水溶液体积用量以干燥沉淀重量计为50ml/g)，40℃水浴浸提1h，过滤后再浸提两次，合并滤液，提取虫草酸；反应检测所用试剂为0.1％鼠李糖(L-鼠李糖100mg用超纯水定容至100ml)、高碘酸钾溶液(15mmol高碘酸钾固体溶于1L0.12mol/L浓盐酸)、Nash溶液(15g乙酸铵、200μl乙酸与200μl乙酰丙酮用超纯水溶解定容至100ml)；反应方法为将浸提的虫草酸溶液稀释10倍后，加入1ml高碘酸钾溶液，25℃反应10min，再加入2ml 0.1％鼠李糖溶液，震荡均匀后加入4ml Nash溶液，53℃反应15min后，取200μl反应液到酶标板上进行检测。检测波长为412nm。
菌丝体中虫草素含量检测采用HLPC法。样品预处理：将菌丝体过滤后放入80℃烘箱烘干后研磨成粉末状，取0.2g菌粉与10ml甲醇混合置于离心管中，超声破碎30min，收集上清液采用0.45μm微滤膜过滤，滤液采用安捷伦HPLC分析。HPLC流动相配制：准确称取1.068g磷酸二氢钠和1.127g磷酸氢二钠，用超纯水溶解并定容至1000mL，调pH为6.5，0.45μm微滤膜过滤,并采用超声波脱除气体。HPLC分析条件：安捷伦HPLC泵，UV3100紫外-可见光检测器，色谱柱为Unitary C18(4.6×250mm)，流动相比例采用磷酸缓冲液:甲醇＝17:3，流速为1.0mL/min，紫外检测波长为260nm，进样量10μL，柱温25℃。
用比色法测得虫草酸含量为59.28mg/g，高效液相色谱测得虫草素含量为0.11mg/g。
实施例1：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，以及4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，过滤并且烘干后称干重。本发明考察了40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对中国被毛孢干重的影响，结果如图2所示，结果表明在培养基中添加40g/L的山梨糖醇时，添加效果结果最好，干重与对照组(7.94g/L)相比，提高了51.7％。
实施例2：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，以及4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，取样检测虫草酸。本发明考察了40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对中国被毛孢虫草酸含量的影响，结果如图3所示，结果表明在培养基中添加40g/L的山梨糖醇时，添加效果结果最好，虫草酸含量与对照组(59.28mg/g)相比，提高了151.99％。
实施例3：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，以及4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，取样液相检测虫草素。本发明考察了40g/L的海藻糖、麦芽糖和山梨糖醇，4mmol/L的β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加对虫草素含量的影响，结果如图4所示，结果表明在培养基中添加4mmol/L的脯氨酸或反式-4-羟基-L-脯氨酸时，添加效果结果最好，虫草素含量与对照组(0.11mg/g)相比，提高了46.8％或52.7％。
实施例4：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入浓度10～60g/L的山梨糖醇，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，取样液相检测虫草素。本发明考察了浓度10～60g/L的山梨糖醇添加对虫草酸含量的影响，结果如图5所示，结果表明在培养基中添加50g/L的山梨糖醇时，添加效果结果最好，虫草酸含量与对照组(59.28mg/g)相比，提高了62.34％，虫草酸含量为96.23mg/g。
实施例5：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入浓度1～6mmol/L的L-脯氨酸，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，取样高效液相检测虫草素。本发明考察了浓度1～6mmol/L的L-脯氨酸添加对虫草素含量的影响，结果如图6所示，结果表明在培养基中添加4mmol/L的脯氨酸时，添加效果结果最好，虫草素含量与对照组(0.11mg/g)相比，提高了46.8％。
实施例6：
基于中国被毛孢代谢途径的发酵生产方法，包括以下步骤：
(1)Hirsutella sinensis ZJB18002种子培养：
从斜面培养基上取一块带灰色孢子菌落接种于一瓶含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，培养温度为16℃，摇床转速150r/min，培养96h，获得种子液；所述种子培养基如对比例所述。
(2)Hirsutella sinensis ZJB18002发酵培养：
在发酵培养基中分别加入浓度1～6mmol/L的L-丝氨酸，将2mL种子液接种到50mL发酵培养基中，发酵容器为250mL三角瓶，在15℃、150r/min条件下摇床培养9天；所述发酵培养基如对比例所述。
在发酵培养第9天时结束发酵，取样高效液相检测虫草素。本发明考察了浓度1～6mmol/L的L-丝氨酸添加对虫草素含量的影响，结果如图7所示，结果表明在培养基中添加2mmol/L的丝氨酸时，添加效果结果最好，虫草素含量与对照组(0.11mg/g)相比，提高了209.2％。

Claims (9)

1.一种基于中国被毛孢代谢途径的发酵培养方法，所述方法包括：将中国被毛孢菌种接种至发酵培养基，所述发酵培养基中添加关键差异代谢物质，在10～25℃、100～250rpm条件下培养培养216～240h，发酵结束后，发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后进行虫草酸、虫草素提取；所述的关键差异代谢物为下列之一：海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇、β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸；所述β-丙氨酸、L-脯氨酸、L-亮氨酸、L-蛋氨酸、L-缬氨酸、L-半胱氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸、L-丝氨酸的添加浓度各自独立为3～5mmol/L，海藻糖、麦芽糖、山梨糖醇的添加浓度各自独立为30～50g/L。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养基终浓度组成如下：葡萄糖20～60g/L、玉米粉10～30g/L、糊精5～10g/L、酵母粉5～20g/L、麸皮10～30g/L、蚕蛹粉20～40g/L、蛋白胨10～30g/L、硫酸镁0.5～2g/L、磷酸二氢钾0.5～2g/L、溶剂为蒸馏水，pH值6～8。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述关键差异代谢物为下列之一：L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸或山梨糖醇。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述L-脯氨酸、反式-4-羟基-L-脯氨酸添加量分别为4mmol/L，山梨糖醇添加量为40g/L。
5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述中国被毛孢在发酵培养前先进行活化培养和种子培养获得种子液，再将种子液以体积浓度2～10％的接种量接种至发酵培养基进行发酵培养。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于所述活化培养为：将冬虫夏草中国被毛孢ZJB18002接种至斜面培养基，16℃培养10天，取孢子，使用棉花棒将表面孢子洗脱至无菌水中，将洗下的孢子悬液用含有棉花的注射器过滤，过滤后的孢子12000rpm离心5min后去上清液，加入无菌水重悬后，12000rpm离心5min重新洗脱一次，用无菌水重悬作为孢子悬液进行下一步种子培养；所述斜面培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、土豆汁5g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、琼脂粉10g/L，溶剂为双蒸水，pH值自然。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于所述种子培养为：将孢子悬液接种至种子培养基中，16℃，150rpm培养96h，获得种子液；所述种子培养基终浓度组成为：葡萄糖20g/L、玉米粉10g/L、糊精5g/L、酵母粉5g/L、麸皮10g/L、蚕蛹粉20g/L、蛋白胨10g/L、硫酸镁0.5g/L、磷酸二氢钾0.5g/L、溶剂为蒸馏水，pH值自然。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养获得发酵产物进一步进行虫草酸的提取，提取方法如下：发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后，加入体积浓度20～30％的乙醇水溶液，乙醇水溶液体积用量以干燥沉淀重量计为30～60ml/g沉淀物，30～40℃水浴浸提1～2h，过滤后再重复浸提两次，合并滤液，得到含虫草酸提取液。
9.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述发酵培养获得发酵产物进一步进行虫草素的提取，提取方法如下：发酵产物经过滤、烘干、研磨成粉后，加入无水甲醇，甲醇体积用量以干燥沉淀重量计为50～100ml/g沉淀物，超声破碎，得到含虫草素的提取液。
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