CN112126592A - 一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用，该中国被毛孢诱变株命名为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)ZJB19050，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020117，保藏日期为2020年5月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学；邮编为430072。本发明利用原生质体技术对原始中国被毛孢菌株ZJB18002进行物理、化学等诱变方式，得到了诱变株；该诱变株的代谢产物尿苷产量提高约1.13倍，鸟苷产量提高0.67倍，腺苷产量提高1.60倍，使虫草的生产成本降低，有利于中国被毛孢的广泛推广和应用。

Description

一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用

技术领域

本发明涉及冬虫夏草无性型中国被毛孢菌株筛选技术领域，尤其涉及一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用。

背景技术

冬虫夏草(Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.)作为重要的食用菌，是麦角菌科真菌冬虫夏草菌寄生在鳞翅目(Lepidoptera)蝙蝠蛾科昆虫(Hepialus armoricanusOberthur)幼虫上的子座及幼虫尸体上的复合体(包括子座和虫体)。其与人参、鹿茸同被誉为中国三大名贵滋补中药，有“百药之王”的美称。冬虫夏草是作为名贵滋补药材，其营养成分含有核苷、虫草素、虫草酸、多糖、喷斯他汀和新型类胡萝卜素等，具有抗疲劳，抗炎，抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、特性免疫调节、降血糖血脂等广泛的药理作用。在临床上对肺虚久咳，气喘，肺结核咯血，盗汗，肾虚腰膝酸痛，阳痿遗精，神经衰弱及化疗、放疗后的红细胞下降都有疗效。

冬虫夏草菌是一种子囊菌，其在蝙蝠蛾幼虫体内形成菌核到长出冬虫夏草子座和子囊，这过程属于冬虫夏草有性型阶段，此时的冬虫夏草称有性型。从冬虫夏草的子囊孢子发芽成菌丝(或产生分生孢子——发芽成菌丝)侵染蝙蝠蛾幼虫，到冬虫夏草菌丝在幼虫体内增殖、消化吸收幼虫体全部营养的过程属冬虫夏草菌种无性增殖阶段。而在人工培养、液体发酵等实际生产中使用的是无性阶段的冬虫夏草菌，因而冬虫夏草无性型的鉴定非常重要。经过多年争论，2005年10月，中国菌物学会在北京召开了《冬虫夏草及其无性型研讨会》，确定中国被毛孢(Hirsutella sinensis)为冬虫夏草唯一无性型菌种。中国被毛孢人工发酵培养得到的菌丝经药理学和毒理学等研究，均证明与天然虫草化学组成、药理作用基本一致，可替代天然虫草生产虫草制品，以弥补自然资源的短缺。

核苷类物质为冬虫夏草有效成分之一，尿苷、鸟苷、肌苷和腺苷为冬虫夏草的主要核苷类成分，其含量占总核苷量的50％以上，尤以腺苷具有明显的药理作用，如改善心脑血液循环、防止心律失常、抑制神经递质释放和调节腺苷酸环化酶活性等。腺苷已被用作冬虫夏草的质控指标，人工虫草的含量高于天然虫草。

发明内容

本发明提供了一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用，该中国被毛孢诱变株ZJB19050是运用原生质体技术对原始中国被毛孢菌株ZJB18002进行物理、化学诱变而获得，其核苷产量显著高于原始菌株，尤其是腺苷、鸟苷和尿苷的含量使虫草的生产成本显著降低，有利于中国被毛孢的广泛推广和应用。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种中国被毛孢诱变株，命名为中国被毛孢(Hirsutellasinensis)ZJB19050，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020117，保藏日期为2020年5月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学；邮编为430072。

上述中国被毛孢诱变株由原始株ZJB18002依次经ARTP诱变和EMS诱变获得。与原始株ZJB18002相比，诱变株中尿苷的产量提高1.13倍，鸟苷产量提高0.67倍，腺苷产量提高1.6倍。原始株ZJB18002，也保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期2018年3月8日，保藏编号CCTCC NO.M 2018108。

具体的，所述中国被毛孢诱变株的18S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明还提供了所述的中国被毛孢诱变株在生产核苷中的应用。

进一步地，所述核苷为腺苷、鸟苷和尿苷中的至少一种。

具体的，本发明提供的所述的应用，包括以下步骤：

(1)对权利要求1所述的中国被毛孢诱变株进行活化培养，得到活化菌体；

(2)将所述活化菌体接种至种子培养基中，进行种子培养，得到种子液；

(3)将所述种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到含核苷的菌体；

(4)将步骤(3)所述含核苷的菌体进行干燥，提取菌体中的核苷。

进一步地，步骤(1)中，所述活化培养的方法为：将权利要求1所述的中国被毛孢诱变株接种至加富培养基平板上，15～17℃下培养6～8天。

进一步地，步骤(2)中，所述种子培养的条件为：15～17℃，140～160rpm下培养20～22天；

所述种子培养基的终浓度组成为：蚕蛹粉10～30g/L，麸皮10～25g/L，玉米粉10～25g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，糊精3～10g/L，琼脂5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。

进一步地，步骤(3)中，所述发酵培养的温度为15～25℃，转速为140～160rpm；

所述发酵培养培养基的终浓度组成为：葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，糊精3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明利用原生质体技术对原始中国被毛孢菌株ZJB18002进行物理、化学等诱变方式，得到了诱变株中国被毛孢(Hirsutella sinensis)ZJB19050 CCTCC M 2020117；该诱变株的代谢产物尿苷产量提高约1.13倍，鸟苷产量提高0.67倍，腺苷产量提高1.60倍，使虫草的生产成本降低，有利于中国被毛孢的广泛推广和应用。

(2)本发明还提供了诱变株中国被毛孢(Hirsutella sinensis)ZJB19050 CCTCCM 2020117与原始株ZJB18002的形态学观察结果、18S rDNA序列以及Biolog代谢指纹图谱；并且本发明利用的诱变技术对于冬虫夏草菌的诱变有重要的指导意义。

附图说明

图1为实施例3中固体培养基上单菌落形态的图片。

图2为实施例3中发酵培养基上菌落形态的图片；

其中，A为中国被毛孢原始株ZJB18002；B为中国被毛孢诱变株ZJB19050 CCTCC M2020117。

图3为实施例3中诱变株ZJB19050 CCTCC M 2020117的18S rDNA序列PCR扩增argrose电泳图。

图4为实施例3中诱变株ZJB19050 CCTCC M 2020117的18S rDNA系统发育树的结果图。

图5为实施例6提供的发酵稳定性实验图；

其中，Passage number为传代数；Nucleside content为核酸含量；adenosine为腺苷；guansine为鸟苷；uridine为尿苷。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步描述，以下列举的仅是本发明的具体实施例，但本发明的保护范围不仅限于此。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂。

实施例1中国被毛孢原始株ZJB18002的活化培养及原生质体制备

1、菌丝的培养与纯化

取中国被毛孢菌丝体ZJB18002，其来自浙江工业大学生物工程研究所，将其接种于种子培养基中，于11～26℃，60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，11～26℃，60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体。

种子培养基的组成为每升培养基含蚕蛹粉10～30g，麸皮10～25g，玉米粉10～25g，葡萄糖10～30g，酵母粉3～10g，糊精3～10g，蛋白胨5～20g，磷酸二氢钾0.05～2g，无水硫酸镁0.05～2g。

发酵培养基的组成为每升培养基含葡萄糖10～30g，酵母粉3～10g，糊精3～10g，蛋白胨5～20g，磷酸二氢钾0.05～2g，无水硫酸镁0.05～2g，余量为水。

2、原生质体的制备

向纯化后的中国被毛孢菌丝体中加入复合酶液(1～5mL/g菌丝体)，于水浴摇床中16～30℃，80～150rpm下加入1～5％溶壁酶，酶解0.5～3h，用擦镜纸过滤菌丝收集原生质体，在离心机3000～5000rpm下用0.6～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤原生质体2～3次，将原生质体重悬于0.6～1.0mol/L氯化钾溶液中。

利用血球计数板计数：取制备好的原生质体悬液于血球计数板上，放在显微镜下进行计数，取左上，左下，右上，右下和中间五个点进行计数，然后利用公式得到原生质体悬液中的原生质体数，稀释控制原生质体数约为10⁷/mL。

实施例2高产核苷突变株的筛选

1、ARTP诱变方法

取实施例1中的原生质体悬液，采用高纯氦气作为ARTP的工作气体，在电源功率40W，照射距离2mm，气流量12.5L/min条件下，对10μL原生质体(10⁶～10⁷)CFU个/mL悬液进行诱变处理，选择照射时间为20s、40s、60s、80s、100s、120s和140s，将经ARTP诱变的原生质体用0.6M KCl渗透压稳定剂稀释至10⁵后涂板于MYG再生培养基，16℃培养21天，初步挑取菌落较大的单菌落，加入发酵培养基进行发酵，收集菌体检测各核苷产量，直至获得高产突变株。突变次数、突变率和致死率如表1所示。

表1 ARTP诱变方法诱变过程

2、EMS诱变方法

将ARTP诱变方法筛选的高产突变菌株按照实施例1方法制备原生质体悬液5mL，再使用EMS处理。

处理方式：每1mL菌体悬液使用含5mg/mL甲基磺酸乙酯(EMS)的50mM、pH7.0的PBS缓冲液搅拌0.5h，4000rpm离心5min，收集菌体使用无菌水清洗3次，重悬后并立即浸入冰水中2h后，取样涂布于再生培养基平板中，16℃避光培养，初步筛选菌落较大的菌株，挑取单菌落，进行发酵，收集菌体通过HPLC方法检测核苷产量，直至获得各核苷产量提升明显的突变株。突变次数、突变率和致死率如表2所示。

表2 EMS诱变过程

步骤1和2为一轮突变，对于每轮诱变获得的高产菌株，重新作为初始菌株按照上述方法进行复合诱变。从300个突变体中经3轮筛选，筛选获得腺苷、鸟苷和尿苷产量为3.36mg/g、2.7mg/g和6.46mg/g，最终获得产量最高的突变株ZJB19050，即中国被毛孢(Hirsutella sinensis)ZJB19050，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC M 2020117，保藏日期为2020年5月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学；邮编为430072。

实施例3中国被毛孢ZJB19050高产核苷突变株的鉴定

1、中国被毛孢ZJB19050形态学鉴定

对高产菌体在基本培养基的生长情况和单菌落形态进行观察，了解微生物的形态。经鉴定，菌丝体生长缓慢，斜面大约需培养7d，与原始株ZJB18002相比，其单菌落形态相似，乳白色，培养前期呈绒毛状，后期绒毛状菌丝脱落裸露出光滑皮质状菌落。在液体培养基中都会形成乳白色圆球状细胞簇，但相对于原始菌株ZJB18002菌球大小不一，突变株ZJB19050菌球大小更为均一，发酵后期菌丝更为松散呈絮状，发酵液更为粘稠。如图1和图2所示。

2、中国被毛孢ZJB19050分子生物学鉴定

(1)18S rDNA引物设计

根据真菌保守区域设计一对18S rDNA引物p1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCCG-3’(SEQID NO.2)及p2:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(SEQ ID NO.3)。引物由杭州擎科梓熙生物技术公司合成。

(2)基因组提取

利用FastDNA Spin Kit for Soil试剂盒(美国MP公司)提取微生物基因组DNA。

(3)18S rDNA序列扩增

以基因组DNA为模板，利用通用引物p1和p2进行PCR扩增(美国BioRad公司，PTC200扩增仪)；反应条件为：95℃预变性5min，循环参数为95℃变性30s，56℃复性30s，72℃延伸60s，重复35个循环后，72℃继续延伸10min，最终用0.9％的琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。

(4)目的基因的连接与转化(试剂盒：pMD18-T Vector，TaKaRa code D101A)

1)连接体系：PMD18-T 1μL，Slution1 4μL，目的基因5μL。

2)连接、转化条件：

连接：16℃，16h；灭活：65℃，15min；将10μL反应体系转至感受态细胞JM109中，冰浴30min；热击：42℃，90s；冰浴：2～3min；加入800μL液体LB培养基，37℃，250rpm，1h；涂布LB平板，含Amp抗性(100mg/l)；37℃培养箱培养过夜。

液体LB培养基组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L。

LB平板组成：酵母粉5g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉20g/L。

(5)重组菌筛选：

1)平板挑取单菌落，标号；

2)每个单菌落一半用于接种试管培养；另一半用于菌落PCR；

3)试管培养：5mL液体LB培养基/试管，3μL Amp(100mg/L)/5mL LB；37℃，250rpm培养过夜，获得重组菌；

4)菌落PCR：将单菌落挑至50μL无菌水中，沸水浴30min；

PCR体系为：2X Phanta Max Buffer 25μL，dNTP Mix(10mM)1μL，上下游引物p1、p2(50mM)各1μL，煮沸后的菌液1μL，Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase 1μL，加水20μL补足至50μL的总体系。

5)电泳检测。

(6)质粒提取(试剂盒：AxyPrep质粒DNA小量试剂盒)

1)取2mL步骤(5)中3)培养过夜的培养液，12000g离心1min，弃上清；

2)加250μL Buffer S1(4℃冰箱贮存)，悬浮均匀；

3)加250μL Buffer S2，温和并充分地上下翻转4～6次，使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，时间不宜超过5min；

4)加350μL Buffer S3，温和并充分地翻转混合6～8次，12000g离心10min；

5)将上清转移至制备管(置于2mL离心管(试剂盒提供))，12000g离心1min，弃滤液；

6)加500μL Bufffer W1，12000g离心1min，弃滤液；

7)加700μL Bufffer W2，12000g离心1min，弃滤液，再用700μL Bufffer W2洗涤一次，弃滤液；

8)将制备管置回离心管，12000g离心1min；

9)将制备管移入新的1.5mL离心管(试剂盒提供)，在制备管膜中央加60～80μL超纯水(65℃预热)，室温静置1min，12000g离心1min；

10)-20℃保存。

3、18S rDNA序列检测

提取质粒后，用自动序列仪进行测序，利用软件Blast对18S rDNA测序结果进行同源性分析。以提取到的细胞总DNA为模板，利用设计的引物p1、p2扩增菌株的18S rDNA序列，将PCR产物进行0.9％的琼脂糖凝胶电泳。

从图3可以看出，经PCR扩增成功获得了一长约为0.55kb的片段，符合预期结果。

4、18S rDNA序列的测定与分析

将经PCR扩增的片段克隆到T载体后，抽提质粒后的含有本实验获得的18S rDNA片段的重组质粒，经测序确认片段实际长度。样品的实际长度为552bp，序列如下(SEQ IDNO.1)：

SEQ ZJB19050:552bp；

Composition 119A；196C；152G；85T；0OTHER

PercentaGe:21.6％A；35.6％C；27.5％G；15.4％T；0.0％OTHER

MolecuLar WeiGht(kDa):ssDNA:172.61dsDNA:345.89

ORIGIN

TGCGGAGGGATCATTATCGAGTCACCACTCCCAAACCCCCTGCGAACACCACAGCAGTTGCCTCGGCGGGACCGCCCCGGCGCCCCAGGGCCCGGACCAGGGCGCCCGCCGGAGGACCCCCAGACCCTCCTGTCGCAGTGGCATCTCTCAGTCAAGAAGCAAGCAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAACCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCACTCTGGCGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATCTCAACCCTCGAGCCCCCCGCCTCGCGGCGGCGGGGCCCGGCCTTGGGGGTCACGGCCCCGCGCCGCCCCCTAAACGCAGTGGCGACCCCGCCGCGGCTCCCCTGCGCAGTAGCTCGCTGAGAACCTCGCACCGGGAGCGCGGAGGCGGTCACGCCGTGAAACCACCACACCCTCCAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATAT

获得的序列与genBank中保存的数据进行相似性分析发现，本实验所鉴定微生物与Ophicordyceps sinensis同源性最高(homology,100％/560bp,based on 18S rDNA)，根据微生物分子遗传学鉴定原则，基于18S rDNA序列的同源性高于95％，鉴定菌基本属于对照菌。18S rDNA序列经过系统发育树分析，其亲缘关系与Ophicordyceps sinensis最近，如图4所示。因此，本实验鉴定的微生物为Ophicordyceps sinensis ZJB19050。

实施例4中国被毛孢ZJB19050的Biolog代谢指纹图谱鉴定

利用Biolog(FF)自动鉴定系统测定碳源利用情况。由于试验菌株的形态特征和培养特征类似于真菌，所以本试验使用FF鉴定微平板对试验菌株的碳源利用情况进行测定。

1、菌悬液制备：

(1)取无菌棉签在接种液(FF-IF)中蘸湿；

(2)将棉签在实施例1菌落表面滚动，粘取孢子，注意不要带出培养基；

(3)在接种液管液面上沿内壁转动棉签，使孢子附着在内壁上，同时将孢子均匀打散；

(4)倾斜接种液管，用棉签将孢子分散于接种液中。如有小的菌团，应使之沉到管底；

(5)调整浊度：

(a)关闭电源，调整指针至“0”刻度；

(b)擦干空白接种液管外壁，置于浊度计中，接通电源，调整指针至100％T；

(c)使用浊度标准品检查浊度仪的准确性，并调整至标准浊度值；

(d)擦干菌悬液管外壁，插入浊度计，读取菌悬液浊度值；

(e)通过添加孢子调整浊度值，使其在75％左右。

2、FF微平板接种：

(1)将制备好的菌悬液倒入加样槽中，使用八道电动移液器，将其接种于微平板96孔中；

(2)使用FF鉴定微平板，接种量为100μL/孔。

3、FF微平板培养：

接种丝状真菌的FF鉴定微平板在26℃，空气中培养至24h、48h、72h、96h、168h和240h，培养环境不宜过湿。

4、FF微平板读数及结果保存：

(1)打开“MicroLog”应用程序，输入用户名和密码，点击“OK”进入主界面；

(2)先进入“Setup”界面，点击“initialize reader”，进行初始化设置，等到界面上红色的“ComNot Open”键变成绿色的“Ready”时，点击“Read”；

(3)进入“Read”界面后，选择阅读器模式—Reader，如采用人工读数，进入手动模式(Manual)；在“Data File Name”后输入数据保存名称和保存地址；点击“Read NewPlate”选择微平板类型和培养时间，在“Strain type”下拉菜单中选择丝状真菌类型；

(4)将微平板放人读数仪托架上，合上读数仪盖子，准备读数；

(5)按“Read Next”键开始读数。

(6)以PDF格式保存结果。

5、Biolog鉴定的结果分析

利用Biolog自动微生物鉴定系统考察菌株对95种不同碳源的代谢情况：将原始菌株接种于真菌平板培养基，16℃恒温培养15天，用无菌棉签将平板上的菌体洗下，与接种液(FF-IF)混合，制成菌悬液，用浊度计调整至75％T/FF。用8孔电动加液器将菌悬液分别加在Biolog FF微孔鉴定板的各孔中，每孔100μL。将微孔鉴定板放在14微孔培养箱中，分别在培养24h、48h、72h、96h、168h、240h和360h后将其置于Biolog读数仪上读取结果。

经Biolog读数仪分析代谢指纹，中国被毛孢能利用的碳源很少，原始菌株ZJB18002只能利用9种碳源，与之相比ZJB19050可以利用13种，这也间接的解释了ZJB19050核苷产量高的原因发现，与冬虫夏草菌无性型的相似性指数大于0.5。Biolog系统给出360h鉴定结果，如表3所示。

表3.菌株ZJB19050对Biolog FF板上95种碳源的利用能力

实施例5核苷的快速提取及检测

准确称取实施例2获得的中国被毛孢菌丝体0.030g，加入6.0mL 10％的甲醇溶液，超声破碎，重复超声两次，每次30min，8000rpm离心5min。收集离心后的上清液，经0.22μm的滤膜过滤，液相检测核苷产量。

液相条件：流动相为甲醇水，梯度洗脱，0-5min甲醇：水＝0:100，5-10min甲醇：水＝5:95，10-30min甲醇：水＝30:70，30-40min甲醇：水＝5:95，40-45min甲醇：水＝0:100。柱子为C18(4.6mm*250mm)检测波长为259nm。上述方法对核苷进行检测。

结果：经检测发现各活性成分出峰时间如下：尿苷6.3min、鸟苷12.4min、腺苷18.6min。经计算突变株ZJB19050的腺苷、鸟苷和尿苷产量分别为3.36mg/g、2.7mg/g和6.46mg/g。

实施例6中国被毛孢ZJB19050的发酵稳定性检测

取中国被毛孢突变株ZJB19050，将其接种于种子培养基中，于11～26℃，60～200rpm转速下培养15～30天，再转接于发酵培养基中，11～26℃，60～200rpm转速下培养3～12天，在离心机6000～10000rpm下用0.4～1.0mol/L氯化钾溶液洗涤菌丝2～3次，收集得到纯化后的菌丝体。根据实施例5的步骤对其核苷产量进行检测。按照以上步骤重复9次，得到突变株每一代的核苷产量。

结果如图5所示，突变株ZJB19050的每一代产量虽略微有些波动，但其核苷含量下降不明显，并不存在显著性差异，认定中国被毛孢ZJB19050具有高产核苷的遗传稳定性。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种中国被毛孢诱变株及其在生产核苷中的应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 552

<212> DNA

<213> 中国被毛孢(Hirsutella sinensis)

<400> 1

tgcggaggga tcattatcga gtcaccactc ccaaaccccc tgcgaacacc acagcagttg 60

cctcggcggg accgccccgg cgccccaggg cccggaccag ggcgcccgcc ggaggacccc 120

cagaccctcc tgtcgcagtg gcatctctca gtcaagaagc aagcaaatga atcaaaactt 180

tcaacaacgg atctcttggt tctggcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa 240

tgtgaattgc agaattcagt gaaccatcga atctttgaac gcacattgcg cccgccagca 300

ctctggcggg catgcctgtc cgagcgtcat ctcaaccctc gagccccccg cctcgcggcg 360

gcggggcccg gccttggggg tcacggcccc gcgccgcccc ctaaacgcag tggcgacccc 420

gccgcggctc ccctgcgcag tagctcgctg agaacctcgc accgggagcg cggaggcggt 480

cacgccgtga aaccaccaca ccctccagtt gacctcggat caggtaggga tacccgctga 540

acttaagcat at 552

<210> 2

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

tccgtaggtg aacctgccg 19

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

tcctccgctt attgatatgc 20

Claims (8)

1.一种中国被毛孢诱变株，其特征在于，命名为中国被毛孢(Hirsutella sinensis)ZJB19050，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2020117，保藏日期为2020年5月11日，保藏地址为中国武汉，武汉大学；邮编为430072。

2.如权利要求1所述的中国被毛孢诱变株，其特征在于，所述中国被毛孢诱变株的18SrDNA序列如SEQ ID NO.1所示。

3.如权利要求1所述的中国被毛孢诱变株在生产核苷中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述核苷为腺苷、鸟苷和尿苷中的至少一种。

5.如权利要求3所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)对权利要求1所述的中国被毛孢诱变株进行活化培养，得到活化菌体；

(2)将所述活化菌体接种至种子培养基中，进行种子培养，得到种子液；

(3)将所述种子液接种至发酵培养基中，进行发酵培养，得到含核苷的菌体；

(4)将步骤(3)所述含核苷的菌体进行干燥，提取菌体中的核苷。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(1)中，所述活化培养的方法为：将权利要求1所述的中国被毛孢诱变株接种至加富培养基平板上，15～17℃下培养6～8天。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(2)中，所述种子培养的条件为：15～17℃，140～160rpm下培养20～22天；

所述种子培养基的终浓度组成为：蚕蛹粉10～30g/L，麸皮10～25g/L，玉米粉10～25g/L，葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，糊精3～10g/L，琼脂5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。

8.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤(3)中，所述发酵培养的温度为15～25℃，转速为140～160rpm；

所述发酵培养培养基的终浓度组成为：葡萄糖10～30g/L，酵母粉3～10g/L，糊精3～10g/L，蛋白胨5～20g/L，磷酸二氢钾0.05～2g/L，无水硫酸镁0.05～2g/L，溶剂为水。

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