CN103709213B - 一种从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其包括以下步骤：（1）何首乌用酒精浸提得清液A；（2）向清液A中加入澄清剂，再加入有机或无机碱调节溶液至中性，离心得清液B；（3）向清液B中加入饱和金属离子沉淀剂；（4）将清液C用有机溶剂萃取，蒸干有机溶剂得四羟基二苯乙烯苷粗品，重结晶得到纯度>99%的羟基二苯乙烯苷纯品。本发明避免了各种繁琐的柱层析过程，产率高，工艺简单；整个工艺条件温和，环境友好，适合大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，特别是一种中试的工艺方法，属于生物医药领域。
背景技术
四羟基二苯乙烯苷（tetrahydroxystilbeneglucoside，TSG），化学名为2、3、5、4’-四羟基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷，结构如图所示，是药用植物何首乌中的一种生物活性成分。
现代研究发现TSG具有以下药理作用：①TSG可明显保护神经细胞，抵抗β-淀粉样蛋白H2O2所致的细胞存活率下降和LDH漏出率增多，对缺血再灌注模型具有明显的脑保护作用，并能改善动物的学习记忆和认知功能；②TSG可以清除体内过多的氧自由基，具有显著减轻超氧自由基氧化损伤的能力，对脑缺血再灌注损伤起保护作用。③TSG可降低胆固醇，抑制动脉粥样状硬化，保护肝脏，舒张血管。因此，研究从何首乌提取分离并得到高纯度的四羟基二苯乙烯苷具有非常重要的意义。
四羟基二苯乙烯苷为多羟基芪类化合物，极性强、易形成氢键，在高温及酸性条件下不稳定。何首乌化学成分复杂，已报道的化合物有47种，其中有些化合物与四羟基二苯乙烯苷在结构、性质上十分相似，因此从何首乌中提取得到高纯度的四羟基二苯乙烯苷具有一定困难。目前已报道的分离纯化方法包括：高效液相色谱法、层析法、结晶法等，然而高纯度的四羟基二苯乙烯苷一直处在实验室少量制备的水平，未有适合大规模工业化生产的工艺报道。
长期以来，从何首乌中提取TSG的传统方法为乙醇回流，该方法加热时间长，溶剂消耗大。王娟（中草药，2003,34（4）：314-317）等通过均匀设计的方法，采用连续微波辐射法进行提取TSG的优化，其最优化的工艺条件为：微波功率340W，辐射时间10min，溶剂为95%乙醇，固液比为1:5，浸泡时间1h。虽然该微波提取工艺在节约溶剂，缩短提取时间上较常规方法有很大提高，但产率较低，不易实现大规模工业化生产。
王尉（中国发明专利CN102617661A）采用高速逆流色谱法，以乙酸乙酯、乙醇和水组成的三元溶剂体系作为分离溶剂系统，从TSG粗品中分离提取TSG单体，纯度达99%以上。该方法分离效率高，回收率好，制备量可达到克量级，但无法实现大规模工业生产。
卢昶年（中国发明专利CN101787060A）用水或低碳醇渗漉提取，经大孔树脂柱层析、反渗透浓缩、析晶、重结晶、冷冻干燥得TSG纯品，纯度达99%以上。该方法虽然避免了在高温条件下提取对TSG的破坏，但渗漉法提取溶剂用量大，提取时间长，后续纯化步骤也十分复杂。
吕丽爽（中国发明专利CN101003554A）在常温下采用水或乙醇提取，浓缩液用聚酰胺或大孔树脂层析柱分离，将收集到的物质重结晶后得到四羟基二苯乙烯苷晶体。该方法虽然可以得到TSG纯品，但四羟基二苯乙烯苷纯品产量有限。另外，柱层析操作繁琐，一方面样品损失比较大，导致产率偏低，另一方面大量洗脱溶剂的使用使得成本偏高，不适合大规模的工业化生产。
显然，目前还未有一种操作简便、成本低廉、可大规模工业化生产的分离提纯方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单、成本低廉、收率稳定、环境友好、产出率可达公斤级适合大规模生产高纯度四羟基二苯乙烯苷的新方法。
本发明实现过程如下：
一种从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其包括以下步骤：
（1）将何首乌块茎粉碎，用75%-95%的酒精浸提，浓缩提取液后，离心得清液A；
（2）向清液A中加入澄清剂，所述的澄清剂选自ZTC系列澄清剂、101澄清剂、甲壳素类澄清剂、明胶、海藻酸钠、丹宁、CE-1澄清剂、CZ-1澄清剂、JH澄清剂、CTS澄清剂、蛋清，再加入有机或无机碱调节溶液至中性，离心得清液B；
（3）向清液B中加入饱和金属离子沉淀剂，离心得清液C，所述饱和金属离子沉淀剂选自氯化铜、醋酸铜、醋酸铅、硝酸铅、氯化锶、硝酸铜；
（4）将清液C用有机溶剂萃取，合并有机溶剂层，蒸干有机溶剂得四羟基二苯乙烯苷粗品；
（5）四羟基二苯乙烯苷粗品经重结晶得到纯度>99%的羟基二苯乙烯苷纯品。
上述步骤（1）中，浓缩至原液的1/5～1/10体积后离心得清液A。
上述步骤（2）中，澄清剂与清液A的质量体积比为1/0.2～1/0.6g/L；用NaOH、KOH、Ca(OH)2、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸锶、氨水或乙二胺调节溶液至中性。
上述步骤（3）中，清液B与饱和金属离子沉淀剂的体积比为1000:1～1000:10。
上述步骤（4）中，所述有机溶剂选自甲苯、甲基叔丁基醚、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸甲酯、乙酸丁酯。
上述步骤（5）中，重结晶使用甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸甲酯或水为溶剂；使用高效液相色谱测定其纯度。
本发明的优点：
1、采用澄清剂除去其它大分子化合物，该步骤澄清剂用量少，且无毒无味，不会造成二次污染；
2、采用离子沉淀剂除去分子中具有与TSG结构类似的化合物，该步骤离子沉淀剂用量少，纯化效果显著，杂质痕量检测符合国家药典标准；
3、避免了各种繁琐的柱层析过程，产率高，工艺简单；
4、整个工艺条件温和，环境友好，适合大规模工业化生产。
具体实施方式
实施例1:称取何首乌粉末49kg置于提取罐中，医用酒精490kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入98g明胶后，用氢氧化钠调节pH至中性，静置30min，离心，得清液B。向清液B中加入饱和氯化铜溶液5L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用乙醚萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并乙醚层后，蒸干溶剂得TSG粗品900g。将TSG粗品用水重结晶，最终得TSG纯品850g，经高效液相色谱检测其纯度为99.23%。
实施例2:称取何首乌粉末100kg置于提取罐中，医用酒精1000kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入261g101澄清剂后，用氢氧化钾调节pH至中性，静置30min，离心得清液B。再向清液B中加入饱和醋酸铜溶液10L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用甲酸甲酯萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并甲酸甲酯层后，除去溶剂得TSG粗品1850g。将TSG粗品用乙醇重结晶，最终得TSG纯品1700g，经高效液相色谱检测其纯度为99.11%。
实施例3:称取何首乌粉末200kg置于提取罐中，85%的酒精2000kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入500gZTC天然澄清剂后，用碳酸钠调节溶液至中性，静置30min，离心，得清液B。向清液B中加入饱和硝酸铅溶液2L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用二氯甲烷萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并二氯甲烷层，蒸干溶剂得TSG粗品4kg。将TSG粗品用丙酮重结晶，最终得TSG纯品3.5kg，经高效液相色谱检测，纯度为99.27%。
实施例4:称取何首乌粉末50kg置于提取罐中，95%乙醇450kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入98gCE-1澄清剂后，用氨水调节pH至中性，静置30min，离心，得清液B。向清液B中加入饱和氯化锶溶液5L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用二氯甲烷萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并二氯甲烷层后，蒸干溶剂得TSG粗品890g。将TSG粗品用丙酮重结晶，最终得TSG纯品840g，经高效液相色谱检测其纯度为99.15%。
实施例5:称取何首乌粉末100kg置于提取罐中，医用酒精1000kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入260gJH澄清剂后，用氢氧化钾调节pH至中性，静置30min，离心得清液B。再向清液B中加入饱和硝酸铜溶液9L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用甲苯萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并甲苯层后，除去溶剂得TSG粗品1830g。将TSG粗品用乙醇重结晶，最终得TSG纯品1680g，经高效液相色谱检测其纯度为99.21%。
实施例6:称取何首乌粉末200kg置于提取罐中，医用酒精2000kg，分三次加入提取罐中浸泡，每次浸泡24h，将三次浸泡后的提取液合并，浓缩，离心，得清液A。在清液A中加入500g丹宁后，用碳酸钠调节溶液至中性，静置30min，离心，得清液B。向清液B中加入饱和醋酸铅溶液2L，搅拌后离心，得清液C。将清液C用乙酸乙酯萃取，按1:1的体积比萃取3次，合并乙酸乙酯层，蒸干溶剂乙酸乙酯得TSG粗品4kg。将TSG粗品用水重结晶，最终得TSG纯品3.3kg，经高效液相色谱检测，纯度为99.12%。
Claims (6)
1.一种从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将何首乌块茎粉碎，用75%-95%的酒精浸提，浓缩提取液后，离心得清液A；
（2）向清液A中加入澄清剂，所述的澄清剂选自ZTC系列澄清剂、101澄清剂、甲壳素类澄清剂、明胶、海藻酸钠、丹宁、CE-1澄清剂、CZ-1澄清剂、JH澄清剂、CTS澄清剂、蛋清，再加入有机或无机碱调节溶液至中性，离心得清液B；
（3）向清液B中加入饱和金属离子沉淀剂，离心得清液C，所述饱和金属离子沉淀剂选自氯化铜、醋酸铜、醋酸铅、硝酸铅、氯化锶、硝酸铜；
（4）将清液C用有机溶剂萃取，合并有机溶剂层，蒸干有机溶剂得四羟基二苯乙烯苷粗品，所述有机溶剂选自甲苯、甲基叔丁基醚、乙醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、甲酸甲酯、乙酸丁酯；
（5）四羟基二苯乙烯苷粗品经重结晶得到纯度>99%的羟基二苯乙烯苷纯品。
2.根据权利要求1所述的从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于：上述步骤（1）中，浓缩至原液的1/5～1/10体积后离心得清液A。
3.根据权利要求1所述的从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于：上述步骤（2）中，澄清剂与清液A的质量体积比为1/0.2～1/0.6g/L。
4.根据权利要求1所述的从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于：上述步骤（2）中，用NaOH、KOH、Ca(OH)2、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸锶、氨水或乙二胺调节溶液至中性。
5.根据权利要求1所述的从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于：上述步骤（5）中，重结晶使用甲醇、乙醇、异丙醇、丙酮、丁酮、乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲酸甲酯或水为溶剂。
6.根据权利要求1所述的从何首乌中提取纯化四羟基二苯乙烯苷的工艺方法，其特征在于：上述步骤（5）中，使用高效液相色谱测定其纯度。
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