CN102373248A - 一种提纯鹰嘴豆芽素a的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，它包括将原料粉碎、酶解、醇提，超临界萃取和柱层析结合，以乙醇、甲醇或丙酮为夹带剂，以二氧化碳为萃取介质，萃取温度为30-55℃，萃取压力20-55MPa，萃取1-2小时。萃取产物再以石油醚-乙酸乙酯为洗脱剂进行聚酰胺柱层析分离及重结晶等步骤获得鹰嘴豆芽素A。本发明具有提取率高、工艺简单、时间短、对环境污染较轻等优点。
Description
技术领域：
本发明涉及天然药物领域，具体涉及一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法。
背景技术：
鹰嘴豆芽素A，又名生原禅宁A，鸡斗黄素A，英文名称为BiochaninA；分子式：C16H12O5；分子量：284.26；分子结构式如下图，主要存在于红车轴草、鹰嘴豆等豆科草本植物中。
目前对鹰嘴豆芽素A的药理研究主要集中在其抗肿瘤和抗氧化等方面。林长乐等实验发现鹰嘴豆芽素A在其实验设定的浓度下均能减少由HIV-1介导的细胞融合数(EC50＝5.1μmol·L-1，SI＝39)及p24抗原的表达量(EC＝38μmol·L-1，SI＝5.2)。终浓度5、10、25、50μmol·L-1，d BioA对CD4+淋巴细胞早期活化抗原CD69表达具有明显抑制作用(P＜0.01)，其中50μmol·L-1达到最大抑制率，能使活化抑制CD4+淋巴细胞早期活化作用。另有报道发现BioA对小鼠T淋巴细胞的活化增殖和周期具有明显的抑制作用。
目前有关提取鹰嘴豆芽素A的工艺有：
专利(申请号200410013189.4)“一种从红车轴草制备红车轴草异黄酮的制备工艺”，该发明采用低碳醇热回流提取，再用矿酸作水解处理，浓缩加高温活化硅胶粉或加高温活化的活性氧化铝吸附，过滤浓缩洗脱液，干燥即得红车轴草总异黄酮制备物。该方法柱层析吸附量小，解析率低，且未分离得到各单体异黄酮。
专利(申请号200910229040.2)“鹰嘴豆芽素A的合成方法”，以对甲氧基苯乙腈和间苯三酚作为原料进行缩合，关环，然后经过提纯而获得产物。该方法工艺复杂，得率低，所用原料毒性大，成本高。
目前尚无文献采用超临界萃取法提取纯化鹰嘴豆芽素A。
超临界二氧化碳萃取分离过程的原理是利用超临界二氧化碳对某些特殊天然产物具有特殊溶解作用，利用超临界二氧化碳的溶解能力与其密度的关系，即利用压力和对超临界二氧化碳溶解能力的影响而进行的。在超临界状态下，将超临界二氧化碳与待分离的物质接触，使其有选择性地把极性大小、沸点高低和分子量大小的成分依次萃取出来。当然，对应各压力范围所得到的萃取物不可能是单一的，但可以控制条件得到最佳比例的混合成分，然后借助减压、升温的方法使超临界流体变成普通气体，被萃取物质则完全或基本析出，从而达到分离提纯的目的。是现有比较环保的提取方法。
发明内容：
本发明的目的在于克服鹰嘴豆芽素A现有制备技术中存在的缺陷，提供了一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法。该方法包括如下步骤：
(1)将原料粉碎至50-100目，用pH4-6的酸水拌湿，加入生物酶于35-40℃保温酶解，得酶解物料；
(2)将酶解物料加乙醇热回流提取，提取2-3次，提取液回收乙醇，得粗提物；
(3)将粗提物投入到超临界CO2萃取釜中，再注入夹带剂，通入CO2，在萃取压力为20-55MPa，温度为30-55℃条件下进行萃取，经过1-2小时萃取后，收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。
(4)将萃取所得粗提物用无水乙醇溶解，再与100-200目的聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得上样样品，装入预处理好的聚酰胺柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(10∶1、9∶1、4∶1)梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即鹰嘴豆芽素A。
其特征在于步骤(1)所述原料为红车轴草全草、鹰嘴豆种子或其常规发芽得到的豆芽。
步骤(1)所述酸水溶液可选盐酸或硫酸；所述生物酶为β-葡聚糖苷酶，酶添加量为1-5‰。
步骤(2)所述乙醇的体积百分比浓度为50-90％，加入量为酶解物料质量的5-10倍。
步骤(3)所述夹带剂为乙醇、甲醇或丙酮。
步骤(4)所述洗脱条件：洗脱体积为4-8倍柱体积。
本发明具有如下优点：操作简单，省时，产品得率高，质量好，纯度高。
具体实施方式：
实施例1：
取50目鹰嘴豆豆芽粉500g，加入100mlpH5的硫酸溶液拌湿，再取1gβ-葡聚糖苷酶放置在40℃的恒温箱中酶解，反应结束后投入提取罐中，加3L70％乙醇加热回流提取2小时，提取2次，合并提取液，将提取液旋转蒸发回收乙醇，所得粗提物投入超临界流体萃取釜中，设定萃取温度为40℃，压力为28MPa，以丙酮为夹带剂，待系统达到设定温度后打开CO2钢瓶阀门，待系统压力平衡后开始萃取，萃取时间为3小时，萃取完毕后收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。将粗提物用适量乙醇溶解，与等量100-200目聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得到上样样品，装入聚酰胺柱，用石油醚-乙酸乙酯10∶1、9∶1、4∶1梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即得鹰嘴豆芽素A3.6g，经HPLC测定含量为98.63％。
实施例2：
取80目鹰嘴豆500g，加入50mlpH4的盐酸溶液拌湿，再取1.75gβ-葡聚糖苷酶放置在37℃的恒温箱中酶解，反应结束后投入提取罐中，加4L60％乙醇加热回流提取1小时，提取3次，合并提取液，将提取液旋转蒸发回收乙醇，所得粗提物投入超临界流体萃取釜中，设定萃取温度为38℃，压力为26MPa，以丙酮为夹带剂，待系统达到设定温度后打开CO2钢瓶阀门，待系统压力平衡后开始萃取，萃取时间为3小时，萃取完毕后收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。将粗提物用适量乙醇溶解，与等量100-200目聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得到上样样品，装入聚酰胺柱，用石油醚-乙酸乙酯10∶1、9∶1、4∶1梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即得鹰嘴豆芽素A78mg，经HPLC测定含量为98.44％。
实施例3：
取60目红车轴草500g，加入100mlpH6的盐酸溶液拌湿，再取1.5gβ-葡聚糖苷酶放置在38℃的恒温箱中酶解，反应结束后投入提取罐中，加3.5L80％乙醇加热回流提取2小时，提取3次，合并提取液，将提取液旋转蒸发回收乙醇，所得粗提物投入超临界流体萃取釜中，设定萃取温度为42℃，压力为29MPa，以乙醇为夹带剂，待系统达到设定温度后打开CO2钢瓶阀门，待系统压力平衡后开始萃取，萃取时间为3小时，萃取完毕后收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。将粗提物用适量乙醇溶解，与等量100-200目聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得到上样样品，装入聚酰胺柱，用石油醚-乙酸乙酯10∶1、9∶1、4∶1梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即得鹰嘴豆芽素A6.6g，经HPLC测定含量为98.28％。
实施例4：
取50目鹰嘴豆豆芽粉1000g，加入200mlpH4的硫酸溶液拌湿，再取3gβ-葡聚糖苷酶放置在37.5℃的恒温箱中酶解，反应结束后投入提取罐中，加6L85％乙醇加热回流提取1小时，提取2次，合并提取液，将提取液旋转蒸发回收乙醇，所得粗提物投入超临界流体萃取釜中，设定萃取温度为47℃，压力为37MPa，以乙醇为夹带剂，待系统达到设定温度后打开CO2钢瓶阀门，待系统压力平衡后开始萃取，萃取时间为3小时，萃取完毕后收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。将粗提物用适量乙醇溶解，与等量100-200目聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得到上样样品，装入聚酰胺柱，用石油醚-乙酸乙酯10∶1、9∶1、4∶1梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即得鹰嘴豆芽素A8.5g，经HPLC测定含量为98.30％。
实施例5：
取100目红车轴草1500g，加入300mlpH5的硫酸溶液拌湿，再取4.5g β-葡聚糖苷酶放置在39℃的恒温箱中酶解，反应结束后投入提取罐中，加10L75％乙醇加热回流提取1.5小时，提取2次，合并提取液，将提取液旋转蒸发回收乙醇，所得粗提物投入超临界流体萃取釜中，设定萃取温度为52℃，压力为42MPa，以甲醇为夹带剂，待系统达到设定温度后打开CO2钢瓶阀门，待系统压力平衡后开始萃取，萃取时间为3小时，萃取完毕后收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。将粗提物用适量乙醇溶解，与等量100-200目聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得到上样样品，装入聚酰胺柱，用石油醚-乙酸乙酯10∶1、9∶1、4∶1梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即得鹰嘴豆芽素A24g，经HPLC测定含量为98.76％。
Claims (6)
1.一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于该方法按如下步骤进行：
(1)将原料粉碎至50-100目，用pH4-6的酸水拌湿，加入生物酶于35-40℃保温酶解，得酶解物料；
(2)将酶解物料加乙醇热回流提取，提取2-3次，提取液回收乙醇，得粗提物；
(3)将粗提物投入到超临界CO2萃取釜中，再注入夹带剂，通入CO2，在萃取压力为20-55MPa，温度为30-55℃条件下进行萃取，经过1-2小时萃取后，收集萃取物，挥干溶剂，得粗提物。
(4)将萃取所得粗提物用无水乙醇溶解，再与100-200目的聚酰胺混合拌样，挥干乙醇，得上样样品，装入预处理好的聚酰胺柱层析，用石油醚-乙酸乙酯(10∶1、9∶1、4∶1)梯度洗脱，TLC检测，收集鹰嘴豆芽素A流分，浓缩结晶，再以丙酮重结晶，得白色结晶粉末，即鹰嘴豆芽素A。
2.如权利要求1所述的一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于步骤(1)所述原料为红车轴草全草、鹰嘴豆种子或其常规发芽得到的豆芽。
3.如权利要求1所述的一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于步骤(1)所述酸水溶液可选盐酸或硫酸；所述生物酶为β-葡聚糖苷酶，酶添加量为1-5‰。
4.如权利要求1所述的一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于步骤(2)所述乙醇的体积百分比浓度为50-90％，加入量为酶解物料质量的5-10倍。
5.如权利要求1所述的一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于步骤(3)所述夹带剂为乙醇、甲醇或丙酮。
6.如权利要求1所述的一种提纯鹰嘴豆芽素A的方法，其特征在于步骤(4)所述洗脱条件：洗脱体积为4-8倍柱体积。
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