CN110256600B - 一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法，包括以下步骤：堇叶碎米荠的预处理、超声辅助提取、离心、高压脉冲电场二次提取、除蛋白、醇沉等。两步法制备得到的蛋白质和多糖提取物得率较高且富含有机硒，可作为富硒食品原料或营养强化剂综合开发利用。同时，本方法通过超声技术提取富硒堇叶碎米荠中的蛋白质，滤渣加水后再利用高压脉冲电场制备硒多糖，提取过程能耗低，避免了有机溶剂的使用，可在大多数实验室重复实现，具有工业化生产的潜力。

Description

一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法

技术领域

本发明属于食品加工领域，更具体地，涉及一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法。

背景技术

硒是人体和动物体内必需的微量元素，参与辅酶的合成，具有抗氧化、抗衰老、抗癌、拮抗重金属毒性等作用，缺乏硒时会引起克山病、大骨节病等40多种疾病。目前世界上有40多个国家缺硒。研究表明，有机硒主要存在硒蛋白、硒多糖中，提取富集含硒的活性成分对开发富硒功能食品具有非常重要的理论和实际意义。

堇叶碎米荠是一种富硒能力极强的十字花科碎米荠植物，其蛋白质含量约为18％，多糖含量约为6％。碎米荠种植面积广，适应性强，分布密度大，资源充足，具有很高的药用和食用价值，能将无机硒转化为有机硒。

实验室数据显示，富硒土壤(硒浓度大于0.4mg/kg)中生长的碎米荠总硒含量为1365mg/kg，而通过强化培养(条件未公开)得到的碎米荠叶中硒含量可达3000mg/kg，根部硒含量甚至可高达8000mg/kg，具有“富硒之王”的称号。大量研究表明硒具有防癌、抗癌、拮抗重金属、清除自由基、抗氧化、保护细胞膜、增强机体免疫性。因此，基于堇叶碎米荠的超富硒能力及经济适用性，其极具潜力成为工业化生产硒蛋白和硒多糖的原材料。倘若依托堇叶碎米荠提取分离含硒蛋白和硒多糖，并开发一系列富硒食品或营养强化剂，不仅可充分发挥对硒资源的综合利用，还将有利于开展有机硒生物活性相关的理论研究。

传统对天然植物的蛋白质提取方法有：溶剂提取法、酶解法等。溶剂提取采用大量的有机试剂，提取时间一般6-12小时，不仅会对环境造成污染，而且费时且提取得率低。酶解法其提取时间一般4-5小时，酶的价格较为昂贵且酶解环境范围比较窄。超声辅助提取也是一种常用的植物有效成分提取的方法，超声产生的高压和温度梯度，利用其空化效应、机械效应、热效应破坏细胞结构，可加快细胞内物质的释放、扩散。近几年，高压脉冲电场是一种高效提取植物活性成分提取方法，电场通过改变细胞膜内外电介质的排列顺序，而引起细胞膜出现不可逆的小孔，加快物质的流出。但高压脉冲电场在植物活性成分的提取还未得以推广和利用，到目前为止还没有出现对原料进行超声提取蛋白质后再利用高压脉冲电场提取多糖的报道。

发明内容

本方法目的在于解决上述问题，提供一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法，通过超声辅助提取获得堇叶碎米荠中大部分蛋白质，再利用高压脉冲电场制备多糖提取物。

为了实现上述目的，本发明提供一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法，该方法包括：

1)将富硒堇叶碎米荠烘干、粉粹；

2)将粉粹后的富硒堇叶碎米荠以水溶解得到溶液，调节溶液的pH为9-10，进行超声提取，得到第一提取液；

3)将第一提取液进行离心，得到上清液和第一沉淀，所述上清液即为硒蛋白质提取物；

4)将步骤3)得到的第一沉淀以水溶解，然后经脉冲电场处理，得到第二提取液；

5)将第二提取液除蛋白、醇沉，然后进行离心，得到第二沉淀；

6)将第二沉淀以水复溶，得到硒多糖提取物。

本发明中，所述富硒堇叶碎米荠是指在富硒土壤中生长的堇叶碎米荠，所述富硒土壤是指硒浓度大于0.4mg/kg的土壤。

作为优选方案，步骤1)中，粉粹后的富硒堇叶碎米荠的粒径≤100目。采用上述粒径范围的富硒堇叶碎米荠的好处在于加快物质的溶出并且保证物料能较好的通过脉冲电场的处理室。

根据本发明，步骤2)中，可采用本领域技术人员常规采用的酸碱调节剂调节溶液的pH，所述酸碱调节剂包括但不限于NaOH、HCl。

作为优选方案，步骤2)中，超声提取的能量密度为6-10W/mL，更优选为7.5-8.5W/mL，时间为20-40min，温度为30-50℃。控制超声提取的能量密度、时间、温度在上述范围的好处在于，超声能量密度、时间、温度过高都会导致蛋白质变性，而过低使其物质溶出的速率变慢，上述范围完全避免了上述现象的出现。

作为优选方案，步骤2)中，富硒堇叶碎米荠和水的重量比为1：20-50，更优选为1：25-35。尤其当富硒堇叶碎米荠和水的重量比为1：25-35时，可保证提取物中蛋白质含量、多糖含量更高。

作为优选方案，步骤3)和步骤5)中，离心的速度为3000-5000r/min，时间为10-20min。

作为优选方案，步骤4)中，通过蠕动泵使料液流经脉冲电场处理室进行脉冲电场处理，蠕动泵的转速为30-50r/min，脉冲周期为0.5-2kHz。

作为优选方案，步骤4)中，脉冲电场处理的条件为：电场强度为3-10kv/cm，脉冲次数为9-36次。

作为优选方案，步骤4)中，水的加入量为原始物料富硒堇叶碎米荠重量的20-40倍，更优选为25-35倍。

作为优选方案，步骤4)中，得到第二提取液还包括：将第二提取液进行离心，将离心后的第二上清液用于步骤5)的除蛋白、醇沉等。离心的速度为3000-5000r/min，时间为10-20min。离心可进行多次。

根据本发明，步骤5)中，除蛋白可选用本领域技术人员常规采用的技术手段，作为优选方案，除蛋白采用的试剂为Savage试剂。

作为优选方案，步骤5)中，醇沉的步骤包括：向步骤5)中除蛋白后的第二提取液中加入无水乙醇进行醇沉。更优选的，除蛋白后的第二提取液和无水乙醇的体积比为1：3-5。

根据本发明，步骤6)中，复溶时的加水量本领域技术人员可根据需要进行调整，如相对于1g富硒堇叶碎米荠原料，水的加入量为5mL。

作为本发明最优选的实施方案，步骤2)中，超声提取的能量密度为7.5-8.5W/mL，时间为20-40min，温度为30-50℃，富硒堇叶碎米荠和水的重量比为1：25-35；步骤4)中，脉冲电场处理的条件为：电场强度为3-10kv/cm，脉冲次数为9-36次；步骤4)中，水的加入量为原始物料富硒堇叶碎米荠重量的25-35倍。

本发明中，所述水可为本领域技术人员常规采用的实验用水，如蒸馏水、去离子水。

本发明中，按上述方法对富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖进行提取后，步骤3)所述硒蛋白质提取物中蛋白质含量可达到11.5g/100g富硒堇叶碎米荠，总硒含量高于6500mg/kg富硒堇叶碎米荠，其中有机硒含量超过90％；步骤6)所述硒多糖提取物中碳水化合物的含量超过30mg/g富硒堇叶碎米荠，总硒含量高于800mg/kg富硒堇叶碎米荠，有机硒含量可达700mg/kg富硒堇叶碎米荠。

本发明利用超声波和高压脉冲电场对蛋白质和多糖释放及提取的差异化，依次通过超声辅助法提取富硒堇叶碎米荠中大部分的蛋白质，再对粗提液的滤渣进行高压脉冲电场处理获得大部分多糖，既实现了原料的全效一体化开发，又有利于富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的同步高效富集，具有低碳节能的优点，同时，对天然物质提取的工业化放大亦具有指导意义。

本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：

1、本发明中利用超声波辅助及高压脉冲电场提取技术，以水为溶剂，未添加任何化学试剂，操作环境能耗较低；相对传统溶剂的高温提取工艺，不仅减少了溶剂的使用量，而且绿色环保。

2、超声辅助提取的富硒堇叶碎米荠提取物蛋白质含量高，且为富硒蛋白，具有开发为硒营养强化剂的潜力。

3、脉冲电场辅助提取的富硒堇叶碎米荠提取物多糖含量显著增加，且反应时间大大缩短，提取效率总体较高。

本发明的其它特征和优点将在随后具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了本发明分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法的简易流程图。

图2示出了本发明实施例所参考的牛血清蛋白标准曲线图。

图3示出了本发明实施例所参考的葡萄糖标准曲线图。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本发明更加透彻和完整，并且能够将本发明的范围完整地传达给本领域的技术人员。

本发明实施例中所用富硒堇叶碎米荠原料采自湖北省恩施市富硒土壤。

图1示出了本发明分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法的简易流程图。如图1所示，将富硒堇叶碎米荠进行超声辅助提取，然后离心，得到上清液和第一沉淀，所述上清液即为硒蛋白质提取物。将沉淀溶解，然后经脉冲电场处理，再离心，将上清液去除蛋白、醇沉，然后进行离心，得到第二沉淀，即获得硒多糖提取物。

1、富硒堇叶碎米荠中蛋白质、多糖的提取

实施例1：

(1)将富硒堇叶碎米荠粉碎并100目过筛，取1g富硒堇叶碎米荠，加入30g水混合，调节溶液的pH为9-10，在40℃条件进行超声提取，超声能量密度为8W/mL，提取时间为30min，然后4000r/min离心15min，得到第一上清液和第一沉淀，第一上清液即为硒蛋白质提取物。

(2)第一沉淀加入30g水溶解，进行高压脉冲处理，处理条件：蠕动泵转速为38r/min，脉冲电场强度为6.67kV/cm，脉冲处理次数为27次，然后4000r/min离心15min，得到第二上清液，将第二上清液以Savage试剂除蛋白，再加入第二提取液4倍体积的无水乙醇沉淀过夜后4000r/min离心20min，向沉淀中加入5mL水复溶，即得到多糖提取液。

实施例2：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，超声提取的时间为20min；

步骤(2)中，脉冲电场强度为10kV/cm，脉冲处理次数为18次。

实施例3：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，超声提取的温度为50℃，提取时间为40min；

步骤(2)中，脉冲处理次数为9次。

实施例4：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，加入40g水混合，超声能量密度为10W/mL，提取时间为20min；

步骤(2)中，脉冲电场强度为3.33kV/cm，脉冲处理次数为36次。

实施例5：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，超声能量密度为6W/mL，提取时间为20min；

步骤(2)中，脉冲电场强度为3.33kV/cm，脉冲处理次数为18次。

实施例6：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，加入40g水混合，在30℃条件进行超声提取，超声能量密度为6W/mL；

步骤(2)中，脉冲电场强度为10kV/cm，脉冲处理次数为9次。

实施例7：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，加入50g水混合，在50℃条件进行超声提取，超声能量密度为10W/mL，提取时间为40min；

步骤(2)中，脉冲电场强度为10kV/cm。

实施例8：

与实施例1的不同之处在于：

步骤(1)中，加入20g水混合，在60℃条件进行超声提取，超声能量密度为10W/mL，提取时间为40min；

步骤(2)中，脉冲电场强度为3.33kV/cm，脉冲处理次数为45次。

对比例1：

将富硒堇叶碎米荠100目过筛，取1g富硒堇叶碎米荠加入30g水，调节溶液的pH为9-10，在40℃以下条件进行高压脉冲处理，处理条件：蠕动泵转速为38r/min，脉冲电场强度为3.33kV/cm，脉冲处理次数为9次，然后4000r/min离心15min，上清液为蛋白质提取液。

沉淀加入30g水溶解，然后再进行超声处理，处理条件为超声能量为8W/mL，提取时间为30min，然后4000r/min离心15min，将上清液以Savage试剂除蛋白，加入4倍体积的无水乙醇沉淀过夜，4000r/min离心20min，沉淀加5mL水复溶为多糖提取液。

对比例2：

将富硒堇叶碎米荠100目过筛，取1g富硒堇叶碎米荠加入30g水，在40℃以下条件进行高压脉冲处理，处理条件：蠕动泵转速为38r/min，脉冲电场强度为3.33kV/cm，脉冲处理次数为9次，然后4000r/min离心，将上清液以Savage试剂除蛋白，加入4倍体积的无水乙醇沉淀过夜，4000r/min离心20min，沉淀加5mL水复溶为多糖提取液。

沉淀加入30g水溶解，调节溶液的pH为9-10，然后再进行超声处理，处理条件为超声能量为8W/mL，提取时间为30min，然后4000r/min离心15min，上清液为蛋白质提取液。

2、富硒堇叶碎米荠提取物中蛋白质和多糖含量的分析

2.1蛋白质提取液的测定：

测定实施例1-8和对比例1-2中蛋白质提取液中蛋白质的含量。

标准曲线的制备：以牛血清蛋白为标准品，配制0.1mg/mL的蛋白质标准液，分别准备吸取牛血清蛋白标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，补加蒸馏水到1mL，各加5mL考马斯亮蓝G250试剂，摇匀后静止5min，以0为空白，在595nm处测定吸光值，绘制牛血清含量与吸光值的标准曲线，如图2所示。同时测所得蛋白质提取液的吸光值，并根据标准曲线换算为蛋白质含量。结果见表1-1。

表1-1不同超声条件下提取物中蛋白质的含量

备注：蛋白质含量为提取液中相对于原始物料富硒堇叶碎米荠的蛋白质的含量。

根据实施例1-8和对比例1-2超声辅助提取蛋白质看出，实施例1的提取效果最佳，其他实施例提取效果有所下降，对比例1提取效果最差。

对比例1中，将富硒堇叶碎米荠通过高压脉冲处理，其蛋白质含量明显较超声辅助提取得到的蛋白质低，是因为脉冲电场处理，导致细胞膜穿孔只能释放部分小分子蛋白，而大分子蛋白及部分小分子蛋白无法通过细胞膜孔释放出来。

2.2多糖提取液的测定：

测定实施例1-8和对比例1-2中多糖提取液所含的碳水化合物含量。

标准曲线的制备：以葡萄糖(D+)为标准品，配制0.1mg/mL的葡萄糖(D+)标准液，分别准备吸取牛血清蛋白标准液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mL，补加蒸馏水到1mL，各加1mL 5％苯酚、5mL浓硫酸，摇匀后静止20min，以0为空白，在485nm处测定吸光值，绘制葡萄糖含量与吸光值的标准曲线，如图3所示。测定最终多糖提取液的吸光值，并根据标准曲线换算为多糖含量。结果见表1-2。

表1-2不同脉冲电场条件下提取物中多糖的含量

备注：多糖含量为提取液中相对于原始物料富硒堇叶碎米荠的多糖的含量。

实施例1-8和对比例1-2中提取液所含的多糖含量得出，高压脉冲次数对多糖提取影响较大，随着脉冲处理的次数增加，多糖提取含量先增加，后趋于稳定，脉冲能量密度过大，反而使其多糖提取含量有所下降。先高压脉冲电场处理后再进行超声辅助提取，多糖的提取含量较先超声辅助提取后再进行脉冲处理低，其因为脉冲处理形成的细胞膜穿孔，减慢液体压强减小的速度，减弱或延缓了空化效应的发生，进而减少多糖的释放。对比例2中，先利用高压脉冲电场提取得到的多糖含量最低，其因高压脉冲处理时，只有部分小分子的糖通过细胞膜穿孔而释放，大多数糖没有释放到提取液中。

综合高压脉冲电场和超声辅助提取的顺序对蛋白质、多糖提取含量的影响，都是超声辅助提取后脉冲处理对蛋白质、多糖的提取含量高于先进行脉冲处理再进行超声辅助提取。

2.3硒含量的测定：

测定实施例1、8和对比例1-2中蛋白质和多糖提取物的总硒、无机硒和有机硒含量。(有机硒含量＝总硒含量-无机硒含量)。

1)吸取蛋白质/多糖提取液5mL，按照GB 5009.93-2017第一法原子荧光光度计法测总硒含量；

2)分别向蛋白质/多糖提取液中加入10mL混酸(盐酸：硝酸(4:1，V/V)，加热消解，并及时补加混酸，待溶液变为澄清无色并伴有白烟时，继续加热至剩余量为1～2mL时；再加入5mL盐酸溶液(6mol/L)，继续加热至清亮无色并伴有白烟出现，冷却，转移至25mL容量瓶中，加入盐酸5.0mL、铁氰化钾溶液2.5mL，用去离子水定容至刻度，混匀，采用原子荧光光谱法测无机硒含量；

3)原子荧光光谱的条件为：原子化器高度8mm；灯电流80mA；载气流量400mL/min；屏蔽气流量1000mL/min；原子化温度800℃；光电倍增管负高压300V；延迟时间1s；读数时间12s；进样体积1mL。

表1-3富硒堇叶碎米荠蛋白质、多糖提取物中的硒含量

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。

Claims (10)

1.一种分步提取富硒堇叶碎米荠中蛋白质和多糖的方法，其特征在于，该方法包括：

1)将富硒堇叶碎米荠烘干、粉粹；

2)将粉粹后的富硒堇叶碎米荠与水混合，调节pH为9-10，进行超声提取，得到第一提取液；

3)将第一提取液进行离心，得到上清液和第一沉淀，所述上清液即为硒蛋白质提取物；

4)将步骤3)得到的第一沉淀以水溶解，然后经脉冲电场处理，得到第二提取液；

5)将第二提取液除蛋白、醇沉，然后进行离心，得到第二沉淀；

6)将第二沉淀以水复溶，得到硒多糖提取物。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤1)中，粉粹后的富硒堇叶碎米荠的粒径≤100目。

3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中，富硒堇叶碎米荠和水的重量比为1：20-50。

4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤2)中，超声提取的能量密度为6-10W/mL，时间为20-40min，温度为30-50℃。

5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤3)和步骤5)中，离心的速度为3000-5000r/min，时间为10-20min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，通过蠕动泵使料液流经脉冲电场处理室进行脉冲电场处理，蠕动泵的转速为30-50r/min，脉冲周期为0.5-2kHz。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，脉冲电场处理的条件为：电场强度为3-10kv/cm，脉冲次数为9-36次。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤4)中，水的加入量为原始物料富硒堇叶碎米荠重量的20-40倍。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤5)中，醇沉的步骤包括：向步骤5)中除蛋白后的第二提取液中加入无水乙醇进行醇沉。

10.根据权利要求9所述的方法，其中，除蛋白后的第二提取液和无水乙醇的体积比为1：3-5。

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