CN116042756A - 高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备及应用，制备方法为：先用纤维素酶水解堇叶碎米荠粉，酶解后离心取上清液；然后再在上清液中加入复合酶继续酶解处理，且同步进行电渗析，所得反应液灭酶后浓缩、干燥即得硒蛋白标准样品；所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV组成。本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品具有重金属含量极低、灰分少、蛋白含量高、总硒含量高、有机硒占比高达99.9％以上、生物活性高和安全性高等优点，其中有机硒主要以硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸为主且占总硒含量90％以上，有望弥补市场上硒蛋白标准样品的缺位。
Description
技术领域
本发明属于硒蛋白技术领域，具体涉及一种高生物活性、高安全性、低重金属含量的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备工艺，以及所得堇叶碎米荠硒蛋白标准样品在食品、药品制备中的应用。
背景技术
《GB1903.28-2018食品安全国家标准食品营养强化剂硒蛋白》公开了一种硒蛋白标准品，本标准中规定硒蛋白的来源是以硒含量较高的大豆等可食性植物，经去脂、水提、乙醇沉淀、干燥的工艺精制而成富含硒代蛋氨酸的食品营养强化剂。但是，由于大豆原料硒含量普遍偏低的问题以及精制工艺不足，造成了目前市场上一直未有相关的符合标准的硒蛋白产品，甚至连实验室标准样品也难以制备，在产业化应用端存在巨大的障碍。另外根据研究表明，硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的安全性比硒代蛋氨酸安全性更高，且硒代半胱氨酸已被学术界定义为人体第21种必需氨基酸，故高生物活性、高安全性、高硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸含量的硒蛋白具有重要的应用价值。
富硒含量高的植物如西兰花、甘蓝、堇叶碎米荠、水稻等植物通常也含有较多的重金属污染物，这些重金属主要为镉、铅、砷等，其原因在于：种植富硒植物的富硒土壤中的重金属含量通常也比较高，且硒与镉伴生，故植物在富硒的同时也会富集一定量的重金属，造成了植物中重金属超标的现象，进而造成食品安全的隐患。其中，堇叶碎米荠是一种聚硒能力超强的植物，且其有机硒形态主要以硒代半胱氨酸(以硒代胱氨酸计)为主。不过，目前堇叶碎米荠多为直接食用，或者经过干燥粉碎后作为食品原料，又或者经过简单的提取或者有机溶剂的提取后直接作为食品原料的使用，故在土壤重金属背景值较高时存在着较大的重金属污染食品的风险。同时由于重金属在植物中大多以酶的活性中心与蛋白结构形成络合物以及与肽类形成络合物，比如与植物螯合肽相结合进而提高了植物对重金属的耐受性，水剂提取及简单有机溶剂提取时其不能有效的破坏重金属与螯合肽之间的结合，无法实现重金属的有效去除。
目前植物有机硒蛋白的提取大多采用有机溶剂、强酸强碱、乙醇等，不仅易破坏硒蛋白四级结构导致功能成分的稳定性降低，造成其不同程度的失活等，且产生的废水废液较多，环境污染较为严重，同时存在生产安全隐患。而常规的水剂提取方法，其重金属含量及灰分等成分比较高，食品安全存在隐患；同时其分离出的组分硒形态不明确，其功效活性和安全性没有保障。
发明内容
针对现有技术中的问题，本发明以堇叶碎米荠为原料，提供了一种生产低重金属含量、高生物活性、高安全性、高硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸含量的硒蛋白标准样品的工艺，经过该工艺所制得的硒蛋白标准样品中硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸含量可占总硒含量90％以上，且总硒含量、重金属含量、蛋白质含量及特征性有机硒形态等指标均达到并显著优于硒蛋白国家标准要求。
本发明的技术方案具体如下：
一种高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备工艺，具体包括以下步骤：
步骤1、用纤维素酶水解堇叶碎米荠粉，酶解完成后灭酶处理，然后离心取上清液；
步骤2、在上清液中加入复合酶继续酶解处理，且同步进行电渗析，待反应结束后灭酶处理；所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV组成；
步骤3、将步骤2所得反应液浓缩后干燥，即得硒蛋白标准样品。
进一步地，在上述技术方案中，步骤1中纤维素酶的添加量为堇叶碎米荠粉的0.1～10wt％，且纤维素酶的酶解温度为30～50℃，时间为1～4h。
进一步地，在上述技术方案中，步骤1中离心的参数为：1000～10000r/min，5～60min；通过离心去除经纤维素酶解后仍存在的一些大颗粒不溶性物质。
进一步地，在上述技术方案中，步骤2中复合酶的添加量为堇叶碎米荠粉的0.1～10wt％，且复合酶的酶解温度为30～50℃；更进一步地，复合酶中碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV的质量比为1:1:1:1:1。
进一步地，在上述技术方案中，步骤2中电渗析的参数为：电压15～100V，电流≤10A，极水流速1～100L/h，淡水和浓水流速1～100L/h，淡水和浓水体积比1:1；其中极水用0.1～10wt％硫酸钠溶液；
更进一步地，步骤2中酶解和电渗析的处理时间为0.5～8h。
进一步地，在上述技术方案中，灭酶处理的温度为85～95℃。
进一步地，在上述技术方案中，步骤3中干燥的方式为喷雾干燥或者冷冻干燥。
本发明的有益效果为：
1)首先采用纤维素酶将堇叶碎米荠中与蛋白质结合的纤维分解掉，释放出蛋白质；然后通过复合酶定向酶切大分子蛋白质为氨基酸，且本发明提供的复合酶可以最大程度的选择性解离出硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸，复合酶酶解的同时能将与蛋白质络合的重金属解离进而形成游离的重金属离子，并配合电渗析技术将重金属离子和无机硒去除；
2)本发明中酶解条件温和且酶解时间短，不使用强酸强碱以及有机溶剂，所以能最大程度的得到并保护硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的有机硒形态；
3)本发明发现电渗析能够促进复合酶选择性的解离出硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸；
4)本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品中，硒形态主要为硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸且其含量可达总硒含量90％以上，硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸的安全性比硒代蛋氨酸安全性更高，本发明也通过动物试验及应用进一步验证了其高活性和高安全性。
5)本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品中总硒含量1500～5000mg/kg，有机硒含量占总硒含量比例可达99.9％及以上，有机硒含量远高于《DBS42/002-2022富有机硒食品硒含量要求》中要求的有机硒占比80％以上，所以其安全性更高；硒蛋白中蛋白质含量大于等于60％；提取物中的重金属铅、砷、汞、镉等重金属均为未检出，灰分含量降至2％及以下，故其安全性也更高。综上，本发明所得堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的各参数均能满足或显著优于硒蛋白国标的要求，具体见下表：
有此可见，本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品有望弥补市场上硒蛋白标准品的缺位。
附图说明
图1为单次给予硒制剂的血清谷胱甘肽过氧化物酶的活力变化曲线图；
图2为多次给予硒制剂的血清谷胱甘肽过氧化物酶的活力变化曲线图；
图3为不同硒产品对大鼠肝脏的毒性对比图。
具体实施方式
下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。
实施例1
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉和纤维素酶(二者质量比为1:0.02)加入纯净水中，于40℃震荡酶解2h，然后升温至85℃进行灭酶处理，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)在上清液中添加由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV(1:1:1:1:1)组成的复合酶，其中复合酶的添加量与堇叶碎米荠粉的质量比为0.015:1；将添加有复合酶的上清液置于电渗析器中以同步进行电渗析处理，电渗析器的工作参数为：电压15V，电流3.3A，极水流速12L/h，淡水和浓水流速20L/h，淡水和浓水体积比1:1，极水用2％硫酸钠溶液。在此过程中，保持酶解反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，升温至85℃灭酶处理，收取滤液。
(3)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
实施例2
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)将堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉和纤维素酶(二者质量比为1:0.02)加入纯净水中，于40℃震荡酶解2h，然后升温至85℃进行灭酶处理，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)在上清液中添加由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV(1:1:1:1:1)组成的复合酶，其中复合酶的添加量与堇叶碎米荠粉的质量比为0.015:1；将添加有复合酶的上清液置于电渗析器中以同步进行电渗析处理，电渗析器的工作参数为：电压13V，电流3A，极水流速15L/h，淡水和浓水流速22L/h，淡水和浓水体积比1:1，极水用2％硫酸钠溶液。在此过程中，保持酶解反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，升温85℃灭酶处理，收取滤液。
(3)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
对比例1
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)将堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉和纤维素酶(二者质量比为1:0.02)加入纯净水中，于40℃震荡酶解2h，然后升温至85℃进行灭酶处理，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)在上清液中添加由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV(1:1:1:1:1)组成的复合酶，其中复合酶的添加量与堇叶碎米荠粉的质量比为0.015:1；保持酶解反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，升温85℃灭酶处理，收取滤液。
(3)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
对比例2
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)将堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉和纤维素酶(二者质量比为1:0.02)加入纯净水中，于40℃震荡酶解2h，然后升温至85℃进行灭酶处理，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)将上清液置于电渗析器中进行电渗析处理，电渗析器的工作参数为：电压15V，电流3.3A，极水流速12L/h，淡水和浓水流速20L/h，淡水和浓水体积比1:1，极水用2％硫酸钠溶液。在此过程中，保持反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，收取滤液。
(3)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
对比例3
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)将堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉加入纯净水中，于40℃震荡提取2h，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)将上清液置于电渗析器中进行电渗析处理，电渗析器的工作参数为：电压15V，电流3.3A，极水流速12L/h，淡水和浓水流速20L/h，淡水和浓水体积比1:1，极水用2％硫酸钠溶液。在此过程中，保持反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，收取滤液。
(3)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
对比例4
本实施例中的堇叶碎米荠硒蛋白的制备过程具体为：
(1)将堇叶碎米荠干燥后粉碎过40目筛，将堇叶碎米荠粉和纤维素酶(二者质量比为1:0.02)加入纯净水中，于40℃震荡酶解2h，然后升温至85℃进行灭酶处理，再用离心机3000r/min离心15min，去除沉淀杂质，取上清液。
(2)在上清液中添加由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV(1:1:1:1:1)组成的复合酶，其中复合酶的添加量与堇叶碎米荠粉的质量比为0.015:1；保持酶解反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，升温85℃灭酶处理，收取滤液。
(3)将上一步的滤液采用电渗析进行处理，电渗析器的工作参数为：电压15V，电流3.3A，极水流速12L/h，淡水和浓水流速20L/h，淡水和浓水体积比1:1，极水用2％硫酸钠溶液。在此过程中，保持酶解反应液温度为45℃，反应2h。待反应结束后，升温85℃灭酶处理，收取滤液。
(4)采用真空浓缩滤液，再进行喷雾干燥得到目标产物。
对实施例1～2和对比例1～4制备的堇叶碎米荠硒蛋白进行以下检测，具体包括两个部分：
(1)成分分析
通过GB 5009.5的方法检测各硒蛋白样品中蛋白质的含量，通过GB 5009.4的方法检测灰分含量，通过GB 5009.93的方法检测总硒含量，通过DSB42/002的方法检测有机硒含量，通过T/CHC1001的方法检测硒代半胱氨酸(以硒代胱氨酸计，由于游离的硒代半胱氨酸极其不稳定，两分子的硒代半胱氨酸会结合成一分子的硒代胱氨酸)占比，通过GB 5009.75的方法检测铅的含量，通过GB 5009.76的方法检测砷的含量，通过GB 5009.12的方法检测镉的含量，通过GB 5009.17的方法检测汞的含量。结果具体如下表所示：
从实施例和对比例的数据可知，电渗析能有效降低各种重金属、无机硒和灰分的含量从而提高样品中的蛋白质含量；而且同步复合酶解与电渗析处理，能显著提高硒代胱氨酸的含量，其原因在于：由于酶解组合后酶解更加充分，使硒代胱氨酸能够最大程度的解离出来且在此酶解体系保持最稳定，同时通过电渗析同步酶解快速的将解离出来的重金属成分除去，减少了硒胱氨酸的结构发生变化。
采用本发明制备的硒蛋白标准样品总硒含量高达1500～5000mg/kg，有机硒含量高达99％以上，硒代胱氨酸占比90％以上，蛋白质含量高达60％以上，灰分含量可控制在2％以下，铅、砷、汞、镉等重金属均为未检出，以上指标(除了有机硒形态为硒代胱氨酸外)其他指标完全符合《GB1903.28-2018食品安全国家标准食品营养强化剂硒蛋白》的要求。
(2)抗氧化活性动物实验
为了验证本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的酶活性，具体采用实施例1和对比例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白进行动物抗氧化性试验，方案如下：
试验设4个受试样品剂量组和1个对照组，4个剂量组分别为对比例1低剂量组、对比例1高剂量组、实施例1低剂量组、实施例1高剂量组，剂量(以硒计)分别为0.03mgSe/kg、0.3mgSe/kg、0.02mgSe/kg、0.2mgSe/kg。
受试物配制成溶液拌饲料经口给予，每只动物均于1分钟内完成经口摄入。对照组给予等体积蒸馏水。受试物各组动物数量均为4只，对照组2只。受试物给予分为两个给药周期，连续七天为一个给药周期，给药频率为每天一次。两个给药周期之间设置洗脱期，对比例1组的洗脱期为八天，实施例1组洗脱期为十天。
为观察动物体内的药物暴露水平，采用前腔静脉采血法采集大约5mL全血，加入以K2EDTA作为抗凝剂的贴有标签的采血管中。检测指标为单次及多次给予硒制剂的血清谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)的活力(按试剂盒指南制备肝匀浆，以南京建成生物试剂盒进行检测)。
检测结果如图2和图3所示，具体为：单次或多次给予对比例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白对血浆GPX活性均无明显影响，单次给予实施例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白0.14mgSe/kg后，可明显升高血浆GPX活性，多次给予实施例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白0.03mgSe/kg及0.14mgSe/kg均可显著升高血浆GPX活性。因此，实施例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白可显著提高血浆GPX活性；对比例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白对血浆GPX活性均无明显影响。
(3)安全性动物试验
本试验采用雄性大鼠通过3个月重复经口给药，观察并探寻本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白(具体为实施例1制备的)、亚硒酸钠、富硒酵母、以及对比例3制备的硒蛋白样品的潜在毒性(0.60mgSe/kg BW，以硒计)。
经3个月给药后，各实验组大鼠的肝脏病变情况如图3所示，其中A为空白组，B为亚硒酸钠组，C为富硒酵母组，D为对比例3制备的硒蛋白组，E为实施例1制备的堇叶碎米荠硒蛋白组。可以明显看出：亚硒酸钠组造成了肝脏的病变，富硒酵母组和对比例3制备的硒蛋白组也有不同程度的病变，本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白组与空白对照组保持一致，肝脏未出现毒性作用，证明本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白在以上剂量没有毒性。
对比例3制备的硒蛋白样品也造成了一定程度的病变，其原因与制备方法有关，导致所得的硒蛋白样品中含有一定的重金属且灰分含量过高，进而损伤肝脏。
富硒酵母中的硒形态主要为硒代蛋氨酸，其造成了肝脏不同程度的病变，而本发明制备的硒蛋白中硒形态80％左右为硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸对肝脏无毒性作用，进一步证明了以硒代半胱氨酸/硒代胱氨酸为标志性成分的堇叶碎米荠硒蛋白的安全性比以硒代蛋氨酸为主要成分的富硒酵母的安全性更高。
进一步采用不同剂量堇叶碎米荠硒蛋白标准样品(实施例1制备)喂养大鼠，剂量以硒含量计算分别为0.15、0.30、0.60mgSe/kg，各剂量组精子总数及活力如下表所示：
从上表可知，各剂量下，精子总数和活力均未见明显改变，即可证明本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白具有很高的安全性。
综上所述，本发明制备的堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的各项技术指标完全可以满足、甚至是显著优于硒蛋白国标要求，其还可显著提高血浆中谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)生物活性，进而提高抗氧化能力；且具有良好的安全性，故其有望填补市场上硒蛋白标准品的空白。
以上所述是本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明之权利范围，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品的制备工艺，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1、用纤维素酶水解堇叶碎米荠粉，酶解完成后灭酶处理，然后离心取上清液；
步骤2、在上清液中加入复合酶继续酶解处理，且同步进行电渗析，待反应结束后灭酶处理；所述复合酶由碱性蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和蛋白酶XIV组成；
步骤3、将步骤2所得反应液浓缩后干燥，即得硒蛋白标准样品。
2.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤1所述纤维素酶的添加量为堇叶碎米荠粉的0.1～10wt％，且纤维素酶的酶解温度为30～50℃，时间为1～4h。
3.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤1所述离心的参数为：1000～10000r/min，5～60min。
4.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤2中复合酶的添加量为堇叶碎米荠粉的0.1～10wt％，且复合酶的酶解温度为30～50℃。
5.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤2中电渗析的参数为：电压15～100V，电流≤10A，极水流速1～100L/h，淡水和浓水流速1～100L/h，淡水和浓水体积比1:1；其中极水用0.1～10wt％硫酸钠溶液。
6.根据权利要求5所述的制备工艺，其特征在于，所述电渗析的处理时间为0.5～8h。
7.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，所述灭酶处理的温度为85～95℃。
8.根据权利要求1所述的制备工艺，其特征在于，步骤3所述干燥的方式为喷雾干燥或者冷冻干燥。
9.如权利要求1～9任一项制备的高活性高安全性堇叶碎米荠硒蛋白标准样品在食品或药物制备中的应用。
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