CN110651886A - 一种澳洲坚果蛋白的制备方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物天然产物提取领域，涉及一种植物蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种澳洲坚果蛋白的制备方法及其应用。本制备方法包括制备脱脂坚果粕、两次使用酶处理物料以及碱溶酸沉等步骤。该制备方法可以高效提取脱脂坚果粕中的蛋白质，并将蛋白质和多糖有效地分离，提高了获得的澳洲坚果蛋白的品质。本制备方法可以应用于制备含澳洲坚果蛋白或多肽的保健品的生产实践中。
Description
技术领域
本发明属于植物天然产物提取领域，涉及一种植物蛋白的制备方法及其应用，具体涉及一种澳洲坚果蛋白的制备方法及其应用。
背景技术
澳洲坚果(Macadamia integrifolia F.Muell，又名夏威夷果)果油中含有大量不饱和脂肪酸，因此澳洲坚果经常被用来提取天然植物油。但是榨油后会产生大量的脱脂坚果粕，如果直接丢弃，将造成巨大的浪费和环境污染。脱脂坚果粕中含有大量的蛋白质，蛋白质共含有17种氨基酸，其中10种是人体自身不能合成而必须由食物供给的氨基酸。而且其蛋白组成中必需氨基酸的比例恰好符合人体的需要，机体对这类蛋白质的利用率极高。因此，将脱脂坚果粕中的蛋白提取和利用，可制备成为多种蛋白保健食品，实现澳洲坚果产品的二次价值提升，具有广阔的应用前景。
脱脂坚果粕中含有大量的蛋白质和碳水化合物，一些碳水化合物(例如多糖)和蛋白质之间较难分离，碳水化合物的存在会影响到提取获得的蛋白的含量、品质以及生物活性。因此在澳洲坚果蛋白的提取、分离纯化及结构鉴定中，脱糖是一个重要环节。但是现有的对植物蛋白的提取方法中，大多采用有机溶剂或酸沉淀蛋白的方法，多糖等碳水化合物和蛋白质发生共沉淀，不能将蛋白质和多糖有效地分离。另外，由于澳洲坚果果仁中含有大量的油脂，需要将油脂分离后，才能进行蛋白的有效提取。但是工业上用到的澳洲坚果油脂提取方法(如热榨法等)会使油脂氧化败坏，甚至产生反式脂肪酸、油脂聚合体等有害物质，所得脱脂坚果粕中的蛋白质变性严重，大部分脱脂坚果粕只能用做动物饲料。
发明内容
本发明主要解决的技术问题是提供一种澳洲坚果蛋白的制备方法，该制备方法可以高效提取脱脂坚果粕中的蛋白质，并将蛋白质和多糖有效地分离，提高了澳洲坚果蛋白的品质。
为解决上述技术问题，本发明提出了以下技术方案：
一种澳洲坚果蛋白的制备方法，包括以下步骤：
步骤(1)：使用澳洲坚果果仁制备脱脂坚果粕，粉碎后得脱脂果粕粉；
步骤(2)：将脱脂果粕粉分散于水中，再加入复合酶A，混合均匀，得酶解体系A，对脱脂果粕粉进行酶解反应；复合酶A为纤维素酶和淀粉酶组成的混合物；
步骤(3)：步骤(2)的酶解反应结束后，在酶解体系A中加入水，混匀后离心取固相，得沉淀A；
步骤(4)：将沉淀A分散于水中，再加入复合酶B，混合均匀，得酶解体系B，对沉淀A进行酶解反应；复合酶B为中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种酶或一种以上酶组成的混合物；
步骤(5)：步骤(4)的酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至碱性，离心取上清液；
步骤(6)：调整步骤(5)获得的上清液的pH值至酸性，离心取固相，得沉淀B；对沉淀B进行干燥处理后得蛋白提取物。
采用上述技术方案，技术原理为：使用复合酶A处理脱脂果粕粉，破坏脱脂果粕粉中的植物细胞壁，使得细胞中的成分释放出来，增加提取效率。除此之外，复合酶A还可以继续降解酶解体系A中的多糖物质，增加脱脂果粕粉中的总碳水化合物在水中的溶解度。在酶解反应结束之后，在酶解体系A中加入水，溶解体系中的可溶性碳水化合物，进一步减小多糖等碳水化合物对目的产物纯度的影响。然后通过离心去掉液相部分，蛋白质存在于沉淀A中，再使用复合酶B对沉淀A进行酶解反应，将大分子蛋白质降解成为小分子，甚至是多肽，可以增加蛋白质在碱性环境下的溶解程度。反应结束之后，调节体系的pH值至碱性，蛋白质溶解，再通过离心除去沉淀部分，获得蛋白质溶液。最后将上清液的pH值调整至酸性，出现大量蛋白质沉淀，离心取固相部分，经干燥处理后，就可以获得澳洲坚果的蛋白质提取物。
采用上述方案的有益效果在于，可以将蛋白质和多糖等碳水化合物充分分离，获得纯度高品质好的蛋白质提取物。本方案使用了纤维素酶和淀粉酶组成的复合酶A处理脱脂果粕粉，复合酶A除了可以降解植物细胞壁，促进细胞内容物释放，还可以分解脱脂果粕粉中的多糖等碳水化合物，提高这些碳水化合物的水溶性。发明人研究发现，将物料中的多糖等碳水化合物酶解处理，将大分子转变成为小分子物质，对充分清除物料中的多糖具有促进作用。然后在酶解体系A中加入水，充分将可溶性的碳水化合物溶解，然后通过离心将蛋白质(存在于沉淀A中)和液相分离。纤维素酶和淀粉酶协同作用，共同促进物料中植物细胞壁以及其他碳水化合物的降解，增加了蛋白质提取物中蛋白质的纯度。现有技术中通常利用纤维素酶来降解植物细胞壁，从而提高有效成分的提取效率，而对有效成分的纯度并无提高作用。现有技术中，提高目的产物纯度通常要采取额外的纯化步骤来实现，操作复杂且繁琐。而本方案利用了酶来降解多糖等碳水化合物，从而实现了提高蛋白质纯度的目的。
进一步，在步骤(2)中，脱脂果粕粉与水的用量比为1g：(5-8)ml，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为6-9％，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1；对脱脂果粕粉进行酶解反应的温度为30-50℃，时长为60-120min。
采用上述技术方案，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为6-9％可以促进脱脂果粕粉中的多糖等碳水化合物充分溶解到水中，从而将蛋白质和多糖等物质分离。复合酶A的质量浓度过低，复合酶A未对多糖等物质进行充分分解，会导致最终获得的蛋白质提取物中的杂质多、纯度低。而复合酶A的质量浓度过高，并不会进一步促进酶促反应的进行，本着节约成本的原则，复合酶A的用量需要控制在一定范围内。
按照传统看法来说，纤维素酶对细胞的酶解作用越充分，细胞中的内容物也就释放得越充分，会导致提取液中溶出的成分变得更杂，更加的难于分离纯化目的成分。但是发明人经过多次试验发现使用上述质量浓度的复合酶A处理脱脂果粕粉60-120min，可以获得纯度更高的蛋白质提取物。现有技术中，对植物细胞壁进行酶解的纤维素酶的质量浓度通常是低于4％，即可达到使细胞壁瓦解的效果。但是本技术方案使用到了超过常规用量的酶，并将纤维素酶和淀粉酶联合使用，获得了除了瓦解细胞壁之外的效果。发明人认为这和澳洲坚果果仁的较为特殊的碳水化合物组成有关，所以使用了过量的纤维素酶和淀粉酶可以增加最终提取的蛋白质的纯度。发明人接下来将会对果仁的多糖成分进行具体分析，进一步优化提取和纯化方法。
进一步，在步骤(3)中，酶解体系A与水的体积比为1:3，离心速度为1000-2000rpm，离心时长为20-30min。
采用上述技术方案，可将酶解体系A中溶出或产生的可溶性多糖充分溶解，从而获得多糖等杂质含量少的蛋白提取物。
进一步，在步骤(4)中，沉淀A与水的用量比为1g：(3-5)ml，复合酶B在酶解体系中的质量分数为3-5％；对复合酶B进行酶解反应的温度为50-60℃，时间为80-110min。
采用上述技术方案，可以保证将大分子蛋白质分解，提高其溶解度，便于下一步碱溶步骤的进行。
进一步，在步骤(5)中，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至7.5-8.5，5000-6000rpm离心30-40min后取上清液。
采用上述技术方案，pH值为7.5-8.5，可以保证酶解体系B中的蛋白质充分溶解，使得蛋白质和其他不溶性物质分离。pH值过低，蛋白质不会充分溶解，而pH值过高会导致蛋白质变性。
进一步，在步骤(6)中，调整步骤(5)获得的上清液的pH值至3.5-6.5，3000-4000rpm离心20-30min后取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后在30-40℃的条件下，对沉淀B进行干燥处理后得蛋白提取物。
采用上述技术方案，调整pH值至3.5-6.5，蛋白质可重新沉淀。pH值过高，不能充分沉淀蛋白质，pH值过低会导致蛋白质变性，蛋白活性受影响。
进一步，在步骤(1)中，脱脂坚果粕的制备方法包括如下步骤：
步骤(1.1)：取澳洲坚果果仁，粉碎并烘干后，得果仁粉；在果仁粉中加水，混合均匀，得混合体系A，超声处理所述混合体系A，然后过滤取固相，得滤渣A；
步骤(1.2)：将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液混合，得混合体系B；将混合体系B静置后过滤取固相，用乙醇溶液洗后，得滤渣B；将滤渣B与甲醇溶液混合，得混合体系C；将混合体系C静置后过滤取固相，获得滤渣C；
步骤(1.3)：使用有机溶剂对滤渣C进行提取，然后离心取沉淀；对所述沉淀进行干燥处理之后，得脱脂坚果粕。
采用上述技术方案，可以获得质量优良，并适合于加工成保健食品的脱脂坚果粕。将澳洲坚果果仁烘干和粉碎后，将获得的果仁粉加入水，经超声处理后，果仁细胞的细胞壁和细胞膜受到一定程度的破坏，便于后续处理步骤中各种试剂与果仁细胞壁和细胞膜的接触。然后将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液中。硬脂酰乳酸钙分散液可以增加果仁的细胞壁的通透性，便于后续的提取过程中的油脂的析出。硬脂酰乳酸钙可以溶解细胞壁上的脂类物质，从而提高细胞壁通透性。用乙醇洗涤过滤后的固相，可以将在固相表面的硬脂酰乳酸钙和脂类物质清除。接下来强极性的甲醇进一步破坏细胞膜结构，便于后续的油脂的溶出。最后使用有机溶剂对油脂进行提取，将油脂充分提取去除后，蛋白质就集中在沉淀部分。由于使用硬脂酰乳酸钙和甲醇等试剂对果仁粉进行了处理，提高了后续有机溶剂提取时的油脂溶出效率。提取过程中，不用对提取体系进行高温处理，减少脱脂坚果粕中的蛋白质严重变性的可能性。
在整个脱脂坚果粕的制备过程中，温度较低，反应温和，可以防止油脂被氧化，防止有害物质的产生，提高了脱脂坚果粕中蛋白质的质量。使用硬脂酰乳酸钙和甲醇等试剂对果仁粉处理后，在后续的使用有机溶剂将油脂溶出的步骤中，不用采取高温等剧烈条件，就可以将油脂分离。本处理方法可以将油脂充分提取，从而也减少了果油对蛋白质纯度的影响。另外，使用硬脂酰乳酸钙分散液处理果仁粉，其细胞壁通透性增加，但细胞壁没有被完全破坏，细胞壁还对大分子蛋白质具有截留作用，避免了大量的蛋白质混入油脂中，造成蛋白质的损失，被截留的蛋白质可以继续用于坚果蛋白的提取和纯化中，提高了蛋白质的提取率。
硬脂酰乳酸钙是食品中常用的添加剂，硬脂酰乳酸钙为乳白色粉末或片状固体，能很好地分散于热水中，可溶于乙醇，具有良好的乳化、防老化、增筋、保鲜等作用。发明人研究发现硬脂酰乳酸钙具有增加植物细胞壁通透性的作用，可以与细胞壁上的脂类物质等结合，再通过乙醇的洗涤，将细胞壁上的脂类物质去除。发明人将食品加工工业上使用到的物质，转用到植物天然产物的提取中，发现了硬脂酰乳酸钙新的用途，扩展了该物质的应用范围。
进一步，在步骤(1.1)中，果仁粉和水的用量比为1g：(8-10)ml；超声处理所述混合体系的功率为50-70W，时长为2-5min。
采用上述技术方案，超声处理破坏果仁细胞，便于后续使用的试剂进入细胞结构中。在中药材有效成分提取的现有技术中，超声处理的时间较长(如30min左右)，功率较大(如150W以上)，利用超声波的空化效应、机械效应和热效应等破坏植物细胞壁，使有效成分溶出。但是发明人研究发现，使用大功率和长时间的超声处理，会对提取得到的澳洲坚果果油的品质产生负面影响，会加剧澳洲坚果油的氧化，进而影响脱脂坚果粕的质量。本方案中，超声处理的功率较低，处理时长较短，是为了让果仁细胞的细胞壁产生较小的缝隙或孔洞，便于后续的硬脂酰乳酸钙进入细胞壁，进而与细胞壁中的脂质结合，再通过乙醇洗涤，增加细胞壁的通透性。
采用本方案的超声处理参数，不会对果仁细胞带来过大的破坏作用，不会让果仁细胞中的营养成分提前全部析出。本方案的超声处理操作仅作用于果仁细胞的外层，内部果油、蛋白等有效成分几乎不受到影响，降低了澳洲坚果果油被氧化产生有害物质的风险，减少了蛋白质被污染的可能性，减少了超声作用对提取物中的蛋白质量带来的负面影响，也同时提高了蛋白质的品质。
进一步，在步骤(1.2)中，所述硬脂酰乳酸钙分散液由如下方法制备：将硬脂酰乳酸钙分散于40-50℃的水中，硬脂酰乳酸钙的质量分数为0.3-0.5％；滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液的用量比为1g:(2-5)ml。
采用上述技术方案，质量分数为0.3-0.5％的硬脂酰乳酸钙分散液可充分提高果仁细胞壁的通透性，增加后续油脂提取的效率。质量分数过低，对油脂提取效率的提高不明显，不能从蛋白质中充分去除油脂；质量分数高，硬脂酰乳酸钙在水中的分散效果不好，不利于该物质与果仁细胞壁的充分作用，并且硬脂酰乳酸钙质量分数过高，会导致分散液中存在硬脂酰乳酸钙颗粒，该颗粒附着在细胞壁上，会减小细胞壁通透性，不利于提取过程。40-50℃的水温可以促进硬脂酰乳酸钙充分分散到水中，获得稳定和均匀的分散液。
进一步，一种澳洲坚果蛋白的制备方法在制备保健食品中的应用。
采用上述技术方案，澳洲坚果蛋白具有较高的营养价值和良好的保健功效，而由本法制备的蛋白提取物具有较高的品质。可将本制备方法应用到含澳洲坚果蛋白的保健食品的生产当中。
具体实施方式
下面通过具体实施方式进一步详细说明，其中：
实施例1：澳洲坚果蛋白制备实例
澳洲坚果蛋白的提取步骤如下：
步骤(1)：使用澳洲坚果果仁制备脱脂坚果粕，粉碎后过40目筛，得脱脂果粕粉；
步骤(2)：将脱脂果粕粉分散于水中，脱脂果粕粉与水的用量比为1g：6ml。再加入复合酶A，混合均匀后得酶解体系A，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为8％。复合酶A为纤维素酶(aladdin，C298989，CAS号：9012-54-8)和淀粉酶(aladdin，A109181，CAS号：9000-90-2)组成的混合物，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1。对脱脂果粕粉进行酶解反应，对脱脂果粕粉进行酶解反应的温度为40℃，时间为90min，pH值为7.0。
步骤(3)：步骤(2)的酶解反应结束后，在酶解体系A中加入水，酶解体系A与水的体积比为1:3，混匀后离心取固相，离心速度为2000rpm，离心时长为30min，得沉淀A；
步骤(4)：将沉淀A分散于水中，沉淀A与水的用量比为1g：5ml，再加入复合酶B，混合均匀后得酶解体系B，复合酶B在酶解体系中的质量分数为4％。对沉淀A进行酶解反应，酶解反应的温度为60℃，时间为90min，pH值为7.0。复合酶B为中性蛋白酶(aladdin，D195752，CAS号：9068-59-1)和木瓜蛋白酶(aladdin，P164463，CAS号：9001-73-4)组成的混合物，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1.
步骤(5)：步骤(4)的酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至8.5，然后6000rpm离心30min取上清液。
步骤(6)：调整步骤(5)获得的上清液的pH值至4.5，4000rpm离心20min取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后将沉淀B置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得蛋白提取物。
按照如下方法制备脱脂坚果粕：
取澳洲坚果，去壳后得到果仁，将果仁粉碎，过40目，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：9ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为60W，时长为4min；然后过滤取固相，得滤渣A。将硬脂酰乳酸钙分散于45℃的水中，其中，硬脂酰乳酸钙的质量分数为0.4％。将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液混合，滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液的用量比为1g:4ml，得混合体系B；保持混合体系B的温度为45℃(优化方案为：保持混合体系B的温度为40-50℃，本实施例中选取45℃)，并将混合体系B静置1.5h后过滤取固相，然后用体积百分数为55％的乙醇溶液洗固相，得滤渣B。将滤渣B与体积百分数为55％的甲醇溶液混合，滤渣B和甲醇溶液的用量比为1g：2ml，得混合体系C；将混合体系C静置2-3h后过滤取固相，获得滤渣C。在滤渣C中加入有机溶剂石油醚，滤渣C和有机溶剂的用量比为1g：13ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理36h后，以6000rpm的转速离心30min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
其中，保持混合体系B的温度为40-50℃(本实施例中选取45℃)，可以保证硬脂酰乳酸钙分散液的稳定性和均匀性，硬脂酰乳酸钙不会聚集成大颗粒，同时上述温度也可以保证硬脂酰乳酸钙与果仁细胞壁中的脂类物质充分结合。使用乙醇溶液可将硬脂酰乳酸钙充分溶出，从而将硬脂酰乳酸钙连同细胞壁上的脂类物质带离细胞壁，提高了细胞壁的通透性。
实施例2：澳洲坚果蛋白制备实例
澳洲坚果蛋白的提取步骤如下：
步骤(1)：使用澳洲坚果果仁制备脱脂坚果粕，粉碎后过40目筛，得脱脂果粕粉；
步骤(2)：将脱脂果粕粉分散于水中，脱脂果粕粉与水的用量比为1g：5ml。再加入复合酶A，混合均匀后得酶解体系A，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为6％。复合酶A为纤维素酶和淀粉酶组成的混合物，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1。对脱脂果粕粉进行酶解反应，对脱脂果粕粉进行酶解反应的温度为30℃，时间为120min，pH值为7.0。
步骤(3)：步骤(2)的酶解反应结束后，在酶解体系A中加入水，酶解体系A与水的体积比为1:3，混匀后离心取固相，离心速度为2000rpm，离心时长为30min，得沉淀A；
步骤(4)：将沉淀A分散于水中，沉淀A与水的用量比为1g：5ml，再加入复合酶B，混合均匀后得酶解体系B，复合酶B在酶解体系中的质量分数为5％。对沉淀A进行酶解反应，酶解反应的温度为50℃，时间为80min，pH值为7.0。复合酶B为中性蛋白酶和胰蛋白酶(aladdin，T128775，CAS号：9002-07-7)组成的混合物，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1.
步骤(5)：步骤(4)的酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至8.5，然后6000rpm离心30min取上清液。
步骤(6)：调整步骤(5)获得的上清液的pH值至6.5，3000rpm离心30min取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后将沉淀B置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得蛋白提取物。
按照如下方法制备脱脂坚果粕：
取澳洲坚果，去壳后得到果仁，将果仁粉碎，过40目，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：8ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为50W，时长为5min；然后过滤取固相，得滤渣A。制备硬脂酰乳酸钙分散液，将硬脂酰乳酸钙分散于50℃的水中，并使硬脂酰乳酸钙的质量分数为0.5％。将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液混合，滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液的用量比为1g:2ml，得混合体系B；保持混合体系B的温度为50℃，并将混合体系B静置1h后过滤取固相，然后用体积百分数为60％的乙醇溶液洗固相，得滤渣B。将滤渣B与体积百分数为60％的甲醇溶液混合，滤渣B和甲醇溶液的用量比为1g：3ml，得混合体系C；将混合体系C静置2-3h后过滤取固相，获得滤渣C。在滤渣C中加入有机溶剂正己烷，滤渣C和有机溶剂的用量比为1g：13ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理72h后，以8000rpm的转速离心20min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
实施例3：澳洲坚果蛋白制备实例
澳洲坚果蛋白的提取步骤如下：
步骤(1)：使用澳洲坚果果仁制备脱脂坚果粕，粉碎后过40目筛，得脱脂果粕粉；
步骤(2)：将脱脂果粕粉分散于水中，脱脂果粕粉与水的用量比为1g：8ml。再加入复合酶A，混合均匀后得酶解体系A，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为9％。复合酶A为纤维素酶和淀粉酶组成的混合物，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1。对脱脂果粕粉进行酶解反应，对脱脂果粕粉进行酶解反应的温度为30℃，时间为120min，pH值为7.0。
步骤(3)：步骤(2)的酶解反应结束后，在酶解体系A中加入水，酶解体系A与水的体积比为1:3，混匀后离心取固相，离心速度为2000rpm，离心时长为25min，得沉淀A；
步骤(4)：将沉淀A分散于水中，沉淀A与水的用量比为1g：3ml，再加入复合酶B，混合均匀后得酶解体系B，复合酶B在酶解体系中的质量分数为3％。对沉淀A进行酶解反应，酶解反应的温度为60℃，时间为110min。复合酶B为胰蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的混合物，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1。
步骤(5)：步骤(4)的酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至7.5，然后5000rpm离心40min取上清液。
步骤(6)：调整步骤(5)获得的上清液的pH值至3.5，4000rpm离心25min取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后将沉淀B置于30℃烘箱中，干燥处理至恒重，得蛋白提取物。
按照如下方法制备脱脂坚果粕：
取澳洲坚果，去壳后得到果仁，将果仁粉碎，过40目，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：10ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为70W，时长为2min；然后过滤取固相，得滤渣A。制备硬脂酰乳酸钙分散液，将硬脂酰乳酸钙分散于40℃的水中，并使硬脂酰乳酸钙的质量分数为0.3％。将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液混合，滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液的用量比为1g:5ml，得混合体系B；保持混合体系B的温度为40℃，并将混合体系B静置2h后过滤取固相，然后用体积百分数为60％的乙醇溶液洗固相，得滤渣B。将滤渣B与体积百分数为50％的甲醇溶液混合，滤渣B和甲醇溶液的用量比为1g：3ml，得混合体系C；将混合体系C静置2-3h后过滤取固相，获得滤渣C。在滤渣C中加入有机溶剂石油醚，滤渣C和有机溶剂的用量比为1g：10ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理24h后，以5000rpm的转速离心30min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
对比例1
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在步骤(2)中复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为2％。
对比例2
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在步骤(2)中复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为15％。
对比例3
本对比例基本同实施例1，不同点在于，不包括步骤(2)和步骤(3)，直接用复合酶B处理脱脂坚果粕，具体如下：
将脱脂坚果粕粉分散于水中，脱脂坚果粕与水的用量比为1g：5ml，再加入复合酶B，混合均匀后得酶解体系B，复合酶B在酶解体系中的质量分数为4％。对脱脂坚果粕进行酶解反应，酶解反应的温度为60℃，时间为90min，pH值为7.0。复合酶B为中性蛋白酶和木瓜蛋白酶组成的混合物，中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的质量比为1:1。酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至8.5，然后6000rpm离心30min取上清液。上清液的pH值至4.5，4000rpm离心20min取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后将沉淀B置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得蛋白提取物。
对比例4
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在步骤(2)中，只是用质量浓度为8％的淀粉酶酶解处理脱脂果粕粉。
对比例5
本对比例基本同实施例1，不同点在于，在步骤(2)中，只是用质量浓度为8％的纤维素酶酶解处理脱脂果粕粉。
对比例6
本对比例基本同实施例1，不同点在于，不包括步骤(4)，直接将沉淀A分散于水中，沉淀A与水的用量比为1g：5ml，将pH值调整至8.5，然后再进行如步骤(6)的酸沉反应。
对比例7
本对比例基本同实施例1，不同点在于脱脂坚果粕的制备过程，不包含用硬脂酰乳酸钙处理滤渣A的步骤，具体过程为：
取澳洲坚果果仁，烘干并粉碎后，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：9ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为60W，时长为4min；然后过滤取固相，得滤渣A。将滤渣A与体积百分数为55％的甲醇溶液混合，滤渣A和甲醇溶液的用量比为1g：2ml，得混合体系C；将混合体系C静置2-3h后过滤取固相，获得滤渣C。在滤渣C中加入有机溶剂石油醚，滤渣C和有机溶剂的用量比为1g：13ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理14h后，以6000rpm的转速离心30min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
对比例8
本对比例基本同实施例1，不同点在于脱脂坚果粕的制备过程，不包含用硬脂酰乳酸钙处理滤渣A的步骤，以及不包含用甲醇处理滤渣B的步骤，具体操作过程如下：
取澳洲坚果，去壳后得到果仁，将果仁粉碎，过40目，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：9ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为60W，时长为4min；然后过滤取固相，得滤渣A。在滤渣A中加入有机溶剂石油醚，滤渣A和有机溶剂的用量比为1g：13ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理14h后，以6000rpm的转速离心30min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
对比例9
本对比例基本同实施例1，不同点在于脱脂坚果粕的制备过程，超声处理步骤的功率和时长远大于实施例1中的相应参数，不包含用硬脂酰乳酸钙处理滤渣A的步骤，以及不包含用甲醇处理滤渣B的步骤，具体操作过程如下：
取澳洲坚果，去壳后得到果仁，将果仁粉碎，过40目，然后在40℃烘箱中烘干至恒重，得果仁粉。在果仁粉中加水，果仁粉和水的用量比为1g：9ml，混合均匀后得混合体系A，超声处理混合体系A，超声处理混合体系的功率为150W，时长为30min；然后过滤取固相，得滤渣A。在滤渣A中加入有机溶剂石油醚，滤渣A和有机溶剂的用量比为1g：13ml，得提取体系。对滤渣C进行冷浸处理14h后，以6000rpm的转速离心30min取固相，将固相部分置于40℃烘箱中，干燥处理至恒重，得脱脂坚果粕。
对比例10
本对比例基本同实施例1，不同点在于脱脂坚果粕的制备过程，超声处理步骤的功率和时长远大于实施例1中的相应参数，超声处理混合体系的功率为150W，时长为30min。
对比例11
本对比例基本同实施例1，不同点在于脱脂坚果粕的制备过程，使用吐温80分散液代替硬脂酰乳酸钙分散液。吐温80分散液的制备方法为：往水中缓慢加入吐温80，边加边搅拌，水温控制在50℃，吐温80的质量分数为0.5％。
实验例1：对实施例1-实施例3，对比例7-对比例11中脱脂坚果粕中的营养成分进行分析鉴定
本实验例对脱脂坚果粕中的水分、脂肪、蛋白质与还原糖进行测定，鉴定方法参见GB5009.3-2010“食品安全国家标准食品中水分的测定”、GB/T5009.6-2003“食品中脂肪的测定”、GB 5009.5-2010“食品中蛋白质的测定”、GB/T 5009.7-2008“食品中还原糖的测定”。检测结果如表1所示，由结果可知，实施例1-实施例3脱脂坚果粕中蛋白质和还原糖的含量相差较小，也含有一定量的脂肪和水分。对比例7、对比例11中油脂没有完全提取去除，导致脱脂坚果粕中还有较多的脂肪残留。未检测对比例1-对比例6的脱脂坚果粕中的营养成分，是因为这6个对比例的脱脂坚果粕都是由实施例1的方法制备，未进行重复测量。
表1：脱脂坚果粕中的营养成分鉴定结果
实验例2：蛋白提取物中的蛋白质和多糖含量测定、蛋白提取率计算
实施例1-实施例3、对比例1-对比例11中的蛋白提取物的提取率(得率)，蛋白提取率按照如下方法计算：
提取率A：蛋白提取物的质量/澳洲坚果果仁粉的质量×100％
提取率B：蛋白提取物的质量/脱脂坚果粕的质量×100％
使用凯氏定氮法(GB/T 5511-2008“谷物和豆类氮含量测定和粗蛋白质含量计算凯氏法”)和蒽酮-硫酸法(检测方法具体见“叶阳等，3类茶中水溶性多糖及蛋白质的含量分析，安徽农业科学，2008，CNKI:SUN:AHNY.0.2008-29-095”)，分别检测实施例1-实施例3、对比例1-对比例11中的蛋白提取物中蛋白质和多糖含量。
实验结果如表2所示，实验结果分析如下：
对比例1中使用的复合酶A的质量分数较实施例1中低很多，虽然对提取率B的影响不是很大，但是最终获得的蛋白提取中多糖含量较高，没有获得纯度较高的蛋白质提取物产品。说明质量分数过低的复合酶A不具有提高蛋白质提取物中蛋白质含量(纯度)的功能，但是能够实现现有技术中纤维素酶等的通用功能，即破坏细胞壁从而增加目的产物的提取率。对比例2中使用的复合酶A的质量分数较实施例1中高很多，过高的酶浓度对提取率B、蛋白质含量和多糖含量均无较大的提升作用，说明酶浓度已经饱和，过高的酶浓度对方案并无促进作用。对比例3中未使用复合酶A处理脱脂坚果粕，导致提取率变低，且获得的蛋白提取物中含有大量的多糖杂质。对比例4中未使用复合酶A处理脱脂坚果粕，而是使用淀粉酶处理脱脂坚果粕，导致提取率低，且未降低多糖类物质在蛋白提取物中的含量。对比例5未使用复合酶A处理脱脂坚果粕，而是使用纤维素酶处理脱脂坚果粕，虽然提取率得到了提高，但是未降低多糖类物质在蛋白提取物中的含量。实施例4和实施例5说明，纤维素酶和淀粉酶联用才能达到同时提高提取率和增加蛋白纯度的目的。对比例6不使用复合酶B处理沉淀A，蛋白质提取率降低。
对比例7、对比例8，虽然提取率A和提取率B较高，但是蛋白质提取物中的杂质含量较高，因为在制备脱脂坚果粕时，油脂没有被充分去除。对比例9和对比例10，提取率A和提取率B较低，蛋白质成分在脱油步骤中大量损失。对比例11使用吐温80代替硬脂酰乳酸钙，并无辅助提取油脂的作用，导致脱脂坚果粕中有大量油脂残留，影响了后续的蛋白质的提取和纯化。
表2：实施例1-实施例3、对比例1-对比例11蛋白提取物的得率以及有效成分含量检测结果(N/A表示未检测此项目，对比例1-6直接使用实施例1中的方法制备脱脂坚果粕，未进行重复测量)
以上所述的仅是本发明的实施例，方案中公知的具体结构及特性等常识在此未作过多描述。应当指出，对于本领域的技术人员来说，在不脱离本发明结构的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些也应该视为本发明的保护范围，这些都不会影响本发明实施的效果和专利的实用性。本申请要求的保护范围应当以其权利要求的内容为准，说明书中的具体实施方式等记载可以用于解释权利要求的内容。
Claims (10)
1.一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤(1)：使用澳洲坚果果仁制备脱脂坚果粕，粉碎后得脱脂果粕粉；
步骤(2)：将脱脂果粕粉分散于水中，再加入复合酶A，混合均匀，得酶解体系A，对脱脂果粕粉进行酶解反应；复合酶A为纤维素酶和淀粉酶组成的混合物；
步骤(3)：步骤(2)的酶解反应结束后，在酶解体系A中加入水，混匀后离心取固相，得沉淀A；
步骤(4)：将沉淀A分散于水中，再加入复合酶B，混合均匀，得酶解体系B，对沉淀A进行酶解反应；复合酶B为中性蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶中的一种酶或一种以上酶组成的混合物；
步骤(5)：步骤(4)的酶解反应结束后，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至碱性，离心取上清液；
步骤(6)：调整步骤(5)获得的上清液的pH值至酸性，离心取固相，得沉淀B；对沉淀B进行干燥处理后得蛋白提取物。
2.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(2)中，脱脂果粕粉与水的用量比为1g：(5-8)ml，复合酶A在酶解体系A中的质量浓度为6-9％，纤维素酶和淀粉酶的质量比为1:1；对脱脂果粕粉进行酶解反应的温度为30-50℃，时长为60-120min。
3.根据权利要求2所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，酶解体系A与水的体积比为1:3，离心速度为1000-2000rpm，离心时长为20-30min。
4.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(4)中，沉淀A与水的用量比为1g：(3-5)ml，复合酶B在酶解体系中的质量分数为3-5％；对复合酶B进行酶解反应的温度为50-60℃，时间为80-110min。
5.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(5)中，将结束反应的酶解体系B的pH值调整至7.5-8.5，5000-6000rpm离心30-40min后取上清液。
6.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(6)中，调整步骤(5)获得的上清液的pH值至3.5-6.5，3000-4000rpm离心20-30min后取固相，得沉淀B；用丙酮洗涤沉淀B，然后在30-40℃的条件下，对沉淀B进行干燥处理后得蛋白提取物。
7.根据权利要求1所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，脱脂坚果粕的制备方法包括如下步骤：
步骤(1.1)：取澳洲坚果果仁，粉碎并烘干后，得果仁粉；在果仁粉中加水，混合均匀，得混合体系A，超声处理所述混合体系A，然后过滤取固相，得滤渣A；
步骤(1.2)：将滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液混合，得混合体系B；将混合体系B静置后过滤取固相，用乙醇溶液洗后，得滤渣B；将滤渣B与甲醇溶液混合，得混合体系C；将混合体系C静置后过滤取固相，获得滤渣C；
步骤(1.3)：使用有机溶剂对滤渣C进行提取，然后离心取沉淀；对所述沉淀进行干燥处理之后，得脱脂坚果粕。
8.根据权利要求7所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法，其特征在于，在步骤(1.1)中，果仁粉和水的用量比为1g：(8-10)ml；超声处理所述混合体系的功率为50-70W，时长为2-5min。
9.根据权利要求8所述的一种澳洲坚果油的制备方法，其特征在于，在步骤(1.2)中，所述硬脂酰乳酸钙分散液由如下方法制备：将硬脂酰乳酸钙分散于40-50℃的水中，硬脂酰乳酸钙的质量分数为0.3-0.5％；滤渣A与硬脂酰乳酸钙分散液的用量比为1g:(2-5)ml。
10.根据权利要求1-9中任一项权利要求所述的一种澳洲坚果蛋白的制备方法在制备保健食品中的应用。
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