CN109700855A

CN109700855A - 一种从莲蓬中提取原花青素的方法

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Publication number: CN109700855A
Application number: CN201910132222.1A
Authority: CN
Inventors: 葛彬洁; 王建美; 吴佳红; 林小柯; 王学华
Original assignee: Jinhua Polytechnic
Current assignee: Jinhua Polytechnic
Priority date: 2019-02-22
Filing date: 2019-02-22
Publication date: 2019-05-03

Abstract

本发明提供了一种从莲蓬中提取原花青素的方法，属于天然活性物质提取技术领域。从莲蓬中提取原花青素的方法，包括以下步骤：将莲蓬粉、纤维素酶、果胶酶和水混合，调pH值至3.0～4.5，酶解一定时间；将酶解液和丙酮混合，得到的混合液进行闪式提取60～120s，得到的提取料液固液分离，得到原花青素提取液；所述丙酮水溶液的体积浓度为55％～75％；所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g。本发明采用酶解闪式提取技术，实现快速、高得率的提取目的。同时所述方法仅进行一次闪式提取，大大缩短提取时间，提高了提取效率，减少提取成本和溶剂的使用量。

Description

一种从莲蓬中提取原花青素的方法

技术领域

本发明属于天然活性物质提取技术领域，具体涉及一种从莲蓬中提取原花青素的方法。

背景技术

原花青素是一种有着特殊分子结构的生物类黄酮混合物，其低聚物:低聚原花青素(OPC)是目前国际上公认的清除人体内自由基有效的天然抗氧化剂。一般为红棕色粉末，气微、味涩，溶于水和大多有机溶剂。原花青素的功效特别广泛，例如从银杏叶中提取，原花青素纯度低，与银杏黄酮结合，主要溶解、清除血栓，缓解症状，但对受损组织的修复、防止血栓的形成效果不明显。原花青素与植物黄酮、磷脂结合清除血栓同时，改善血管质量和输送能力。原花青素加上亚油酸、熊果酸等，能快速消除血栓，软化修复血管，更能从源头上改善血液质量和血管环境，逆转病变，彻底消除血栓形成、血管硬化的根本原因。

目前，原花青素的提取方法有水溶剂提取法、有机溶剂提取法、超声提取法、微波提取法、超临界提取法等。每种提取方法都存在着各自的优缺点，例如有机溶剂提取法能高效提取原花青素，但是有机溶剂回收及后续处理增加成本，同时对环境造成一定污染。但是现有的原花青素的提取方法普遍存在提取得率低的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种从莲蓬中提取原花青素的方法，所述方法具有原花青素提取得率高的优势。

本发明提供的一种从莲蓬中提取原花青素的方法，包括以下步骤：

1)将莲蓬粉、纤维素酶、果胶酶和水混合，调得到的料液的pH值至3.0～4.5，酶解一定时间，得到酶解液；

2)将步骤1)中所述酶解液和丙酮混合，调整得到的混合液中丙酮水溶液的体积浓度为55％～75％，闪式提取60～120s，得到的提取料液固液分离，收集液相，得到原花青素提取液；

所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g。

优选的，步骤2)中调整混合液中丙酮的体积浓度为69％。

优选的，步骤2)中所述混合液中莲蓬粉质量和丙酮水溶液的体积比为1g：48ml。

优选的，步骤2)中闪式提取的时间为98s。

优选的，步骤2)中闪式提取在闪式提取罐中进行，所述闪式提取时电压为70V。

优选的，步骤2)中所述闪式提取的次数为1次。

优选的，步骤1)中莲蓬粉的粒径为40目筛。

优选的，步骤1)中莲蓬粉的质量、纤维素酶的质量、果胶酶的质量和水的体积为1g：13～15mg：1～3mg：9～11ml；

所述纤维素酶、果胶酶的比活力均为45～55U/mg。

优选的，步骤1)中酶解的温度45～65℃。

优选的，步骤1)中酶解的时间为1.0～2.0h。

本发明提供的一种从莲蓬中提取原花青素的方法，采用酶解闪式提取法提取莲蓬中的原花青素，是在传统溶剂法提取的基础上，先根据植物细胞壁的构成，利用酶的反应所具有的高度专一性特点，选择相应的酶，将细胞壁的组成成分降解或水解，破坏细胞壁结构，使构成植物细胞壁等不易利用的植物纤维分解成葡萄糖，果胶酶是使细胞间的果胶质降解，转化为可溶性的果胶，从而有利于有效成分从植物中溶出；再通过闪式提取技术，即依靠高速机械剪刀力和超动分子渗透，在常温及溶剂存在下几秒钟内把莲蓬破碎至细微颗粒，使原花青素快速的被丙酮分子包围、解离、替代，最后脱离莲蓬进入溶剂中，原花青素迅速达到组织内外平衡，从而实现了快速、高得率的提取目的。实验证明：采用此工艺条件实验，莲蓬原花青素的平均得率为7.99％～8.23％，与现有技术中采用传统的单纯水蒸气蒸馏法提取的得率5.84％～6.27％和丙酮回流提取的得率6.89％～7.11％相比，提取得率有显著提高。同时本发明提供的提取方法仅进行一次闪式提取，大大缩短提取时间(回流提取法一次2h，一般需提取两次)，提高了提取效率，同时减少提取成本和溶剂的使用量。

附图说明

图1为本发明提供的原花青素标准曲线。

具体实施方式

所述丙酮水溶液的体积浓度为55％～75％；

所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g。

本发明将莲蓬粉、纤维素酶、果胶酶和水混合，调得到的料液的pH值至3.0～4.5，酶解，得到酶解液。

在本发明中，所述莲蓬粉是将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，粉碎得到。莲蓬粉的粒径优选为40目筛。莲蓬粉的质量、纤维素酶的质量、果胶酶的质量和水的体积优选为1g：13～15mg：1～3mg：9～11ml，更优选为1g：14mg：2mg：10ml；所述纤维素酶、果胶酶的比活力优选为45～55U/mg。本发明对所述莲蓬、纤维素酶和果胶酶的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的莲蓬、纤维素酶和果胶酶的来源即可。所述酶解的温度优选为45～65℃，更优选为55℃。所述酶解的时间优选为1.0～2.0h，更优选为1.5h。

得到酶解液，本发明将所述酶解液和丙酮混合，得到的混合液闪式提取60～120s，得到的提取料液固液分离，收集液相，得到原花青素提取液；所述丙酮水溶液的体积浓度为55％～75％；所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g。

在本发明中，所述混合液中丙酮的体积浓度优选为69％。

在本发明中，所述混合液中莲蓬粉质量和丙酮水溶液的体积比优选为1g：48ml。闪式提取的时间优选为98s。闪式提取优选在闪式提取罐中进行，所述闪式提取时电压优选为70V。所述闪式提取的次数优选为1次。本发明对所述闪式提取罐的来源和型号没有特殊限制，采用本领域所熟知的闪式提取罐即可。在本发明实施例中，所述闪式提取罐购自河南金鼎科技发展有限公司。

在本发明中，所述固液分离优选为过滤。本发明对所述过滤的方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的过滤方案即可。所述过滤的孔径优选为小于40目。收集的液相用丙酮水溶液补足提取过程中减少的溶液体积。

在本发明中，为了定量测定莲蓬提取物中，原花青素的含量，优选绘制原花青素标准曲线，根据原花青素标准曲线计算其含量。

所述绘制原花青素标准曲线的方法优选包括以下步骤：精密称取原花青素对照品10.5mg，置于10ml容量瓶，用甲醇定容，摇匀，得1.05mg/ml的原花青素对照品贮备液，配制成浓度为0.0525、0.105、0.1575、0.210、0.315和0.630mg/ml的系列对照品溶液。精密移取上述对照品溶液和空白对照(甲醇溶液)各1ml，分别置于10ml容量瓶中，加入质量分数为3％香草醛-甲醇溶液3ml和浓盐酸溶液1.5ml，摇匀，在25℃条件下避光显色30min，取出，用空白对照调零，使用紫外可见分光光度计在500nm处测定吸光度值。以吸光度(A)为纵坐标，以溶液浓度(C)为横坐标，绘制原花青素标准曲线。得线性回归方程：A＝-0.1300+3.653C，线性范围为0.0525～0.315mg/mL，r＝0.9997，线性关系良好。

根据标准曲线的回归方程计算供试品溶液中的原花青素浓度。得率计算公式如下：得率/％＝提取液中原花青素质量/莲蓬投料量*100％。经计算本发明提供的方法，原花青素的得率为7.12％～8.24％。

下面结合实施例对本发明提供的一种莲蓬中提取原花青素的方法进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉10g，放入锥形瓶中，加入130mg纤维素酶和30mg果胶酶，加90ml水混合，调整混合液的pH值为4.5，50℃下酶解2h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到55％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取60s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得供试品溶液。

实施例2

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉20g，放入锥形瓶中，加入280mg纤维素酶和80mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3，65℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到75％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取120s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得供试品溶液。

实施例3

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉15g，放入锥形瓶中，加入210mg纤维素酶和45mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3.5，45℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到60％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取100s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得供试品溶液。

对比例1

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉20g，放入锥形瓶中，加入280mg纤维素酶和80mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3，65℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到75％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取120s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相，将滤渣按照上述闪式提取方法再次提取2次，合并3次提取的液相得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到对照品溶液。

对比例2

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉15g，放入锥形瓶中，加入210mg纤维素酶和45mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3.5，45℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到50％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取100s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相，得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到对照品溶液。

对比例3

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉15g，放入锥形瓶中，加入210mg纤维素酶和45mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3.5，45℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到60％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g，闪式提取180s，用丙酮水溶液补足减少的重量，过滤，收集液相，得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得到对照品溶液。

实施例4

精密移取贮备液，配置成浓度为0.0525、0.105、0.1575、0.210、0.315和0.630mg/ml的系列对照品溶液。精密移取上述对照品溶液和空白对照(甲醇溶液)各1ml，分别置于10ml容量瓶中，加入质量分数为3％香草醛-甲醇溶液3ml和浓盐酸溶液1.5ml，摇匀，在25℃条件下避光显色30min，取出，用空白对照调零，使用紫外可见分光光度计在500nm处测定吸光度值。

以吸光度(A)为纵坐标，以溶液浓度(C)为横坐标，绘制原花青素标准曲线。得线性回归方程：A＝-0.1300+3.653C，线性范围为0.0525～0.315mg/mL，r＝0.9997，线性关系良好。

实施例5

将实施例1～3试品溶液和对比例1～3提取得到的对照溶液按照实施例4中测定原花青素的含量的方法测定提取液中原花青素中含量。根据标准曲线的回归方程计算供试品溶液中的原花青素浓度。得率计算公式如下：得率/％＝提取液中原花青素质量/莲蓬投料量*100％。结果见表1。

表1实施例1～3试品溶液和对比例1～3对照溶液中花青素的含量和得率

对比例4

将新鲜莲蓬用干燥箱烘干，干品过40目筛，准确称取该干莲蓬粉15g，放入锥形瓶中，加入210mg纤维素酶和45mg果胶酶，加200ml水混合，调整混合液的pH值为3.5，45℃下酶解1h，酶解结束后将酶解液放入闪式提取罐中，加入丙酮，调整丙酮水溶液的浓度达到60％，使所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的70ml：1g，闪式提取100s，用丙酮溶液补足减少的重量，过滤，收集液相，得莲蓬提取液。精密移取莲蓬提取液1ml于100ml容量瓶中，用甲醇定容，摇匀，得对照品溶液。

对比例5

水回流提取法：称取莲蓬适量，每份干莲蓬10g，用500ml圆底烧瓶回流提取，加适量水提取，每次提取一定时间，提取温度100℃，混合提取液得回流提取法的供试品。选择提取时间、提取次数和液料比三个因素设计正交设计实验，具体见表2。以莲蓬中原花青素的得率为指标，采用L9(34)正交设计表优化其水回流提取工艺。

表2正交试验设计L9(34)因素水平表

水回流提取法莲蓬中原花青素的最佳工艺参数结果见表3。

表3正交试验结果

根据单因素试验结果设计的表1进行试验，实验结果进行数据分析得各水平平均值(均值1、2、3)及各因素的极差，见表3。由表3可知，水回流提取工艺各因素对莲蓬中原花青素得率影响的程度依次为A>C>B，即提取次数>料液比>提取时间，三个因素对莲蓬中原花青素的回流提取得率的最佳工艺条件为A₃B₂C₃，即提取三次，按16倍的液料比，每次提取2h，考虑到提取三次耗能较大，企业常规生产多采用提取两次，因此选择最佳工艺条件A₂B₂C₃。对正交试验结果的3个因素进行显著性检验，结果见表4。由表4可知，回流提取莲蓬中原花青素的正交试验中，提取次数对原花青素的提取率有显著影响。根据正交实验优化所得的工艺组合(A₂B₂C₃)进行3次平行验证实验。

表4因素方差分析表

因素	III型平方和	df	均方	F	P
						A/提取次数	5.312	2	2.656	42.84	*
B/提取时间	0.065	2	0.032	0.52
						C/料液比	0.982	2	0.491	7.92
D/误差	0.183	2

注：*代表有显著差异

对比例6

丙酮回流提取法：称取莲蓬适量，每份干莲蓬10g，用500ml圆底烧瓶回流提取，以一定体积分数的丙酮为溶剂，提取2次，每次提取一定时间，提取温度90℃，混合提取液得回流提取法的供试品。选择丙酮体积分数、提取时间、液料比三个因素进行正交实验，具体见表5。以莲蓬中原花青素的得率为指标，采用L9(34)正交设计表优化其乙醇回流提取工艺。

表5正交试验设计L9(34)因素水平表

乙醇回流提取法莲蓬中原花青素的最佳工艺参数结果见表5。

表6正交试验结果

根据单因素试验结果设计的表5进行试验，实验结果进行数据分析得各水平平均值(均值1、2、3)及各因素的极差，见表6。由表6可知，丙酮回流提取工艺各因素对莲蓬中原花青素得率影响的程度依次为A>B>C，即丙酮体积分数>提取时间>料液比，三个因素对莲蓬中原花青素的回流提取得率的最佳工艺条件为A₁B₃C₁，即提取溶剂乙醇体积分数为50％，提取三次，按8倍的液料比，每次提取3h，考虑到提取3小时耗能较大，且提取2h和3h极差相差较小，从节能的角度考虑，选择提取时间为2h，即选择最佳工艺条件A₁B₂C₁。对正交试验结果的3个因素进行显著性检验，结果见表7。由表7可知，回流提取莲蓬中原花青素的正交试验中，三个因素对原花青素的提取率有显著影响，其中乙醇体积分数对提取率有极显著影响。根据正交实验优化所得的工艺组合(A₁B₂C₁)进行3次平行验证实验。

表7因素方差分析表

注：F_0.05(2,2)＝19，F_0.01(2,2)＝99。

将实施例3、对比例5和对比例6中采用3种不同提取法莲蓬中原花青素的得率比较

根据上述实验结果，采用三种提取方法的最佳工艺进行验证实验。实验结果见表8。

表8莲蓬原花青素提取最优工艺验证实验结果及比较

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种从莲蓬中提取原花青素的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)将莲蓬粉、纤维素酶、果胶酶和水混合，调得到的料液的pH值3.0～4.5，酶解一定时间，得到酶解液；

所述丙酮水溶液的体积与莲蓬粉质量的35～55ml：1g。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中调整得到的混合液中丙酮水溶液的体积浓度为69％。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述混合液中莲蓬粉质量和丙酮水溶液的体积比为1g：48ml。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)中闪式提取的时间为98s。

5.根据权利要求1～4任意一项所述的方法，其特征在于，步骤2)中闪式提取在闪式提取罐中进行，所述闪式提取时电压为70V。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中所述闪式提取的次数为1次。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中莲蓬粉的粒径为40目筛。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)中莲蓬粉的质量、纤维素酶的质量、果胶酶的质量和水的体积为1g：13～15mg：1～3mg：9～11ml；

所述纤维素酶或果胶酶的比活力独立为45～55U/mg。

9.根据权利要求1、6和7任意一项所述的方法，其特征在于，步骤1)中酶解的温度45～65℃。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，步骤1)中酶解的时间为1.0～2.0h。