CN111714570A - 一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法及黄酮 - Google Patents

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Abstract

本发明属于菠萝果皮黄酮的分离纯化技术，具体涉及一种大孔树脂吸附分离纯化菠萝果皮黄酮的工艺。本发明菠萝果皮先用脱脂剂进行脱脂处理，再用乙醇浸提，将得到的黄酮粗提取液用最佳方案进行纯化处理。本发明通过找到最佳的分离纯化方法，采用大孔树脂D101进行分离纯化，得到了纯度较高的黄酮。本发明分离纯化菠萝果皮所得的黄酮回收率可达60.16％，纯度达86.72％。纯化后的菠萝果皮黄酮抗氧化活性强于未纯化的黄酮和BHT。因此，本发明得到的纯度较高、抗氧化性能强的菠萝黄酮产品，为将来进一步进行菠萝果皮黄酮工业化生产和提高菠萝皮的利用价值提供科学依据。

Description

一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法及黄酮
技术领域
本发明属于菠萝果皮黄酮的分离纯化技术，具体涉及一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法及黄酮。
背景技术
菠萝为凤梨俗称，也叫黄梨、番梨，是凤梨科凤梨属草本果树，其果实是由众多小果组成的聚合果。菠萝皮渣占全果重量的50％～60％，其中果皮约占三成，而无论在日常生活还是工厂生产中，人们往往直接舍弃菠萝果皮，只取果肉进行利用。据报道，菠萝果皮与果肉的营养物质相近,废弃菠萝果皮将造成资源的极大浪费。研究表明，菠萝果皮富含黄酮类物质。黄酮是一类具有众多生物活性的化学物质，在医学等方面具有广泛的用途，具有抗凝血、降血糖、抗肿瘤、抗抑郁、抗病毒、抑菌、清除体内过剩自由基、延缓衰老等生理活性。国内外关于黄酮的提取报道较多，目前主要有溶剂萃取法、微波、超声波、酶提取法等，但这类方法得到的黄酮纯度低，影响其功效。
大孔树脂吸附法是近年来广泛使用的一种纯化方法，相对其他纯化方法具有选择性好、无毒和无污染等优点，但不同的大孔树脂特性不同，其适用对象也不相同。因此，为了减少菠萝果皮直接丢弃造成的损失，本发明旨在充分利用菠萝果皮资源，采用微波加热方式对其中黄酮进行提取后,利用大孔树脂吸附的原理优化适宜菠萝果皮黄酮粗品分离纯化的大孔树脂和工艺参数，得到纯度高、抗氧化性能强的菠萝黄酮产品，为将来进一步进行菠萝果皮黄酮工业化生产和提高菠萝皮的利用加值提供科学依据。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法；所述方法的工艺简单方便，分离纯化效果好，再生使用周期长的大孔树脂分离纯化菠萝果皮黄酮的工艺。
本发明另一目的在于提供上述方法制备得到的菠萝果皮黄酮。
本发明为实现上述发明的目的采用的技术方案如下：
一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤1、菠萝果皮黄酮粗提液的制备
将菠萝果皮与脱脂剂混合脱脂，得到脱脂后的菠萝果皮；然后再于乙醇溶液中浸泡后，进行微波加热提取；将所得溶液旋蒸，得到黄酮粗提取液；
步骤2、菠萝果皮黄酮分离纯化
将预处理过的大孔树脂湿法装柱于层析柱中，取0.3mg/mL～1.5mg/mL黄酮粗提液以0.5mL/min～2mL/min的速度进行吸附；将吸附后的大孔树脂湿法装柱，在层析柱中以60％～80％的乙醇溶液以0.5mL/min～2mL/min流速进行洗脱；旋蒸所得洗脱液后得到黄酮。
步骤1所述脱脂剂为乙醚、石油醚和乙酸乙酯中的至少一种，优选为石油醚。
步骤1所述菠萝果皮与脱脂剂的固液比为1:1～3(w/v)，优选为1:2(w/v)；
步骤1所述乙醇溶液的体积分数优选为70％；所述脱脂后的菠萝果皮与乙醇溶液的固液比为1:20～50(w/v)，优选为1:30(w/v)。
步骤1所述浸泡时间为4～6h；所述微波加热提取时的功率为300～700W，提取时间为5～15min；优选的所述微波加热提取时的功率为600W，提取时间为10min。
步骤2所述的大孔树脂为AB8、D101或H103，优选为D101。
步骤2所述树脂的预处理过程为：将用蒸馏水洗去大孔树脂中的细碎树脂，然后用乙醇充分浸泡后倒出浸液，继续用乙醇冲洗树脂至洗出液加水不出现浑浊，再用水洗至无醇味；然后使用HCl溶液对树脂进行酸洗，而后用蒸馏水洗至中性；再用NaOH溶液进行碱洗，用水洗至中性，即处理完毕。
步骤2所述的大孔树脂使用时间较长、次数较多后，为了保持树脂的活性，应在使用一段时间后对树脂进行强化再生，其方法为：在装有树脂的容器内加入3％～5％盐酸溶液浸泡4小时，然后用同一浓度的盐酸溶液淋洗3～5次，用蒸馏水洗至接近中性。再用3％～5％的氢氧化钠溶液浸泡4小时，用相同浓度的氢氧化钠溶液淋洗3～5次,最后用蒸馏水清洗至中性，备用即可。
步骤2所述黄酮粗提液的浓度优选为0.6mg/mL～1.2mg/mL；所述的吸附流速优选为1mL/min；所述的洗脱流速优选为1mL/min～2mL/min；所述的乙醇溶液体积分数优选为65％～75％。
本发明的有益效果是：
1.本发明采用D101大孔树脂对菠萝果皮黄酮进行分离纯化，吸附率达到56.042％，解析率达到81.408％，纯度达86.7％，比报道用AB8大孔树脂纯化菠萝果皮黄酮纯度35.65％显著高。
2.相比于传统黄酮粗提液制备直接用乙醇抽滤，本发明菠萝果皮先用石油醚进行脱脂处理，再用乙醇浸提，将得到的黄酮粗提取液用最佳方案进行纯化处理。回收率达到60.16％，纯度高达86.72％，并且本发明对比了先用石油醚脱脂再用乙醇浸提和先用乙醇浸提再用石油醚脱脂，得出先用石油醚脱脂的黄酮提取率比先用乙醇浸提的提高了37.98％，本方案所得黄酮纯度远高于报道的方法所得的纯度。
3.本发明所得纯化后的黄酮在清除DPPH自由基、羟基自由基方面皆取得很好的效果。在清除DPPH自由基方面，0.1mg/mL黄酮纯化前对DPPH的抑制率为90.62％，纯化后对DPPH的抑制率可达到93.89％，并且纯化前后的黄酮抗氧化性皆强于BHT；在清除羟基自由基方面，0.1mg/mL黄酮纯化前对羟基自由基的抑制率为70.33％，纯化后对羟基自由基的抑制率可达到78.64％，而且纯化前后的黄酮抗氧化活性皆强于BHT，具体见表5。
4.本发明提供的分离纯化菠萝果皮黄酮的方法，操作简单，原料来源广，回收率高，纯度高，提高了菠萝果皮的经济价值，适合企业和规模化生产。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用试剂如无特殊说明均可从市场常规购得。
实施例1
一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，包括如下步骤：
步骤1、菠萝果皮粉末制备
将菠萝果皮洗净，放入烘箱内以60℃～70℃进行烘干处理。取出干燥的菠萝皮后用粉碎机打碎，并将果皮粉末装入洁净密封袋中，放在冰箱内保存。
步骤2、菠萝果皮黄酮粗提液的制备
准确称取一定量烘干的菠萝果皮粉于1000mL烧杯中，以固液比1:2(w/v)的石油醚进行脱脂，待石油醚蒸干后，得到脱脂后的菠萝果皮，再以固液比1:30(w/v)体积分数70％的乙醇浸泡4～6h，搅拌均匀后转入2000mL二口平底烧瓶中，然后在微波功率600W下提取10min，趁热抽滤，转入旋转蒸发仪中蒸发浓缩至无乙醇为止，储存备用。
步骤3、大孔树脂的预处理
适量D101大孔树脂装入烧杯，用蒸馏水洗去细碎树脂，用95％乙醇充分浸泡24h后倒出浸液，继续用95％乙醇冲洗树脂至洗出液加水不出现浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。将5％的HCl溶液对树脂进行酸洗，而后用蒸馏水洗至中性。再用2％的NaOH溶液进行碱洗，用蒸馏水洗至pH值为7，即处理完毕。
步骤4、菠萝果皮黄酮分离纯化
称取预处理过的树脂20.0g，湿法装柱于层析柱中，取1.2mg/mL，20mL的黄酮粗提液以1mL/min的速度进行吸附。吸附完成后测定滤液中黄酮的浓度，计算其吸附量。将吸附后的大孔树脂湿法装柱，在层析柱中分别以65％的乙醇溶液以1mL/min流速进行洗脱，旋蒸所得洗脱液后得到黄酮。洗脱后用蒸馏水将树脂冲洗至流出液为无色透明清液，测定洗脱液吸光度。
实施例2
步骤1、菠萝果皮粉末制备
将菠萝果皮洗净，放入烘箱内以60℃～70℃进行烘干处理。取出干燥的菠萝皮后用粉碎机打碎，并将果皮粉末装入洁净密封袋中，放在冰箱内保存。
步骤2、菠萝果皮黄酮粗提液的制备
准确称取一定量烘干的菠萝果皮粉于1000mL烧杯中，以固液比1:2(w/v)的石油醚进行脱脂，待石油醚蒸干后，得到脱脂后的菠萝果皮，再以固液比1:30(w/v)体积分数70％的乙醇浸泡4～6h，搅拌均匀后转入2000mL二口平底烧瓶中，然后在微波功率600w下提取10min，趁热抽滤，转入旋转蒸发仪中蒸发浓缩至无乙醇为止，储存备用。
步骤3、大孔树脂的预处理
适量D101大孔树脂装入烧杯，用蒸馏水洗去细碎树脂，用95％乙醇充分浸泡24h后倒出浸液，继续用95％乙醇冲洗树脂至洗出液加水不出现浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。将5％的HCl溶液对树脂进行酸洗，而后用蒸馏水洗至中性。再用2％的NaOH溶液进行碱洗，用蒸馏水洗至pH值为7，即处理完毕。
步骤4、菠萝果皮黄酮分离纯化
称取预处理过的树脂20.0g，湿法装柱于层析柱中，取1.2mg/mL，20mL的黄酮粗提液以1.5mL/min的速度进行吸附。吸附完成后测定滤液中黄酮的浓度，计算其吸附量。将吸附后的大孔树脂湿法装柱，在层析柱中分别以75％的乙醇溶液以1.5mg/mL流速进行洗脱，旋蒸所得洗脱液后得到黄酮。洗脱后用蒸馏水将树脂冲洗至流出液为无色透明清液，测定洗脱液吸光度。
实施例3
步骤1、菠萝果皮粉末制备
将菠萝果皮洗净，放入烘箱内以60℃～70℃进行烘干处理。取出干燥的菠萝皮后用粉碎机打碎，并将果皮粉末装入洁净密封袋中，放在冰箱内保存。
步骤2、菠萝果皮黄酮粗提液的制备
准确称取一定量烘干的菠萝果皮粉于1000mL烧杯中，以固液比1:2(w/v)的石油醚进行脱脂，待石油醚蒸干后，得到脱脂后的菠萝果皮，再以固液比1:30(w/v)体积分数70％的乙醇浸泡4～6h，搅拌均匀后转入2000mL二口平底烧瓶中，然后在微波功率600w下提取10min，趁热抽滤，转入旋转蒸发仪中蒸发浓缩至无乙醇为止，储存备用。
步骤3、大孔树脂的预处理
适量D101大孔树脂装入烧杯，用蒸馏水洗去细碎树脂，用95％乙醇充分浸泡24h后倒出浸液，继续用95％乙醇冲洗树脂至洗出液加水不出现浑浊，再用蒸馏水洗至无醇味。将5％的HCl溶液对树脂进行酸洗，而后用蒸馏水洗至中性。再用2％的NaOH溶液进行碱洗，用蒸馏水洗至pH值为7，即处理完毕。
步骤4、菠萝果皮黄酮分离纯化
称取预处理过的树脂20.0g，湿法装柱于层析柱中，取1.2mg/mL，20mL的黄酮粗提液以2mL/min的速度进行吸附。吸附完成后测定滤液中黄酮的浓度，计算其吸附量。以70％的乙醇溶液以2mL/min流速进行洗脱，旋蒸所得洗脱液后得到黄酮。洗脱后用蒸馏水将树脂冲洗至流出液为无色透明清液，测定洗脱液吸光度。
对比例1～2
对比例1～2与实施例1的不同之处在于大孔树脂的型号不同，具体见表1，其所测得的吸附和解吸性能见表2。
对比例3
对比例3与实施例1的不同之处在于步骤黄酮提取过程中的脱脂顺序不同，对比例采用先用乙醇浸提，得到的滤液以1:1的比例用石油醚进行脱脂，其他一致，提取率见表3。
对比例4
对比例4与实施例1的不同之处在于黄酮粗提液不使用石油醚脱脂。
对比例5～12与对比例4的不同之处在于吸附流速、洗脱流速、洗脱剂浓度进行不同的配比，具体见表4。
表1实施例1与对比例1～2的菠萝果皮黄酮分离纯化的树脂及参数
Figure BDA0002484406510000071
表2不同大孔树脂对菠萝果皮黄酮的吸附和解吸性能
Figure BDA0002484406510000072
Figure BDA0002484406510000081
表2显示，H103树脂的解析率较低，AB8树脂的吸附率较低，而D101树脂的吸附率和解析率都比较适中，故选择D101大孔树脂为纯化菠萝果皮黄酮的树脂。
表3石油醚脱脂顺序对菠萝果皮黄酮提取率的影响
菠萝果皮粉 脱脂顺序 黄酮提取率(％)
实施例1 先脱脂，后乙醇提取 2.056
对比例3 先乙醇提取，后脱脂 1.490
从表3可以看出，先脱脂的菠萝果皮黄酮提取率比后脱脂的提取率高出37.98％，表明先脱脂有利于提高黄酮的提取率，这可能是由于干粉已经除去水分，用石油醚进行提取，除去一些脂溶性物质，有利于之后提取中乙醇的渗入和黄酮成分的溶出。同时采用先脱脂的方法，能大大节省石油醚的用量，降低成本，且便于操作。
表4实施例1～3与对比例4～11不同条件下菠萝果皮黄酮的回收率
Figure BDA0002484406510000082
Figure BDA0002484406510000091
从表4可以看出，菠萝果皮黄酮粗提液使用石油醚进行脱脂显著提高了回收率。实施例1是最佳分离纯化方案，用石油醚进行萃取去除脂类物质后，黄酮的回收率达到了60.16％，纯度达86.72％。
纯化后菠萝果皮黄酮清除DPPH自由基、对羟基自由基的抑制率明显高于纯化前，具体见表5。
表5纯化前后黄酮溶液清除自由基、羟基自由基的抑制率
Figure BDA0002484406510000092
从表5可以看出，在清除DPPH自由基方面，纯化后的黄酮抗氧化活性强于未纯化的黄酮，纯化黄酮对DPPH的抑制率可达到94.89％；在清除羟基自由基方面，纯化后的黄酮抗氧化活性强于未纯化的黄酮，纯化黄酮对羟基自由基的抑制率可达到99.67％,而且纯化前后的黄酮抗氧化活性皆强于BHT,随着使用浓度的增大，菠萝果皮黄酮纯化物以及BHT的抗氧化性都相应增强。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于包括如下步骤：
步骤1、菠萝果皮黄酮粗提液的制备
将菠萝果皮与脱脂剂混合脱脂，得到脱脂后的菠萝果皮；然后再于乙醇溶液中浸泡后，进行微波加热提取；将所得溶液旋蒸，得到黄酮粗提取液；
步骤2、菠萝果皮黄酮分离纯化
将预处理过的大孔树脂湿法装柱于层析柱中，取0.3mg/mL～1.5mg/mL黄酮粗提液以0.5mL/min～2mL/min的速度进行吸附；将吸附后的大孔树脂湿法装柱，在层析柱中以60％～80％的乙醇溶液以0.5mL/min～2mL/min流速进行洗脱；旋蒸所得洗脱液后得到黄酮。
2.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤1所述脱脂剂为乙醚、石油醚和乙酸乙酯中的至少一种。
3.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤1所述菠萝果皮与脱脂剂的固液比为1:1～3w/v。
4.根据权利要求1或2或3所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤1所述脱脂后的菠萝果皮与乙醇溶液的固液比为1:20～50w/v。
5.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤1所述浸泡时间为4～6h；所述微波加热提取时的功率为300～700W，提取时间为5～15min。
6.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤2所述的大孔树脂为AB8、D101或H103。
7.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：步骤2所述树脂的预处理过程为：将用蒸馏水洗去大孔树脂中的细碎树脂，然后用乙醇充分浸泡后倒出浸液，继续用乙醇冲洗树脂至洗出液加水不出现浑浊，再用水洗至无醇味；然后使用HCl溶液对树脂进行酸洗，而后用蒸馏水洗至中性；再用NaOH溶液进行碱洗，用水洗至中性，即处理完毕。
8.根据权利要求1所述的菠萝果皮黄酮的分离纯化方法，其特征在于：
步骤2所述的黄酮粗提液的浓度为0.6mg/mL～1.2mg/mL；所述的吸附流速为1mL/min；所述的洗脱流速为1mL/min；所述的乙醇溶液体积分数为65％～75％。
9.根据权利要求1～8任一项所述方法制备得到的菠萝果皮黄酮。
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