CN108634088A - 一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，包括以下步骤：对镉污染稻米进行脱脂处理，得到脱脂稻米粉；使用去离子水对脱脂稻米粉进行搅拌提取，获得清蛋白提取物和第一沉淀物；使用NaCl溶液对第一沉淀物进行搅拌提取，获得球蛋白提取物和第二沉淀物；使用NaOH溶液对第二沉淀物进行搅拌提取，获得谷蛋白提取物和第三沉淀物；使用乙醇溶液对第三沉淀物进行搅拌提取，获得醇溶蛋白提取物。本发明提供的技术方案中，采用Osborne分级提取与等电点沉淀相结合的方法提取镉污染稻米中的镉结合蛋白，具有提取的蛋白种类更全面、蛋白纯度更高的优点，且提取效率高、操作简单。

Description

一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法

技术领域

本发明涉及食品加工技术领域，特别涉及一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法。

背景技术

研究表明，在稻米中重金属镉主要和蛋白质以络合物的形式存在。目前对于稻米中镉结合蛋白的提取形式众多，如Osborne分级提取法、组织化学及溶剂提取法、碱液提取法和Tris-HCl提取法等。然而，上述稻米中镉结合蛋白的提取方法主要存在蛋白粗提物中杂质含量较高、蛋白纯度较低、以及蛋白种类较为单一、使用范围较窄的缺点。

发明内容

本发明的主要目的是提出一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，旨在解决现有稻米中镉结合蛋白的提取方法存在蛋白纯度较低、蛋白种类较为单一的问题。

为实现上述目的，本发明提出一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，包括以下步骤：

将镉污染稻米粉碎成稻米粉，然后将稻米粉加入到正己烷中，进行第一次搅拌提取后离心、干燥，得到脱脂稻米粉；

使用去离子水对脱脂稻米粉进行第二次搅拌提取后离心，获得第一上清液和第一沉淀物，将第一上清液的pH值调节至清蛋白对应的等电点，使清蛋白沉降，然后再次离心并收集清蛋白沉淀，获得清蛋白提取物；

使用NaCl溶液对第一沉淀物进行第三次搅拌提取后离心，获得第二上清液和第二沉淀物，将第二上清液的pH值调节至球蛋白对应的等电点，使球蛋白沉降，然后再次离心并收集球蛋白沉淀，获得球蛋白提取物；

使用NaOH溶液对第二沉淀物进行第四次搅拌提取后离心，获得第三上清液和第三沉淀物，将第三上清液的pH值调节至谷蛋白对应的等电点，使谷蛋白沉降，然后再次离心并收集谷蛋白沉淀，获得谷蛋白提取物；

使用乙醇溶液对第三沉淀物进行第五次搅拌提取后离心，收集滤液，将滤液的pH值调节至醇溶蛋白对应的等电点，使醇溶蛋白沉降，然后再次离心并收集醇溶蛋白沉淀，获得醇溶蛋白提取物。

优选地，所述镉污染稻米中的镉含量为0.5～1.0mg/kg。

优选地，所述NaCl溶液的质量浓度为4～6％；

所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.01～0.03M，所述NaOH溶液的pH值为11；

所述乙醇溶液的体积分数为65～75％。

优选地，所述第一次搅拌提取至第五次搅拌提取的固液比均为1g：3～5mL，提取温度为20～28℃；

所述第一次搅拌提取至第三次搅拌提取、以及第五次搅拌提取的提取时间为3～5h，所述第四次搅拌提取的提取时间为0.3～0.7h。

优选地，将第一上清液、第二上清液、第三上清液及滤液的pH值对应调节至清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白对应的等电点的步骤，均采用HCl溶液调节溶液的pH值。

优选地，所述清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白对应的等电点pI分别为4.13、2.32、6.32和4.98。

优选地，所有所述离心的条件均为：离心转速2500～3500rpm，离心时间25～35min。

优选地，对应收集清蛋白沉淀、球蛋白沉淀、谷蛋白沉淀和醇溶蛋白沉淀的步骤之后，对应获得清蛋白提取物、球蛋白提取物、谷蛋白提取物和醇溶蛋白提取物的步骤之前，还包括：

蛋白沉淀经水洗后，使用HCl溶液调节蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的蛋白沉淀再于-50～-40℃、20～30Pa条件下进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。

本发明提供的技术方案中，采用Osborne分级提取与等电点沉淀相结合的方法提取镉污染稻米中的镉结合蛋白，能有效提取镉污染稻米中的清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白这四种主要的蛋白质，蛋白种类更全面，且蛋白纯度更高，提取效率高、操作简单，对蛋白特性和结构影响较小，为后续研究镉污染稻米中镉结合蛋白的分离纯化、鉴定及结合机理研究等提供了基础，有利于镉污染稻米的再利用。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1为本发明提供的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法的一实施例的流程示意图；

图2为实施例1中清蛋白提取物中清蛋白等电点的测定结果图；

图3为实施例1中球蛋白提取物中球蛋白等电点的测定结果图；

图4为实施例1中谷蛋白提取物中谷蛋白等电点的测定结果图；

图5为实施例1中醇溶蛋白提取物中醇溶蛋白等电点的测定结果图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

Osborne分级提取法是提取大米蛋白的经典方法，例如，按照去离子水、NaCl(5％)、乙醇(75％)和NaOH(0.05mol/L)的顺序，可分别提取镉污染大米中的清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白。基于上述基础，本发明提出一种稻米中结合蛋白的提取分离方法，是通过如下原理实现的：采用Osborne分级提取和等电点沉淀相结合的方法，先依次通过去离子水、NaCl(5％)、NaOH(0.05mol/L)和乙醇(75％)的顺序对应提取清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，然后将清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白对应调节至与蛋白对应的等电点(由于蛋白质表面离子化侧链的存在，蛋白质带净电荷，而这些侧链都是可以滴定的，对于每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零，即等电点pI)，使蛋白沉降，进而获得纯度较高的提取蛋白。

本发明提出一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，图1为本发明提供的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法的一实施例。请参阅图1，在本实施例中，所述稻米中镉结合蛋白的提取分离方法包括以下步骤：

步骤S10、将镉污染稻米粉碎成稻米粉，然后将稻米粉加入到正己烷中，进行第一次搅拌提取后离心、干燥，得到脱脂稻米粉；

所述镉污染稻米可以是镉污染的大米或糙米，先将镉污染稻米通过球磨机或湿法磨粉等方式制备成稻米粉，过100目筛，然后将稻米粉以1g：3～5mL的固液比加入到正己烷中搅拌提取3～5h，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min，使固液分离并收集沉淀，将沉淀放置在通风处静置过夜(也可用鼓风干燥箱等常规方式进行干燥处理)即可得到干燥的脱脂稻米粉，其中，在步骤S10中，搅拌提取时的固液比优选为1g：4mL，搅拌提取的时间优选为4h，离心转速优选为3000rpm，离心时间优选为30min；所述镉污染稻米中的镉含量优选为0.5～1.0mg/kg。

步骤S20、使用去离子水对脱脂稻米粉进行第二次搅拌提取后离心，获得第一上清液和第一沉淀物，将第一上清液调节至清蛋白对应的等电点，使清蛋白沉降，然后再次离心并收集清蛋白沉淀，获得清蛋白提取物；

以去离子水为提取溶剂，对脱脂稻米粉进行第一阶段的的蛋白提取，即提取其中的清蛋白，具体操作时优选为通过如下方式进行：将脱脂稻米粉以1g：3～5mL的固液比加入到去离子水中，于20～28℃温度下搅拌提取3～5h，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min，使固液分离而获得上清液和沉淀物，然后对沉淀物再重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，即获得第一上清液和第一沉淀物；然后使用HCl溶液(例如浓度为lmol/L的HCl溶液，下面均以所述HCl溶液的浓度为lmol/L进行说明)调节第一上清液的pH值至清蛋白对应的等电点，使清蛋白沉降，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min后收集清蛋白沉淀，即可获得清蛋白提取物；第一沉淀物则用于下一阶段的蛋白提取。其中，在步骤S20中，搅拌提取的固液比优选为1g：4mL，搅拌提取的温度优选为室温，搅拌提取的时间优选为4h，离心转速优选为3000rpm，离心时间优选为30min；清蛋白对应的等电点pI为4.13。

更优选地，为了便于清蛋白提取物的存放，在获得清蛋白沉淀之后、获得清蛋白提取物之前，优选为对获得的清蛋白沉淀进行pH值调节和冷冻干燥处理，也即，在步骤S20中，由清蛋白沉淀获得清蛋白提取物的过程还包括：步骤S21、清蛋白沉淀经水洗后，再次使用HCl溶液调节清蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将清蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的清蛋白沉淀再进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。具体可采用如下实施方式进行；水洗清蛋白沉淀三次，然后使用HCl溶液将清蛋白沉淀的pH值调节至7.0，随后将清蛋白沉淀置于-22～18℃(优选为-20℃)冻存，冻存后的清蛋白沉淀于-50～-40℃、20～30Pa条件下真空冷冻干燥3.5～4.5d(优选为4d)，即可获得高纯度的清蛋白提取物。

步骤S30、使用NaCl溶液对第一沉淀物进行第三次搅拌提取后离心，获得第二上清液和第二沉淀物，将第二上清液的pH值调节至球蛋白对应的等电点，使球蛋白沉降，然后再次离心并收集球蛋白沉淀，获得球蛋白提取物；

以NaCl溶液为提取溶剂，对第一沉淀物进行第二阶段的的蛋白提取，即提取其中的球蛋白，具体操作时优选为通过如下方式进行：将第一沉淀物以1g：3～5mL的固液比加入到质量浓度为4～6％的NaCl溶液中，于20～28℃温度下搅拌提取3～5h，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min，使固液分离而获得上清液和沉淀物，然后对沉淀物再重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，即获得第二上清液和第二沉淀物；然后使用HCl溶液调节第二上清液的pH值至球蛋白对应的等电点，使球蛋白沉降，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min后收集球蛋白沉淀，即可获得球蛋白提取物；第二沉淀物则用于下一阶段的蛋白提取。其中，在步骤S30中，NaCl溶液的质量浓度优选为5％；搅拌提取的固液比优选为1g：4mL，搅拌提取的温度优选为室温，搅拌提取的时间优选为4h，离心转速优选为3000rpm，离心时间优选为30min；球蛋白对应的等电点pI为2.32。

同样地，为了便于球蛋白提取物的存放，在获得球蛋白沉淀之后、获得球蛋白提取物之前，优选为对获得的球蛋白沉淀进行pH值调节和冷冻干燥处理，也即，在步骤S20中，由球蛋白沉淀获得球蛋白提取物的过程还包括：球蛋白沉淀经水洗后，使用HCl溶液调节球蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将球蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的球蛋白沉淀再进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。具体可采用如下实施方式进行；水洗球蛋白沉淀三次，然后使用HCl溶液将球蛋白沉淀的pH值调节至7.0，随后将球蛋白沉淀置于-22～18℃(优选为-20℃)冻存，冻存后的球蛋白沉淀于-50～-40℃、20～30Pa条件下真空冷冻干燥3.5～4.5d(优选为4d)，即可获得高纯度的球蛋白提取物。

步骤S40、使用NaOH溶液对第二沉淀物进行第四次搅拌提取后离心，获得第三上清液和第三沉淀物，将第三上清液的pH值调节至谷蛋白对应的等电点，使谷蛋白沉降，然后再次离心并收集谷蛋白沉淀，获得谷蛋白提取物；

以NaOH溶液为提取溶剂，对第二沉淀物进行第三阶段的的蛋白提取，即提取其中的谷蛋白，具体操作时优选为通过如下方式进行：将第二沉淀物以1g：3～5mL的固液比加入到摩尔浓度为0.01～0.03M、pH值为11的NaOH溶液中，于20～28℃温度下搅拌提取25～35min，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min，使固液分离而获得上清液和沉淀物，然后对沉淀物再重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，即获得第三上清液和第三沉淀物；然后使用HCl溶液调节第三上清液的pH值至谷蛋白对应的等电点，使谷蛋白沉降，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min后收集谷蛋白沉淀，即可获得谷蛋白提取物；第三沉淀物则用于下一阶段的蛋白提取。其中，在步骤S40中，NaOH溶液的摩尔浓度优选为0.02M；搅拌提取的固液比优选为1g：4mL，搅拌提取的温度优选为室温，搅拌提取的时间优选为30min，离心转速优选为3000rpm，离心时间优选为30min；谷蛋白对应的等电点pI为6.32。

同样地，为了便于谷蛋白提取物的存放，在获得谷蛋白沉淀之后、获得谷蛋白提取物之前，优选为对获得的谷蛋白沉淀进行pH值调节和冷冻干燥处理，也即，在步骤S20中，由谷蛋白沉淀获得谷蛋白提取物的过程还包括：谷蛋白沉淀经水洗后，使用HCl溶液调节谷蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将谷蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的谷蛋白沉淀再进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。具体可采用如下实施方式进行；水洗谷蛋白沉淀三次，然后使用HCl溶液将谷蛋白沉淀的pH值调节至7.0，随后将谷蛋白沉淀置于-22～18℃(优选为-20℃)冻存，冻存后的谷蛋白沉淀于-50～-40℃、20～30Pa条件下真空冷冻干燥3.5～4.5d(优选为4d)，即可获得高纯度的谷蛋白提取物。

步骤S50、使用乙醇溶液对第三沉淀物进行第五次搅拌提取后离心，收集滤液，将滤液的pH值调节至醇溶蛋白对应的等电点，使醇溶蛋白沉降，然后再次离心并收集醇溶蛋白沉淀，获得醇溶蛋白提取物。

以乙醇溶液为提取溶剂，对第三沉淀物进行第四阶段的的蛋白提取，即提取其中的醇溶蛋白，具体操作时优选为通过如下方式进行：将第三沉淀物以1g：3～5mL的固液比加入到体积分数为65～75％的乙醇溶液中，于20～28℃温度下搅拌提取3～5h，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min，使固液分离而获得上清液和沉淀物，然后对沉淀物再重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液混合，即获得第五次搅拌提取后的滤液；然后使用HCl溶液调节滤液的pH值至醇溶蛋白对应的等电点，使醇溶蛋白沉降，再于2500～3500rpm转速下离心25～35min后收集醇溶蛋白沉淀，即可获得醇溶蛋白提取物。其中，在步骤S50中，乙醇溶液的体积分数优选为70％；搅拌提取的固液比优选为1g：4mL，搅拌提取的温度优选为室温，搅拌提取的时间优选为4h，离心转速优选为3000rpm，离心时间优选为30min；醇溶蛋白对应的等电点pI为4.98。

同样地，为了便于醇溶蛋白提取物的存放，在获得醇溶蛋白沉淀之后、获得醇溶蛋白提取物之前，优选为对获得的醇溶蛋白沉淀进行pH值调节和冷冻干燥处理，也即，在步骤S20中，由醇溶蛋白沉淀获得醇溶蛋白提取物的过程还包括：步骤S21、醇溶蛋白沉淀经水洗后，使用HCl溶液调节醇溶蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将醇溶蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的醇溶蛋白沉淀再进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。具体可采用如下实施方式进行；水洗醇溶蛋白沉淀三次，然后使用HCl溶液将醇溶蛋白沉淀的pH值调节至7.0，随后将醇溶蛋白沉淀置于-22～18℃(优选为-20℃)冻存，冻存后的醇溶蛋白沉淀于-50～-40℃、20～30Pa条件下真空冷冻干燥3.5～4.5d(优选为4d)，即可获得高纯度的醇溶蛋白提取物。

本发明提供的技术方案中，采用Osborne分级提取与等电点沉淀相结合的方法提取镉污染稻米中的镉结合蛋白，能有效提取镉污染稻米中的清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白这四种主要的蛋白质，蛋白种类更全面，且蛋白纯度更高，提取效率高、操作简单，对蛋白特性和结构影响较小，为后续研究镉污染稻米中镉结合蛋白的分离纯化、鉴定及结合机理研究等提供了基础，有利于镉污染稻米的再利用。

以下结合具体实施例和附图对本发明提供的微生物吸附剂的制备方法作进一步详细说明，应当理解，以下实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

实施例1

(1)脱脂处理：取100g糙米(镉含量为0.7153mg/kg)粉碎后的糙米粉，加入到400mL正己烷中，于25℃温度下搅拌提取4h，并以3000rpm转速离心30min，收集沉淀，将沉淀放置于通风处静置过夜，得到干燥的脱脂糙米粉。

(2)将脱脂糙米粉加入到400mL的去离子水中，于25℃温度下搅拌提取4h，并以3000rpm转速离心30min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第一上清液的第一沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第一上清液的pH值至清蛋白的等电点pI 4.13，使清蛋白沉降，再以3000rpm转速离心30min后收集清蛋白沉淀；然后水洗清蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节清蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将清蛋白沉淀置于-20℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的清蛋白沉淀于-50℃、20Pa条件下进行冷冻干燥4d，即获得清蛋白提取物。

(3)将第一沉淀物加入到400mL质量浓度为5％的NaCl溶液中，于25℃温度下搅拌提取4h，并以3000rpm转速离心30min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第二上清液的第二沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至球蛋白的等电点pI 2.32，使球蛋白沉降，再以3000rpm转速离心30min后收集球蛋白沉淀；然后水洗球蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节球蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将球蛋白沉淀置于-20℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的球蛋白沉淀于-50℃、20Pa条件下进行冷冻干燥4d，即获得球蛋白提取物。

(4)将第二沉淀物加入到400mL的摩尔浓度为0.02M、pH值为11的NaOH溶液中，于25℃温度下搅拌提取30min，并以3000rpm转速离心30min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第三上清液的第三沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至谷蛋白的等电点pI 6.32，使谷蛋白沉降，再以3000rpm转速离心30min后收集谷蛋白沉淀；然后水洗谷蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节谷蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将谷蛋白沉淀置于-20℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的谷蛋白沉淀于-50℃、20Pa条件下进行冷冻干燥4d，即获得谷蛋白提取物。

(5)将第三沉淀物加入到400mL的体积分数为70％的乙醇溶液中，于25℃温度下搅拌提取4h，并以3000rpm转速离心30min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液混合，获得滤液；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节滤液的pH值至醇溶蛋白的等电点pI 4.98，使醇溶蛋白沉降，再以3000rpm转速离心30min后收集醇溶蛋白沉淀；然后水洗醇溶蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节醇溶蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将醇溶蛋白沉淀置于-20℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的醇溶蛋白沉淀于-50℃、20Pa条件下进行冷冻干燥4d，即获得醇溶蛋白提取物。

实施例2

(1)脱脂处理：取100g糙米(镉含量为0.5237mg/kg)粉碎后的糙米粉，加入到300mL正己烷中，于25℃温度下搅拌提取5h，并以2500rpm转速离心35min，收集沉淀，将沉淀放置于通风处静置过夜，得到干燥的脱脂糙米粉。

(2)将脱脂糙米粉加入到300mL的去离子水中，于20℃温度下搅拌提取5h，并以2500rpm转速离心35min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第一上清液的第一沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第一上清液的pH值至清蛋白的等电点pI 4.13，使清蛋白沉降，再以2500rpm转速离心35min后收集清蛋白沉淀；然后水洗清蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节清蛋白沉淀的pH值至6.8，随后将清蛋白沉淀置于-22℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的清蛋白沉淀于-40℃、30Pa条件下进行冷冻干燥3.5d，即获得清蛋白提取物。

(3)将第一沉淀物加入到300mL质量浓度为4％的NaCl溶液中，于20℃温度下搅拌提取5h，并以2500rpm转速离心35min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第二上清液的第二沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至球蛋白的等电点pI 2.32，使球蛋白沉降，再以2500rpm转速离心35min后收集球蛋白沉淀；然后水洗球蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节球蛋白沉淀的pH值至6.8，随后将球蛋白沉淀置于-22℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的球蛋白沉淀于-40℃、30Pa条件下进行冷冻干燥3.5d，即获得球蛋白提取物。

(4)将第二沉淀物加入到300mL的摩尔浓度为0.01M、pH值为11的NaOH溶液中，于20℃温度下搅拌提取25min，并以2500rpm转速离心35min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第三上清液的第三沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至谷蛋白的等电点pI 6.32，使谷蛋白沉降，再以2500rpm转速离心35min后收集谷蛋白沉淀；然后水洗谷蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节谷蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将谷蛋白沉淀置于-22℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的谷蛋白沉淀于-40℃、30Pa条件下进行冷冻干燥3.5d，即获得谷蛋白提取物。

(5)将第三沉淀物加入到300mL的体积分数为75％的乙醇溶液中，于20℃温度下搅拌提取5h，并以2500rpm转速离心35min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液混合，获得滤液；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节滤液的pH值至醇溶蛋白的等电点pI 4.98，使醇溶蛋白沉降，再以2500rpm转速离心35min后收集醇溶蛋白沉淀；然后水洗醇溶蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节醇溶蛋白沉淀的pH值至6.8，随后将醇溶蛋白沉淀置于-22℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的醇溶蛋白沉淀于-40℃、30Pa条件下进行冷冻干燥3.5d，即获得醇溶蛋白提取物。

实施例3

(1)脱脂处理：取100g糙米(镉含量为0.9486mg/kg)粉碎后的糙米粉，加入到500mL正己烷中，于28℃温度下搅拌提取3h，并以3500rpm转速离心25min，收集沉淀，将沉淀放置于通风处静置过夜，得到干燥的脱脂糙米粉。

(2)将脱脂糙米粉加入到500mL的去离子水中，于28℃温度下搅拌提取3h，并以3500rpm转速离心25min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第一上清液的第一沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第一上清液的pH值至清蛋白的等电点pI 4.13，使清蛋白沉降，再以3500rpm转速离心25min后收集清蛋白沉淀；然后水洗清蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节清蛋白沉淀的pH值至7.2，随后将清蛋白沉淀置于-18℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的清蛋白沉淀于-45℃、25Pa条件下进行冷冻干燥4.5d，即获得清蛋白提取物。

(3)将第一沉淀物加入到500mL质量浓度为6％的NaCl溶液中，于28℃温度下搅拌提取3h，并以3500rpm转速离心25min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第二上清液的第二沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至球蛋白的等电点pI 2.32，使球蛋白沉降，再以3500rpm转速离心25min后收集球蛋白沉淀；然后水洗球蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节球蛋白沉淀的pH值至7.2，随后将球蛋白沉淀置于-18℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的球蛋白沉淀于-45℃、25Pa条件下进行冷冻干燥4.5d，即获得球蛋白提取物。

(4)将第二沉淀物加入到500mL的摩尔浓度为0.03M、pH值为11的NaOH溶液中，于28℃温度下搅拌提取35min，并以3500rpm转速离心25min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液和沉淀物分别混合，获得第三上清液的第三沉淀物；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节第二上清液的pH值至谷蛋白的等电点pI 6.32，使谷蛋白沉降，再以3500rpm转速离心25min后收集谷蛋白沉淀；然后水洗谷蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节谷蛋白沉淀的pH值至7.0，随后将谷蛋白沉淀置于-18℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的谷蛋白沉淀于-45℃、25Pa条件下进行冷冻干燥4.5d，即获得谷蛋白提取物。

(5)将第三沉淀物加入到500mL的体积分数为65％的乙醇溶液中，于28℃温度下搅拌提取3h，并以3500rpm转速离心25min，得到上清液和沉淀物，对沉淀物再次重复一次搅拌提取和离心处理，将两次提取的上清液混合，获得滤液；使用浓度为1mol/L的HCl溶液调节滤液的pH值至醇溶蛋白的等电点pI 4.98，使醇溶蛋白沉降，再以3500rpm转速离心25min后收集醇溶蛋白沉淀；然后水洗醇溶蛋白沉淀三次，再用浓度为1mol/L的HCl溶液调节醇溶蛋白沉淀的pH值至7.2，随后将醇溶蛋白沉淀置于-18℃温度下冷冻保存，最后对冻存后的醇溶蛋白沉淀于-45℃、25Pa条件下进行冷冻干燥4.5d，即获得醇溶蛋白提取物。

以实施例1为例，测定提取的清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白的蛋白提取物中镉结合蛋白的等电点、蛋白含量及镉含量，测定方法和结果如下：

1)蛋白等电点测定

测定方法：利用HCl溶液调节蛋白提取物的pH值，使其pH值逐渐降低，用Zeta电位仪测定每隔0.5pH间隔时相应的pH值下的Zeta电位值，根据pH值与Zeta电位值的变化绘制变化曲线，取Zeta电位值接近零点时对应pH值附近的15个间距为0.1的点，绘制标准曲线，Zeta电位值为零时所对应的pH值即为蛋白的等电点。

测定结果：所提取的清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白的蛋白等电点测定结果依次如图2至图5所示，图2至图5中，图(a)为测定的不同pH值时对应的Zeta电位值，图(b)为绘制的标准曲线。由图2至图5的测定结果可知，四种镉结合蛋白的Zeta电位值均与溶液放入pH值之间存在一定的相关性，在pH值分别为4.13、2.32.6.32和4.98时，清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白的Zeta电位值均为0，说明此处的pH值即为蛋白对应的等电点pI。

2)蛋白含量及镉含量

测定方法：蛋白含量的测定采用半微量凯氏定氮法(GB 5009.5-2010)；镉含量的测定参考硕士论文《大米镉含量分析及镉结合蛋白的分离纯化》(武汉轻工大学，2014.)中提供的方法进行测定，具体方法如下：称取试样各1.000g于锥形瓶中，放入数粒沸石，加入硝酸10mL、过氧化氢(30％)2mL、硫酸3滴，加盖玻璃平皿，隔夜浸泡，于电炉上消解，直至消化液呈无色透明或略带黄色，待消化液冷却，用玻璃棒将其移入25mL的容量瓶中，用蒸馏水将锥形瓶中残留液体吸入容量瓶，定容至刻度，混匀备用；同时作试剂空白；各份样品重复测定6次，各份算出的相对标准偏差再平均。

测定结果：所提取的清蛋白、球蛋白、谷蛋白及醇溶蛋白的蛋白提取物中的蛋白含量及镉含量的测定结果如下表1所示。

表1蛋白提取物的蛋白含量及镉含量(n＝3，Mean±SD)

由表1中的测定结果可知，按照本发明实施例提供的方法提取得到的镉结合蛋白的蛋白纯度较高，适合用于研究稻米镉结合蛋白的分离纯化及结构鉴定等，且操作简单。

综上所述，本发明提供的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，采用Osborne分级提取与等电点沉淀相结合的方法提取镉污染稻米中的镉结合蛋白，能有效提取镉污染稻米中的清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白这四种主要的蛋白质，蛋白种类更全面，且蛋白纯度更高，提取效率高、操作简单，对蛋白特性和结构影响较小，为后续研究镉污染稻米中镉结合蛋白的分离纯化、鉴定及结合机理研究等提供了基础，有利于镉污染稻米的再利用。

以上仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之类，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (8)

1.一种稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，包括以下步骤：

将镉污染稻米粉碎成稻米粉，然后将稻米粉加入到正己烷中，进行第一次搅拌提取后离心、干燥，得到脱脂稻米粉；

使用去离子水对脱脂稻米粉进行第二次搅拌提取后离心，获得第一上清液和第一沉淀物，将第一上清液的pH值调节至清蛋白对应的等电点，使清蛋白沉降，然后再次离心并收集清蛋白沉淀，获得清蛋白提取物；

使用NaCl溶液对第一沉淀物进行第三次搅拌提取后离心，获得第二上清液和第二沉淀物，将第二上清液的pH值调节至球蛋白对应的等电点，使球蛋白沉降，然后再次离心并收集球蛋白沉淀，获得球蛋白提取物；

使用NaOH溶液对第二沉淀物进行第四次搅拌提取后离心，获得第三上清液和第三沉淀物，将第三上清液的pH值调节至谷蛋白对应的等电点，使谷蛋白沉降，然后再次离心并收集谷蛋白沉淀，获得谷蛋白提取物；

使用乙醇溶液对第三沉淀物进行第五次搅拌提取后离心，收集滤液，将滤液的pH值调节至醇溶蛋白对应的等电点，使醇溶蛋白沉降，然后再次离心并收集醇溶蛋白沉淀，获得醇溶蛋白提取物。

2.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，所述镉污染稻米中的镉含量为0.5～1.0mg/kg。

3.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，所述NaCl溶液的质量浓度为4～6％；

所述NaOH溶液的摩尔浓度为0.01～0.03M，所述NaOH溶液的pH值为11；

所述乙醇溶液的体积分数为65～75％。

4.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，所述第一次搅拌提取至第五次搅拌提取的固液比均为1g：3～5mL，提取温度为20～28℃；

所述第一次搅拌提取至第三次搅拌提取、以及第五次搅拌提取的提取时间为3～5h，所述第四次搅拌提取的提取时间为0.3～0.7h。

5.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，将第一上清液、第二上清液、第三上清液及滤液的pH值对应调节至清蛋白、球蛋白、谷蛋白、醇溶蛋白对应的等电点的步骤，均采用HCl溶液调节溶液的pH值。

6.如权利要求5所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，所述清蛋白、球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白对应的等电点pI分别为4.13、2.32、6.32和4.98。

7.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，所有所述离心的条件均为：离心转速2500～3500rpm，离心时间25～35min。

8.如权利要求1所述的稻米中镉结合蛋白的提取分离方法，其特征在于，对应收集清蛋白沉淀、球蛋白沉淀、谷蛋白沉淀和醇溶蛋白沉淀的步骤之后，对应获得清蛋白提取物、球蛋白提取物、谷蛋白提取物和醇溶蛋白提取物的步骤之前，还包括：

蛋白沉淀经水洗后，使用HCl溶液调节蛋白沉淀的pH值至7.0，然后将蛋白沉淀置于-22～18℃冻存，冻存后的蛋白沉淀再于-50～-40℃、20～30Pa条件下进行真空冷冻干燥3.5～4.5d。