CN105076667B - 一种高纯度大米谷蛋白的提取方法 - Google Patents

Abstract

一种高纯度大米谷蛋白的提取方法，涉及一种大米谷蛋白的提取方法。本发明是要解决现有用稀碱提取谷蛋白的方法导致蛋白质的变性和水解，美拉德反应加剧，产生黑褐色物质的问题。方法：一、将大米研磨成米粉；二、将米粉用正己烷脱脂，得到脱脂米粉；三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；四、对步骤三得到的沉淀用乳酸浸提谷蛋白；五、合并每次浸提收集的上清液，用TCA溶液将上清液进行蛋白沉淀；六、用PBS缓冲液清洗沉淀，将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，即得到大米谷蛋白。本发明方法所提取的谷蛋白纯度可高达93.67％～96.71％，可广泛应用于工业化大批量提取大米谷蛋白。

Description

一种高纯度大米谷蛋白的提取方法

技术领域

本发明涉及一种大米谷蛋白的提取方法。

背景技术

大米蛋白主要由清蛋白、球蛋白、醇溶性蛋白和谷蛋白四种蛋白组成。其中的谷蛋白主要存在于二型蛋白体(PB-Ⅱ)，谷蛋白分子基本上由22KDa、37～39KDa、57KDa三个亚基组成。

研究表明，富含谷蛋白的大米蛋白具有降低胆固醇的良好功效，因此，大米谷蛋白的有效提取，将为我国大力开发功能性大米蛋白的应用提供理论依据，具有广泛、深远的应用意义。

传统的方法大多是用稀碱提取谷蛋白，但碱法提取对氨基酸有破坏作用，同时存在抽出物中淀粉含量高，抽提液固比大，等电点沉淀要消耗大量酸，脱盐纯化难度大，提取液中的蛋白质浓度低等缺点，且提取时需要消耗大量的碱和水，因而难以应用于工业生产。尽管碱法提取蛋白的抽提率可达到90％以上，但是高碱条件下会导致蛋白质的变性和水解；美拉德反应加剧，产生黑褐色物质；提取物中非蛋白物质含量增加，分离效果降低等许多不良反应。此外，碱法提取还会引起蛋白一些性质变化，破坏氨基酸的结构，降低蛋白的营养价值，甚至形成有毒物质如Lysinoalnine等，损坏肾脏的功能。

有学者研究了小麦谷蛋白亚基的快速分离方法，他们利用70％的乙醇和50％的异丙醇去除了醇溶蛋白，然后在含50％异丙醇的Tris-HCl缓冲液中抽提谷蛋白，最后利用丙酮将谷蛋白沉淀析出。之后进行了SDS-PAGE分析，虽然醇溶蛋白的干扰减少了很多，但是清、球蛋白的杂带还能显示出，因此该方法并不是一种有效的提取谷蛋白的方法。由此，研究和改善大米谷蛋白分离提取和纯化工艺，对于开发利用大米蛋白质，促进我国大米深加工，提高粮食产品附加值都具有深远意义。

发明内容

本发明是要解决现有用稀碱提取谷蛋白的方法导致蛋白质的变性和水解，美拉德反应加剧，产生黑褐色物质的问题，提供一种高纯度大米谷蛋白的提取方法。

本发明高纯度大米谷蛋白的提取方法，按以下步骤进行：

一、将大米研磨成米粉；

二、将米粉用正己烷脱脂3～5次，得到脱脂米粉；

三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；

四、对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白3～5次；

五、合并每次浸提收集的上清液，用浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液将上清液进行蛋白沉淀；

六、用PBS缓冲液清洗沉淀3～5次，将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，即得到大米谷蛋白。

步骤二中将米粉用正己烷脱脂3次的具体方法为：

A、将米粉与正己烷按照1g:4～6mL的比例混合，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；

B、向步骤A得到的沉淀中加入正己烷，混匀，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；其中步骤B中正己烷的体积与步骤A中正己烷的体积相同；

C、向步骤B得到的沉淀加入正己烷，混匀，室温搅拌器搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；其中步骤C中正己烷的体积与步骤B中正己烷的体积相同；

D、将步骤C得到的沉淀于30℃水浴中晾干，得到脱脂米粉。

步骤四中对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白3次的具体方法为：

①向步骤三收集的沉淀中加入浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸，沉淀与乳酸的比例关系是1g:10～12mL，混匀，25℃ 130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

向步骤①收集的沉淀中加入与步骤①中相同体积的浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

向步骤②收集的沉淀中加入与步骤①中相同体积的浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸，混匀，25℃130rpm水浴振荡4h，离心后收集沉淀和上清；其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min。

本发明的有益效果：

本发明是利用了谷蛋白的溶解特性而建立的方法。谷蛋白除了可以溶解于稀碱溶液，还可以溶解于稀酸溶液中。因此，本发明主要采用乳酸能打破谷蛋白内的强键，不破坏氨基酸，同时还起到溶解谷蛋白的作用，并且采用TCA将乳酸溶解蛋白沉淀。这种方法可以有效避免美拉德反应，减少损失，同时还省去了传统稀碱提取时需要调pH的步骤。提取出的谷蛋白通过SDS-PAGE分析，无醇溶蛋白、清蛋白、球蛋白的干扰，没有蛋白杂带，是一种简单、精确、经济、快速、高纯、高效的大米谷蛋白提取方法，本发明方法所提取的谷蛋白纯度可高达93.67％～96.16％，能够充分得到高纯度大米谷蛋白。可广泛应用于工业化大批量提取大米谷蛋白。

附图说明

图1为实施例1中3次提取的谷蛋白电泳图；图2为实施例1经三步提取大米谷蛋白的提取率；图3为碱法提取的谷蛋白电泳图。

具体实施方式

本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。

具体实施方式一：本实施方式高纯度大米谷蛋白的提取方法，按以下步骤进行：

一、将大米研磨成米粉；

二、将米粉用正己烷脱脂3～5次，得到脱脂米粉；

三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；

四、对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白3～5次；

五、合并每次浸提收集的上清液，用浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液将上清液进行蛋白沉淀；

六、用PBS缓冲液清洗沉淀3～5次，将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，即得到大米谷蛋白。

具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中将大米研磨成米粉的具体方法为：用粉碎机粉碎新鲜大米，每次15-20s，总共30-40次。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式三：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤二中将米粉用正己烷脱脂的具体方法为：

A、将米粉与正己烷按照1g:4～6mL的比例混合，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；

B、重复步骤A2～4次，将收集的沉淀于30℃水浴中晾干，得到脱脂米粉。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式四：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤三中将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的具体方法为：

A、将脱脂米粉与去离子水按照1g:10～12mL的比例混合，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

B、将步骤A的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

C、将步骤B的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡4h，离心后收集沉淀，即为去除了清蛋白的沉淀；

D、然后将去离子水换为浓度为5％(w/v)的NaCl溶液，每次加的5％(w/v)NaCl溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；

E、然后将去离子水换为58％(v/v)的正丙醇溶液，每次加的58％的正丙醇溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式五：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤四中对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白的具体方法为：

①向步骤三收集的沉淀中加入质量浓度为1％的乳酸溶液，沉淀与乳酸的比例关系是1g:10～12mL，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

重复步骤①2～4次，每次离心后均收集沉淀和上清，其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式六：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤五中用TCA溶液将浸提得到的上清液进行蛋白沉淀的具体方法为：

将步骤四中收集得到的上清液加入浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液，上清液与TCA溶液的体积比为1:3～5，避光条件下于0～4℃冰浴15～20min；然后离心弃掉上清液，取沉淀，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式七：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤六中用PBS缓冲液清洗沉淀的具体方法为：

将步骤五中每次收集的沉淀与PBS缓冲液混合，于25℃130rpm振荡0.5h，离心后收集沉淀，所述PBS缓冲液为0.05M且pH6.5的磷酸盐缓冲液，每次使用的量与每次使用1％乳酸的量相等，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min。其它与具体实施方式一相同。

具体实施方式八：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤六中真空冷冻冻干的条件为：真空度≤15Pa，冷阱温度为50℃～60℃，样品温度为-30℃～-20℃，冻干时间为20h～24h。其它与具体实施方式一相同。

为验证本发明的效果，进行以下试验：

实施例1：

本实施例高纯度大米谷蛋白的提取方法，按以下步骤进行：

一、将大米研磨成米粉：用粉碎机粉碎新鲜大米，每次20s，总共30次；

二、将米粉用正己烷脱脂3次，得到脱脂米粉，具体方法为：

A、将米粉与正己烷按照1g:5mL的比例混合，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；

B、向步骤A得到的沉淀中加入正己烷，混匀，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；其中步骤B中正己烷的体积与步骤A中正己烷的体积相同；

C、向步骤B得到的沉淀加入正己烷，混匀，室温搅拌器搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；其中步骤C中正己烷的体积与步骤B中正己烷的体积相同；

D、将步骤C得到的沉淀于30℃水浴中晾干，得到脱脂米粉。

三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；

A、将脱脂米粉与去离子水按照1g:11mL的比例混合，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

B、将步骤A的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

C、将步骤B的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡4h，离心后收集沉淀，即为去除了清蛋白的沉淀；

D、然后将去离子水换为浓度为5％(w/v)的NaCl溶液，每次加的5％NaCl溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；

E、然后将去离子水换为浓度58％(v/v)的正丙醇溶液，每次加的58％的正丙醇溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述离心的条件均为：4℃，10000g，20min。

四、对步骤三得到的沉淀用浓度为1％(w/v)乳酸浸提谷蛋白3次；

①向步骤三收集的沉淀中加入浓度为1％(w/v)的乳酸溶液，沉淀与乳酸的比例关系是1g:11mL，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

②将步骤①的沉淀加入与步骤①中相同体积的1％乳酸，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

将步骤②的沉淀加入与步骤①中相同体积的1％乳酸，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；其中离心条件均为：4℃，10000g，20min。

五、用质量浓度为10％的TCA溶液将每次浸提得到的上清进行蛋白沉淀；

将步骤四中每次(共3次)收集到的上清液分别与10％TCA溶液按照体积比3:10的比例混合均匀，4℃避光冰浴20min，离心，取沉淀，所述离心条件为：4℃，10000g，20min。

六、用PBS缓冲液清洗沉淀3次，具体为：

将步骤五中每次收集的沉淀与PBS溶液混合，25℃130rpm振荡0.5h，离心后收集沉淀；重复此步骤3次，所述离心条件为：4℃，10000g，20min。将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，条件为：真空度为10Pa、冷阱温度为55℃、样品温度-25℃、冻干时间为24h，即得到大米谷蛋白。

试剂与器材：

本实施例所用的大米为龙粳水稻(Oryza sativa L.cv.Longjing)，由黑龙江农科院佳木斯水稻研究所提供。

步骤六中真空冷冻干燥用真空冷冻干燥机进行，所述的真空冷冻干燥机为北京松源华兴科技发展有限公司的LGJ-12冷冻干燥机。

质量浓度1％的乳酸的配置方法：称取10g乳酸和0.37224g EDTA-2Na，用去离子水溶解并定容到1L。

本实施例制备的大米谷蛋白通过SDS-PAGE进行蛋白组分分析。将本实施例提取的大米谷蛋白用蛋白全提液(0.125M Tris～HCl pH6.8，4％SDS，4M尿素，5％2-巯基乙醇)处理制备谷蛋白提取液；取适量的谷蛋白提取液与2×loading Buffer等体积混合，然后100℃沸水浴中4min，此为上样液；之后上样液上样量10μL并进行SDS～PAGE(选取的是15％分离胶，5％浓缩胶)；电泳结束后用考马斯亮蓝R-250染色液摇床染色30min，最后采用ddH₂O煮法脱色。

此外，利用现有的碱法提取全蛋白和谷蛋白，并通过SDS-PAGE进行蛋白组分分析。

3次提取的谷蛋白电泳图如图1所示，图1中泳道1为蛋白非预染Marker，泳道2为碱法提取的大米全蛋白，泳道3为第一次提取得到的谷蛋白，泳道4为第二次提取得到的谷蛋白，泳道5为第三次提取得到的谷蛋白。第一次提取得到的谷蛋白有明显的22-23KDa，37-39KDa，57KDa处3条目的条带，其中，22-23KDa，37-39KDa两条带较厚重，表明提取22-23KDa，37-39KDa谷蛋白量较多；第二、第三次提取的谷蛋白也能看到3条目的条带，但蛋白条带逐渐变浅，表明随提取次数的增加，谷蛋白提取量逐渐降低。特别是，由图1可见，三次提取的谷蛋白基本无其他蛋白杂带，说明本发明经乳酸提取的谷蛋白工高效、高纯。图2为本实施例经三步提取大米谷蛋白的提取率。实验结果表明，本发明所提取的大米谷蛋白纯度高达96.71％。

图3为碱法提取的谷蛋白电泳图，此电泳图片为采用0.2％NaOH溶液提取所得到的谷蛋白，且未用PBS清洗。由图3可见，谷蛋白并未得到充分分离、提取，其条带与大米全蛋白带相似，含有较多杂带。

Claims (2)

1.一种高纯度大米谷蛋白的提取方法，其特征在于该方法按以下步骤进行：

一、将大米研磨成米粉；

二、将米粉用正己烷脱脂3～5次，得到脱脂米粉；

三、将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白，得到沉淀；

四、对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白3～5次；

五、合并每次浸提收集的上清液，用浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液将上清液进行蛋白沉淀；

六、用PBS缓冲液清洗沉淀3～5次，将清洗后的沉淀真空冷冻干燥，即得到大米谷蛋白；

步骤一中将大米研磨成米粉的具体方法为：用粉碎机粉碎新鲜大米，每次15-20s，总共30-40次；

步骤二中将米粉用正己烷脱脂的具体方法为：

A、将米粉与正己烷按照1g:4～6mL的比例混合，室温搅拌1h，静置1h，然后于4000rpm离心20min后收集沉淀；

B、重复步骤A2～4次，将收集的沉淀于30℃水浴中晾干，得到脱脂米粉；

步骤三中将脱脂米粉去除清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的具体方法为：

A、将脱脂米粉与去离子水按照1g:10～12mL的比例混合，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

B、将步骤A的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀；

C、将步骤B的沉淀加入与步骤A中相同体积的去离子水，混匀，25℃130rpm水浴振荡4h，离心后收集沉淀，即为去除了清蛋白的沉淀；

D、然后将去离子水换为浓度为5％(w/v)的NaCl溶液，每次加的5％NaCl溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白和球蛋白的沉淀；

E、然后将去离子水换为58％(v/v)的正丙醇溶液，每次加的58％的正丙醇溶液体积与步骤A中去离子水体积相同，重复进行步骤A～C，收集沉淀，即为去除了清蛋白、球蛋白和醇溶蛋白的沉淀；其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min；

步骤四中对步骤三得到的沉淀用浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸浸提谷蛋白的具体方法为：

①向步骤三收集的沉淀中加入浓度为0.8％～1.2％(w/v)的乳酸溶液，沉淀与乳酸的比例关系是1g:10～12mL，混匀，25℃130rpm水浴振荡8h，离心后收集沉淀和上清；

②重复步骤①2～4次，每次离心后均收集沉淀和上清，其中所述离心的条件均为：1～6℃，10000g，20min；

步骤五中用TCA溶液将每次浸提得到的上清进行蛋白沉淀的具体方法为：

将步骤四中每次收集得到的上清液加入浓度为8％～12％(w/v)的TCA溶液，上清液与TCA溶液的体积比为1:3～5，避光条件下于0～4℃冰浴15～20min；然后离心弃掉上清液，取沉淀，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min；

步骤六中真空冷冻干燥的条件为：真空度≤15Pa，冷阱温度为50℃～60℃，样品温度为-30℃～-20℃，冻干时间为20h～24h。

2.根据权利要求1所述的一种高纯度大米谷蛋白的提取方法，其特征在于步骤六中用PBS缓冲液清洗沉淀的具体方法为：

将步骤五中每次收集的沉淀与PBS缓冲液混合，于25℃130rpm振荡0.5h，离心后收集沉淀，所述PBS缓冲液为0.05M且pH6.5的磷酸盐缓冲液，每次使用的量与每次使用1％乳酸的量相等，其中所述离心的条件为：1～6℃，10000g，20min。