CN113412874A - 一种汉麻种子贮存蛋白的提取方法 - Google Patents
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Abstract
一种汉麻种子贮存蛋白的提取方法，本发明涉及蛋白的提取方法。本发明解决了现有汉麻种子贮存蛋白提取方法效果较差的问题。汉麻种子贮存蛋白的提取：一、萃取；二、两次离心上清液合并得到水溶蛋白；三、两次离心上清液合并得到盐溶蛋白。本发明实现了对汉麻种子贮存蛋白的提取，且提取效果好。本发明汉麻种子贮存蛋白的提取是利用溶解度不同先对汉麻种子贮存蛋白进行初步分离，然后分别得到汉麻种子中的水溶蛋白和盐溶蛋白，这两种蛋白具有不同的功效，可以根据实际需要，按照不同比例的配比，得到更科学，更具有营养价值的蛋白混合物。
Description
技术领域
本发明涉及一种贮存蛋白的提取方法。
背景技术
汉麻(工业大麻)很早就被人们作为纤维来源而广泛使用，最早的记录可以追溯到公元前8000多年前，被作为用于陶器的麻绳，在大约2000年前，中国在蔡伦发明造纸工艺之前，大麻也被用来造纸。
除了纤维外，近年来，人们越来越认识到汉麻种子也是一种含有丰富蛋白质和油脂的优质来源，自2015年起，籽用大麻面积及产量呈现逐年递增的趋势，而种植籽用大麻较多的地区之一就是中国，汉麻中含有20-25％的蛋白，汉麻种子贮存蛋白富含人体自身无法合成的8种必需氨基酸，其氨基酸的含量与大豆蛋白相似，汉麻种子贮存蛋白的含硫氨基酸含量显著高于大豆蛋白，而含硫氨基酸的含量被证明与植物的营养性相关，而且汉麻种子贮存蛋白的必需氨基酸与总氨基酸的比值显著高于大豆蛋白，因此相比于大豆蛋白，汉麻种子贮存蛋白具有更好的营养结构。汉麻种子贮存蛋白不含有大豆蛋白内含有的胰蛋白酶抑制剂，因此更易于人体消化吸收；汉麻种子贮存蛋白及其水解产物在用不同的蛋白酶处理后，体内和体外均证明具有抗氧化性，降胆固醇，抗疲劳等生物活性。目前在汉麻种子贮存蛋白中没有检测到大麻相关的过敏原，因此汉麻种子贮存蛋白作为低敏蛋白，具有作为食用植物蛋白的很大潜力。蛋白质是人类健康生长过程中必不可少的一类物质，虽然营养学普遍认为植物蛋白的营养价值略低于动物蛋白，但植物蛋白资源相比于动物蛋白资源更加丰富、廉价、易得，且其水解产物具有降低胆固醇、降低血脂浓度等独特的生理功能，因此引起营养学界的关注。我国作为世界人口大国，人口众多，人均耕地面积少，将大量的粮食用于饲喂动物，转化成动物蛋白得不偿失，且动物蛋白食用过多会导致肥胖、高血压、高血脂、心脑血管病、糖尿病等’文明病’泛滥，这一倾向在我国发达地区也有明显表现，近年国内外开始重视低脂肪，无胆固醇的植物蛋白资源的开发，因此积极开发植物蛋白质资源势在必行。
目前国内外对汉麻种子贮存蛋白的研究主要集中在蛋白改性，食品加工和蛋白食品开发等方面，大部分是工业用提取方法以及酸沉碱提法提取大麻分离蛋白，使用的原料大部分为工厂榨油后脱脂的籽粕，品种多为国外品种及云南品种，对于国内其他产地的汉麻的性质等没有详细的研究报道。然而酸沉碱提提取的分离蛋白会丢失部分白蛋白，提取的效果差。目前还有采用试剂盒提取汉麻蛋种子贮存白的方法，但是其提取效果不是很令人满意，而对于汉麻种子贮存蛋白中不同组分的提取一般是先提取得到汉麻种子蛋白(汉麻总蛋白)进一步用试剂盒进行分离提取，提取效果也不是十分理想。
发明内容
本发明为了解决现有汉麻种子贮存蛋白提取方法效果较差的问题，而提供了一种汉麻种子贮存蛋白的提取方法。
本发明汉麻种子贮存蛋白的提取方法按照以下步骤进行：
一、萃取：将汉麻种子磨成粉末，按照汉麻种子重量份数比为1:4的比例向粉末中加入正己烷，室温萃取3小时得到萃取液，再按照汉麻种子重量份数比为1:6的比例向萃取液中加入正己烷，静置过夜后将正己烷吹干得到脱脂汉麻粉末；
二、按照重量份数比为1:10的比例向脱脂汉麻粉末中加入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心30分钟，得到上清液A和沉淀A，按照重量份数比为1:5向沉淀A中加入入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液B和沉淀B，上清液A和上清液B合并即得到汉麻种子贮存蛋白中的水溶蛋白；
三、向步骤二的沉淀B中按照重量份数比为1:10的比例加入1M NaCl溶液，在30℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心20分钟，得到上清液C和沉淀C，向沉淀C中按照重量份数比为1:5的比例加入1M NaCl溶液，在30℃震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液D，合并上清液C和上清液D，即得到汉麻种子贮存蛋白中的盐溶蛋白。
本申请的方法在提取中没有经过强酸强碱的处理，没有蛋白变性的风险，不存在丢失蛋白的情况，本发明所得到的水溶蛋白和盐溶蛋白经过SDS-PAGE电泳分析，条带明显，本发明的提取效果好。本发明的方法可以在提取的过程中分别得到汉麻仁中的水溶蛋白(白蛋白)和盐溶蛋白(球蛋白)，不需要先提出总蛋白再对混合蛋白进行分离，极大地节省了对蛋白进一步的精细分离和纯化的时间，降低了人工成本。其所得到的水溶蛋白(白蛋白)和盐溶蛋白(球蛋白)具有不同的功效，可以根据实际需要，可以按照不同比例的配比，得到更科学，更具有营养价值的蛋白混合物。
附图说明
图1为实施例1的LC-MS/MS分析结果图；
图2为实施例2的SDS-PAGE电泳图。
具体实施方式
具体实施方式一：本实施方式汉麻种子贮存蛋白的提取方法按照以下步骤进行：
一、萃取：将汉麻种子磨成粉末，按照汉麻种子重量份数比为1:4的比例向粉末中加入正己烷，室温萃取3小时得到萃取液，再按照汉麻种子重量份数比为1:6的比例向萃取液中加入正己烷，静置过夜后将正己烷吹干得到脱脂汉麻粉末；
二、按照重量份数比为1:10的比例向脱脂汉麻粉末中加入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心30分钟，得到上清液A和沉淀A，按照重量份数比为1:5向沉淀A中加入入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液B和沉淀B，上清液A和上清液B合并即得到汉麻种子贮存蛋白中的水溶蛋白；
三、向步骤二的沉淀B中按照重量份数比为1:10的比例加入1M NaCl溶液，在30℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心20分钟，得到上清液C和沉淀C，向沉淀C中按照重量份数比为1:5的比例加入1M NaCl溶液，在30℃震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液D，合并上清液C和上清液D，即得到汉麻种子贮存蛋白中的盐溶蛋白。本实施方式步骤一中吹干的方式是采用通风橱内吹干，使正己烷挥发完全。
具体实施方式二：本实施方式与具体实施方式一不同的是：步骤一中的汉麻种子采用液氮磨成粉末。其他步骤及参数与具体实施方式一相同。
本实施方式将新鲜的汉麻种子用液氮磨成尽可能细的粉末。
实施例1利用本发明的方法提取黑龙江省的汉麻种子中的不同组分的贮存蛋白，具体步骤如下：
一、萃取：将汉麻种子磨成粉末，按照汉麻种子重量份数比为1:4的比例向粉末中加入正己烷，室温萃取3小时得到萃取液，再按照汉麻种子重量份数比为1:6的比例向萃取液中加入正己烷，静置过夜后将正己烷吹干得到脱脂汉麻粉末；
二、按照重量份数比为1:10的比例向脱脂汉麻粉末(汉麻种子采用液氮磨成粉末)中加入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后至于室温，然后在8000g条件下离心30分钟，得到上清液A和沉淀A，按照重量份数比为1:5向沉淀A中加入入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液B和沉淀B，上清液A和上清液B合并即得到汉麻种子贮存蛋白中的水溶蛋白；
三、向步骤二的沉淀B中按照重量份数比为1:10的比例加入1M NaCl溶液，在30℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心20分钟，得到上清液C和沉淀C，向沉淀C中按照重量份数比为1:5的比例加入1M NaCl溶液，在30℃震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液D，合并上清液C和上清液D，即得到汉麻种子贮存蛋白中的盐(NaCI)溶蛋白。
1、SDS-PAGE分析
实施例1得到不同组分蛋白溶液(水溶蛋白和盐溶蛋白)用PBS稀释至合适浓度(1mg/mL)后加入5X蛋白上样缓冲液(含有β-巯基乙醇)，混合后样品于沸水中煮7min后离心上样，进行SDS-PAGE分析。选取12％的分离胶和2％的浓缩胶，于室温100V电压下进行分析。蛋白胶用考马斯亮蓝G250进行染色，脱色液脱色后留存分析。
2、蛋白鉴定分析
将目的蛋白分别切成1mm左右的胶粒，加入脱色液脱色和乙晴脱水至胶粒完全变白，用DTT进行巯基还原，再次脱水后用1ug/μL的Trypsin将胶粒酶解，吸涨，℃孵育过夜。加入5倍体50％的ACN，5000g离心1min取上清再加入5倍体100％ACN，5000g离心1min，最后将所得上清用25000g离心5min，取上清冻干。
肽段分析采用LC-MS/MS进行分析。抽干的样品用流动相A(2％ACN，0.1％FA)复溶，20000g离心10min，取上清上样。用纳升液相色谱仪(LC-20AD岛津公司)进行分析，流动相B(98％ACN，0.1％FA)。液相分离后的肽段通过nanoEsI源离子化后进入到串联质谱仪LTQOrbitrap Velos(Thermo Fisher Scientific,San Jose,CA)进行DDA(data-dependentacquisition)模式检测。Nano离子源电压：2.2kV，一级质谱扫描范围350-1500m/z，30000分辨率；二级质谱m/z为100，分辨率7500。进行二级碎裂的母离子筛选条件为电荷2+，3+，4+以上，峰强度超过1000的强度排在前8的母离子。HCD碰撞能量(NCE)设置为35，碎片离子在Orbitrap中进行检测，动态排除时间设定为15s。
将得到的质谱数据与数据库模拟得到的理论质谱数据进行匹配，得到蛋白鉴定结果。数据库选择：UNIProt蛋白数据库，NCBI中Cannabis sativa蛋白数据库。将原始质谱数据转换为质谱峰文件后与数据库中的序列进行搜索匹配，并对搜索结果做一定的过滤和质控(搜索结果使用Percolator预处理打分，输出结果以FDR<0.01进行过滤)。
蛋白测序结果分析，即将SDS-PAGE结果中的目的条带经过处理后进行LC-MS/MS分析，库采用的为UNIProt蛋白数据库以及NCBI中Cannabis sativa蛋白数据库。
表1显示了每种靶蛋白的鉴定结果。从35KDa样品中鉴定出372种蛋白质和1521个肽；从40～40KDa样品中鉴定出372种蛋白质和1521个肽；从样品20KDa-1中鉴定出265种蛋白质和773个肽；通过搜索引擎识别后，从样品20KDa-2中鉴定出281个蛋白和797个肽，从样品<20KDa中鉴定出126个蛋白和305个肽。
Table 1 Identification results overview
其中LC-MS/MS分析中的40～50Kda、35Kda、20KDa-1、20KDa-2、<20kDa数据鉴定结果如图1所示，根据鉴定到的蛋白的综合打分(Q Score)，唯一肽段数目，覆盖率，分子量大小等值进行筛选，排除掉分子量有明显差异的蛋白，可以得出，sample<20KDa鉴定到的蛋白为2S白蛋白，sample 20KDa-1，sample 20KDa-2以及sample 35KDa鉴定到的蛋白为11S球蛋白(即edestin)，sample 40～50KDa鉴定到的蛋白为7S豌豆蛋白。从鉴定结果来看，可以认为实施例1提出的水蛋白和盐溶蛋白，其中水溶性蛋白为2S白蛋白，分子量小于20kDa；盐溶性蛋白为11S球蛋白以及7S豌豆蛋白类蛋白，11S球蛋白含量最多，其大小两个亚基的分子量在35kDa和20kDa左右，7S豌豆蛋白类蛋白含量最少，其分子量在47kDa左右。经过本发明的方法成功的从汉麻种子中提取得到了的不同组分的贮存蛋白。
实施例2分别采取了酸沉碱提法、实施例1和试剂盒提取方法对汉麻籽贮存蛋白进行提取，比较不同提取方法的提取效果，由于新鲜汉麻含有大量的油脂，所以也同时比较了脱脂与否对提取效果的影响，以及煮沸时间、还原剂含量对结果的影响。
SDS-PAGE电泳图如图2所示，图中A为酸沉碱提法和试剂盒法提取的脱脂/未脱脂汉麻蛋白SDS-PAGE电泳图，时间为蛋白在95゜C煮沸时间，2ME浓度为2.5％；B、酸沉碱提法及实施例1中所提取汉麻蛋白的不同组分中未脱脂汉麻蛋白的SDS-PAGE电泳图，其中所有的蛋白样品均用PBS稀释至合适浓度(1mg/mL)后加入5X蛋白上样缓冲液(含有β-巯基乙醇)，混合后样品于沸水中煮7min后离心上样。
从图2中可以看出，市售植物蛋白提取试剂盒对汉麻种子贮存蛋白的提取效果不是很令人满意，在胶图上只能看到1条大小40～50Kda和2条大小小于20KDa的明显条带；酸沉碱提法在40～50KDa，30～40Kda以及20Kda左右有明显的四条蛋白条带，分别对应了7S豌豆蛋白类蛋白以及11S球蛋白的酸碱亚基(SDS-PAGE会破坏亚单位之间的二硫键)，但是没有观察到2S白蛋白，酸沉碱提法方法丢失了部分蛋白。本发明中水溶蛋白在40～50KDa，20KDa以及14～15KDa能观察到三条明显条带，盐溶蛋白在40～50KDa，30～40KDa以及20KDa附近能观察到三条明显条带，本发明的分离方法能得到所有的目的蛋白，具有最佳的提取效果。从图中还可以看出，脱脂与否、煮沸时间以及还原剂的量对蛋白提取几乎没有影响。
Claims (2)
1.一种汉麻种子贮存蛋白的提取方法，其特征在于汉麻蛋白的提取方法按照以下步骤进行：
一、萃取：将汉麻种子磨成粉末，按照汉麻种子重量份数比为1:4的比例向粉末中加入正己烷，室温萃取3小时得到萃取液，再按照汉麻种子重量份数比为1:6的比例向萃取液中加入正己烷，静置过夜后将正己烷吹干得到脱脂汉麻粉末；
二、按照重量份数比为1:10的比例向脱脂汉麻粉末中加入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心30分钟，得到上清液A和沉淀A，按照重量份数比为1:5向沉淀A中加入入去离子水，在37℃条件下震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液B和沉淀B，上清液A和上清液B合并即得到汉麻种子贮存蛋白中的水溶蛋白；
三、向步骤二的沉淀B中按照重量份数比为1:10的比例加入1M NaCl溶液，在30℃条件下震荡浸提1小时后置于室温，然后在8000g条件下离心20分钟，得到上清液C和沉淀C，向沉淀C中按照重量份数比为1:5的比例加入1M NaCl溶液，在30℃震荡浸提1小时后，在8000g条件下室温离心20分钟，得到上清液D，合并上清液C和上清液D，即得到汉麻种子贮存蛋白中的盐溶蛋白。
2.根据权利要求1所述的一种汉麻种子贮存蛋白不同组分的提取方法，其特征在于步骤一中的汉麻种子采用液氮磨成粉末。
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