CN115028702B

CN115028702B - 醇溶蛋白提取方法及该方法制得的醇溶蛋白

Info

Publication number: CN115028702B
Application number: CN202210811557.8A
Authority: CN
Inventors: 武丽达; 王鹏杰; 李义; 陈翰; 王淑敏; 张娜娜; 佟毅
Original assignee: China Agricultural University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Current assignee: China Agricultural University; Cofco Jilin Bio Chemical Technology Co Ltd; Cofco Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2022-07-11
Filing date: 2022-07-11
Publication date: 2023-10-20
Anticipated expiration: 2042-07-11
Also published as: CN115028702A

Abstract

本发明涉及蛋白产品加工领域，公开了一种醇溶蛋白提取方法及该方法制得的醇溶蛋白。本发明提供的方法采用沸点较高的丙二醇替代传统方法中的乙醇作为提取溶剂，使得生产安全性得以提高。同时，本发明提供的方法进行醇溶蛋白制备时，提取率和产品纯度与传统乙醇提取的水平相当。并且，本发明提供的方法能够以较为简单的操作即实现对提取溶剂的回收和循环利用，极大降低了醇溶蛋白生产成本。

Description

醇溶蛋白提取方法及该方法制得的醇溶蛋白

技术领域

本发明涉及蛋白产品加工领域，具体涉及一种醇溶蛋白提取方法及该方法制得的醇溶蛋白。

背景技术

醇溶蛋白是植物种子储存蛋白的组分之一，根据原料的来源可以分为玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白等。根据其结构与溶解性，可以分为α-醇溶蛋白、β-醇溶蛋白、γ-醇溶蛋白和δ-醇溶蛋白等。醇溶蛋白具有独特的溶解性，其不溶于水，也不溶于无水醇类，但是可以溶解于60-95％的醇类水溶液或酮类水溶液中。由于醇溶蛋白具有很强的耐水性、耐热性和耐脂性，广泛应用于食品和医药及其衍生产业中。

玉米醇溶蛋白具有绝佳的自组装特性，良好的生物相容性和可降解性，因此近年来常用作疏水性或亲水性营养素(例如姜黄素、β-胡萝卜素、功能性多肽等)的载体，以制备相关的口服营养补充剂产品。

传统的玉米醇溶蛋白提取方法多为采用70-80％的乙醇水溶液作为提取溶剂，然后再加入水使得醇溶蛋白沉淀析出。然而，传统方法中用作提取溶剂的乙醇浓度高、挥发性大，而且乙醇本身也具有易燃特性，因此在进行大规模生产时，生产安全性较低。而且，由于提取过程中为了使醇溶蛋白析出而加入了大量的水，使得提取溶剂(乙醇)无法直接回收循环使用，而且回收处理的成本和能耗都较高。因此，由于提取成本的居高不下，使得玉米醇溶蛋白的价格较为昂贵。

虽然，近年来也有研究人员为了提高生产安全性，降低玉米醇溶蛋白的提取成本，尤其是降低回收处理提取溶剂的成本，而采用碱性水溶液的水提方案等替代方法进行玉米醇溶蛋白提取，但是，这种水提方案难以去除多糖等杂质，使得产品的纯度较低，而且与乙醇提取相比，水提法的提取率也很低，无法满足应用需要。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术存在的采用乙醇为提取溶剂提取醇溶蛋白时，生产安全性低，成本高，能耗和水耗高，且溶剂难以回收，而采用水提法时提取率和产品纯度不足等问题，提供一种醇溶蛋白提取方法及该方法制得的醇溶蛋白。本发明提供的方法采用沸点较高的丙二醇替代乙醇作为提取溶剂，使得生产安全性得以提高，并且提取率和产品纯度与乙醇提取水平相当。

为了实现上述目的，本发明一方面提供一种提取醇溶蛋白的方法，所述方法包括：

(1)溶解：将蛋白原料与提取溶剂进行第一混合，而后进行第一固液分离，获得液相I，其中，所述提取溶剂包括丙二醇；

(2)粗提：将所述液相I依次进行酸沉和第二固液分离，获得液相II和固相II，其中，所述液相II回用于步骤(1)；

(3)精提：将所述固相II与水进行第二混合，而后进行第三固液分离。

本发明第二方面提供根据如上所述的方法制备获得的醇溶蛋白。

通过上述技术方案，本发明能够取得如下有益效果：

(1)本发明提供的方法采用沸点更高、挥发性更小的丙二醇替代传统方法中的乙醇作为(玉米)醇溶蛋白提取溶剂，解决了传统方法大规模生产过程中安全性较低，易产生提取溶剂燃烧、爆炸等事故的问题；

(2)本发明提供的方法操作简单，原料易得，十分适合工业化大规模推广应用；

(3)本发明提供的方法收率较高，且获得的(玉米)醇溶蛋白纯度也较高，基本与传统乙醇提取的方法水平相当(例如，本发明提供的方法获得的醇溶蛋白与乙醇提取法获得的醇溶蛋白在75％乙醇溶液中的溶解度均能达到90％左右)；

(4)本发明提供的方法中，通过进一步对pH和温度的控制和调整，能够轻易实现提取溶剂(丙二醇)的回收，并且回收后的提取溶剂可以直接循环使用(约20次)，而且多次循环后，含有较多杂质的回收溶剂经过简单纯化后仍可继续使用(循环使用次数可达到60次以上)，而且提取率和醇溶蛋白纯度均能够保持较高水平，极大降低了传统乙醇提取的方法中提取溶剂的回收循环成本，从而使得整体提取成本得以大幅度降低。

附图说明

图1是本发明测试例2中玉米醇溶蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳图。

图2是本发明提供的提取醇溶蛋白的方法的流程示意图。

具体实施方式

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

本发明中，“第一混合”、“第二混合”；“第一固液分离”、“第二固液分离”、“第三固液分离”、“第四固液分离”中的“第一”、“第二”、“第三”、“第四”等仅用于在描述上方便区分不同步骤中的混合、固液分离等操作。

传统醇提法采用乙醇作为醇溶蛋白提取溶剂，然而，醇溶蛋白虽然在乙醇水溶液溶解度高，但该溶解度受pH和温度的影响较小，无法仅通过调节温度或pH等提取条件的简单操作实现醇溶蛋白的沉淀与分离，必须通过改变溶剂体系的极性(通常选择加入大量水使乙醇浓度降低至35％以下)进行沉淀。在该过程中用水量较大，而且产生的低浓度乙醇较难回收，且往往在回收时能源消耗巨大，不利于产业绿色可持续发展。而且，乙醇作为提取溶剂时，由于生产环境中存在大量乙醇蒸汽，往往造成生产安全性较低的问题。

水提法虽然采用碱性水溶液替代了乙醇，解决了生产过程中由乙醇带来的安全性问题，但是，该方法对原料与酶解的条件要求较高。其原因在于，原料中的谷蛋白、淀粉与纤维素等成分在加热条件下会全部或部分溶于碱性水溶液，因此原料中的淀粉或纤维素含量会极大地影响最终产品的质量，而且对酶解步骤的要求也因此大大提高。同时，由于谷蛋白的存在，最终的醇溶蛋白的品质与纯度也会受到影响，通常水提法获得的醇溶蛋白在75％乙醇水溶液中的溶解度不超过70％。

本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，丙二醇对醇溶蛋白的溶解度较高，但是原料中的淀粉、纤维素和谷蛋白等成分的溶解度很低(基本不溶)，因此对原料和酶解条件的要求较低。采用丙二醇作为醇溶蛋白提取溶剂时，可以仅通过对提取条件(例如pH、温度等)的控制，简单地实现醇溶蛋白的分离以及提取溶剂回收。并且，丙二醇的沸点较高、不易挥发，采用其替代传统醇溶蛋白提取时采用的乙醇作为提取溶剂时，能够提高生产安全性，简化工艺流程，降低能耗和水耗，同时还能确保较高的醇溶蛋白提取率和纯度。

基于发明人的上述发现，本发明一方面提供一种提取醇溶蛋白的方法，所述方法包括：

(2)粗提：将所述液相I依次进行酸沉和第二固液分离，获得液相II和固相II；

本发明提供的方法中，步骤(1)的目的在于分离蛋白原料中的醇溶蛋白和杂质(即原料中的其他成分，如淀粉、其他蛋白、纤维素等)。通过将蛋白原料中的醇溶蛋白溶解于提取溶剂中，而无法溶解的其他蛋白(如谷蛋白等)和杂质则可通过固液分离的方式去除，从而实现上述目的。所述蛋白原料可以为任意本领域现有用于醇溶蛋白提取的蛋白原料(例如含有醇溶蛋白的蛋白粉等)，根据蛋白原料的来源可以分为例如用于提取玉米醇溶蛋白的蛋白原料，用于提取小麦醇溶蛋白的蛋白原料等，或者也可以是不同来源的蛋白原料的混合物。其既可以是通过商购获得的相关产品，也可以是根据现有技术自行制备的相关产品。

根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(1)中，所述蛋白原料选自玉米蛋白粉、小麦蛋白粉和高粱蛋白粉中的至少一种。

为了使蛋白原料中的醇溶蛋白能够充分溶解于提取溶剂中，从而尽可能提高醇溶蛋白提取率，优选地，所述蛋白原料的粒径为10-50μm。优选为20-40μm。

本发明提供的方法中，可以直接选用具有上述粒径的蛋白原料，也可以将(粒径较大的)蛋白原料进行处理(例如破碎、研磨、球磨等)，使其达到上述粒径水平。

本发明提供的方法中，步骤(1)中作为提取溶剂的丙二醇可以为任意浓度的丙二醇水溶液，对于其浓度没有特别限制，只要能够将所述蛋白原料中的醇溶蛋白溶解即可。根据本发明的优选实施方式，其中，所述提取溶剂为浓度60-80体积％的丙二醇水溶液。

优选地，所述提取溶剂为浓度65-75体积％的丙二醇水溶液。

本发明提供的方法中，对于蛋白原料与提取溶剂的用量比没有特别限制，只要能够将蛋白原料中的醇溶蛋白溶出即可。为了尽可能提高醇溶蛋白的提取率，优选地，所述蛋白原料与提取溶剂的体积比为1:5-15。优选为1:8-12。

本发明的发明人在研究的过程中发现，以丙二醇为提取溶剂时，在碱性环境中，对醇溶蛋白(例如玉米醇溶蛋白、小麦醇溶蛋白、高粱醇溶蛋白等)进行热处理，可以打开醇溶蛋白分子间的氢键，从而使得醇溶蛋白在丙二醇中充分溶解，而原料中的其他蛋白和杂质(例如醇不溶的蛋白和杂质等)则可以经固液分离轻易去除，因而能够高效去除蛋白原料中的其他蛋白和杂质。

本发明提供的方法中，对于步骤(1)中第一混合的条件没有特别限制，只要能够将蛋白原料中的醇溶蛋白充分溶出即可。出于高效去除蛋白原料中的其他蛋白和杂质的目的，根据本发明的优选实施方式，其中，所述第一混合的条件包括：pH 11-13，温度40-80℃，时间30-120min，搅拌转速100-300rpm。

优选地，所述第一混合的条件包括：pH为12-13，温度40-80℃，时间50-90min。为了提高第一混合的效率以及醇溶蛋白的提取率，优选所述第一混合在搅拌条件下进行，例如可以在搅拌转速100-300rpm的条件下进行。

本发明提供的方法中，步骤(1)中，第一固液分离的方式可以为任意本领域现有的固液分离方式，例如过滤、离心等。为使蛋白原料中的其他蛋白和杂质(即蛋白原料中不溶于提取溶剂的沉淀部分)能够尽可能的去除，提高获得的醇溶蛋白的纯度，优选地，所述第一固液分离的方式可以包括：温度20-40℃，转速6000-10000rpm离心分离5-20min。

本发明的发明人在研究的过程中发现，在碱性丙二醇溶液中经热处理打开的醇溶蛋白分子间的氢键，在pH值调酸时能够重新缔合，从而使溶于丙二醇中的醇溶蛋白沉淀析出。而在调节pH值的过程中，加入的水较少，因此固液分离后获得的液相中的丙二醇浓度与步骤(1)中用作提取溶剂的丙二醇浓度相比下降较少，(重新调节成碱性后)可以直接作为提取溶剂回用于步骤(1)中。

本发明的发明人在研究的过程中还发现，若在醇溶蛋白提取前，对蛋白原料进行酶解处理(例如采用纤维素酶、淀粉酶、葡萄糖苷酶等处理)，则可以去除包裹在醇溶蛋白外层的部分多糖复合物，从而使得其中的醇溶蛋白与丙二醇的接触增加，进而提高提取率，缩短提取时间。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括在与提取溶剂进行第一混合前，对蛋白原料进行精制的步骤：将蛋白原料与复合酶混合进行酶解，获得酶解产物。

所述复合酶中，可以含有任意能够去除蛋白原料中的醇溶蛋白外层杂质(多糖复合物)的酶。优选地，所述复合酶可以包括纤维素酶、淀粉酶(例如α-淀粉酶等)和葡萄糖苷酶中的至少一种。本发明中采用的复合酶可以是通过商购(或从供应商处定制)获得的相关产品，也可以是根据现有技术自行制备(或配制)的相关产品。

本发明提供的方法中，所述复合酶中的各种酶的用量比没有特别限制，可以根据实际情况进行调整。出于提高醇溶蛋白提取率和产品纯度的考虑，优选地，所述复合酶中，纤维素酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶的重量比为1:1-5:1-5。

本发明提供的方法中，所述酶解的条件没有特别限制，可以根据实际情况进行调整。为了提高酶解效率和效果，优选地，所述酶解的条件可以包括：pH4-6，温度30-60℃，时间30-90min。优选所述酶解在搅拌条件下进行，例如可以在搅拌转速100-300rpm的条件下进行。

本发明提供的方法中，对于复合酶的用量没有特别限制，只要能够去除蛋白原料中的醇溶蛋白外层杂质(多糖复合物)即可。为了提高醇溶蛋白提取率和产品纯度，优选地，以所述蛋白原料的重量为基准，所述复合酶的(总)用量为0.1-2重量％。

更优选地，以所述蛋白原料的重量为基准，所述纤维素酶的用量为0.1-0.5重量％。

更优选地，以所述蛋白原料的重量为基准，所述淀粉酶的用量为0.3-0.8重量％。

更优选地，以所述蛋白原料的重量为基准，所述葡萄糖苷酶的用量为0.3-0.8重量％。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述精制还包括将所述酶解产物依次进行酶失活和第四固液分离的操作。通过第四固液分离获得的固相IV，即为精制的蛋白原料，用于与提取溶剂进行第一混合。

优选地，所述酶失活的条件包括：pH 5-7，温度70-100℃，时间10-30min。为了提高酶失活的效率，优选在搅拌条件下进行所述酶失活，例如可以在搅拌转速100-300rpm的条件下进行酶失活。

更优选地，所述酶失活的pH值比酶解(精制)的pH值高0.5-1.5。

本发明提供的方法中，第四固液分离的方式可以为任意本领域现有的固液分离方式，例如过滤、离心等。为了提高对蛋白原料的精制效果，优选地，所述第四固液分离的方式包括：温度20-30℃，转速3000-5000rpm离心分离1-10min。

本发明提供的方法中，步骤(2)的目的在于将溶于提取溶剂中的醇溶蛋白和提取溶剂高效分离，在获得醇溶蛋白粗提品(即固相II)的同时，实现提取溶剂(即液相II)的回收。由于醇溶蛋白在碱性条件下易溶于丙二醇，因此，采用酸沉(也即，将液相I的pH值调低)的方式实现以上目的。应当能够理解的是，所述“酸沉”指的是使得液相I的pH值在调整后相比步骤(1)中溶解的pH值更低，也即，酸沉的pH值只要比溶解的pH值更偏向“酸性”(即pH值更低)即可，并非必须使得调整后的溶液呈现酸性(即pH值低于7)。所述酸沉的具体方式可以为采用酸的水溶液(例如本领域常用于调节溶液酸碱度的无机酸水溶液，如盐酸水溶液等)与步骤(1)获得的液相I混合，使其中的醇溶蛋白析出。

本发明提供的方法中，步骤(2)中的酸沉操作中，只要将液相I的pH值调至能够使其中的醇溶蛋白析出即可，对于具体的条件没有特别限制。为了提高酸沉的效率和效果，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(2)中，所述酸沉的条件包括(将液相I调节至)pH 5-7，更优选为pH 5-6。一般使用HCl将pH调节至酸沉的pH。

本发明的发明人在研究的过程中巧妙地发现，若在酸沉的过程中进行冷却处理(例如将酸沉体系在低温中静置一段时间)，则可以进一步提高醇溶蛋白和丙二醇的分离效果。提高醇溶蛋白收率的同时，能够更利于提取溶剂的回收。因此，优选地，所述酸沉的方式为在0-20℃的温度下静置1-10h。

更优选地，所述酸沉的温度为0-10℃。优选为0-5℃。

本发明提供的方法中，步骤(2)中，第二固液分离的方式可以为任意本领域现有的固液分离方式，例如过滤、离心等。出于提高醇溶蛋白和丙二醇的分离效果的考虑，根据本发明的优选实施方式，其中，所述第二固液分离的方式可以包括：温度0-20℃，转速6000-10000rpm离心分离15-30min。

本发明中，所述液相II可以直接回收，作为(回收的)提取溶剂回用于步骤(1)。其可以直接回用，也可以纯化后再回用。根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还包括将步骤(2)获得的液相II进行纯化的步骤。

优选地，所述回收的提取溶剂中，丙二醇的含量为50-75重量％，优选为60-75重量％。液相II中的丙二醇含量在上述范围内时，可以直接回用于步骤(1)，也可以纯化后再回用。若液相II中的丙二醇含量低于上述范围，则必须进行纯化再回用于步骤(1)。

任意本领域现有的对提取溶剂进行回收纯化的方式均可适用于本发明提供的方法，优选地，所述纯化的方式包括：氧化钙脱水和/或热风干燥。本发明对于纯化的具体条件没有特别限制，只要能够使得液相II中的水含量达到能够回用于步骤(1)中用作提取溶剂的水平即可。

本发明提供的方法中，步骤(3)的目的在于将醇溶蛋白粗提品(即固相II)中的醇溶蛋白进行进一步提纯，从而提高获得的醇溶蛋白产品的纯度。本发明的发明人在研究的过程中发现，通过水洗处理，可以除去醇溶蛋白粗提品中残留的丙二醇和水溶性杂质等，获得精提的醇溶蛋白。而在此过程中，将水洗体系的pH进一步调低，可以进一步提高精提效果。

本发明提供的方法中，对于步骤(3)中固相II与水的用量没有特别限制，只要能够进一步提纯醇溶蛋白粗提品即可。根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中，所述固相II与水的体积比为1:5-15。优选为1:8-12。

本发明提供的方法中，步骤(3)中，对于第二混合的条件没有特别限制，只要能够将醇溶蛋白粗提品(即固相II)中的水溶性杂质充分溶出即可。为了提高精提效果，优选地，所述第二混合的条件可以包括：pH 1-3，温度40-80℃，时间30-120min。为了进一步提高精提效果，所述第二混合可以在搅拌条件下进行，例如可以在搅拌转速100-300rpm的条件下进行。

优选地，所述第二混合的条件包括：pH 1.5-2.5，温度50-80℃，时间50-70min，搅拌转速100-200rpm。

为了获得纯度更高的醇溶蛋白产品，根据本发明的优选实施方式，其中，步骤(3)中第二混合的pH比步骤(2)中酸沉的pH低3-4。

本发明提供的方法中，步骤(3)中，第三固液分离的方式可以为任意本领域现有的固液分离方式，例如过滤、离心等。为了提高醇溶蛋白和(溶解了残留的丙二醇和杂质的)水的分离效果，优选地，所述第三固液分离的方式可以包括：温度20-30℃，转速3000-5000rpm离心分离5-15min。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述方法还进一步地包括对步骤(3)中第三固液分离获得的固相III进行干燥，以获得醇溶蛋白(产品)的步骤。

任意本领域现有的对蛋白质进行干燥的方式均可适用于本发明。优选地，所述干燥的方式包括冷冻干燥、热风干燥和流化床干燥中的至少一种。

为了获得纯度和品质更高的醇溶蛋白，更优选地，所述干燥的条件包括：温度-50至80℃，时间30-40h。

本发明第二方面提供根据如前所述的方法制备获得的醇溶蛋白。

根据本发明的优选实施方式，其中，所述醇溶蛋白的纯度为75-95％。

优选地，所述醇溶蛋白的纯度为80-95％。

更优选地，所述醇溶蛋白的纯度为85-95％。例如可以为85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％，或者也可以为任意两个上述数值之间任意的中间值。

以下将通过实施例对本发明进行详细描述。应当能够理解，以下实施例仅用于示例性地进一步详细解释和说明本发明的内容，而不用于限制本发明。

以下实施例中，玉米蛋白粉购自中粮集团有限公司；丙二醇购自天津永大化学试剂有限公司；纤维素酶、α-淀粉酶和葡萄糖苷酶均购自上海源叶生物技术公司，牌号分别为S10041、S10003和S10050；采用的其他化学试剂在未进行特殊说明的情况下，均购自正规化学试剂供应商，纯度为分析纯。

以下实施例中，未做特殊说明的情况下，操作温度均为室温(25±5℃)。

实施例1

以玉米蛋白粉为蛋白原料，采用如下方法，按照表1中的条件进行醇溶蛋白提取：

蛋白原料精制：

将100g玉米蛋白粉与1000mL去离子水充分混合，过胶体磨(JMC-60)，获得平均粒径约为30μm的玉米蛋白粉悬浊液。用2mol/L的NaOH溶液调节pH至5，加入0.2g纤维素酶、0.4gα-淀粉酶和0.4g葡萄糖苷酶。200rpm搅拌的条件下，37℃水浴加热60min。而后用2mol/L的NaOH溶液调节pH至6，200rpm搅拌的条件下，先于50℃水浴90min，而后于90℃水浴加热15min，使酶失活。4000rpm离心10min，取沉淀，获得精制蛋白原料。

醇溶蛋白提取：

(1)溶解：按照1:10的体积比，将精制蛋白原料与70体积％丙二醇水溶液混合，用2mol/L的NaOH溶液调节pH至溶解pH。200rpm搅拌的条件下，以溶解温度进行水浴加热60min。8000rpm离心20min，获得液相I。

(2)粗提：用2mol/L的HCl溶液将液相I的pH调节至酸沉pH，在酸沉温度下静置4h进行酸沉。8000rpm离心20min，获得液相II和固相II。

(3)精提：将固相II与水以1:10的体积比混合，而后用2mol/L的HCl溶液调节pH至精提pH。200rpm搅拌的条件下，在60℃下水浴加热60min。4000rpm离心10min，获得固相III。

将固相III在-50℃冷冻干燥36h，获得玉米醇溶蛋白。

表1

对比例1

采用实施例1中制备获得的精制蛋白原料，采用如下方法，按照表2中的条件进行玉米醇溶蛋白提取：

(1)溶解：将精制的蛋白原料按照1:10的体积比与70体积％乙醇水溶液混合。200rpm搅拌的条件下，以溶解温度进行水浴加热60min。4000

rpm离心5min，获得液相I。

(2)沉淀：将液相I与10倍体积的纯水，4℃冷藏4h，8000rpm离心10min，获得液相II与固相II。

(3)干燥：固相II在-50℃冷冻干燥36h，获得玉米醇溶蛋白。

(4)溶剂回收：液相II可选择通过塔板精馏进行回收。

表2

对比例2

采用无水乙醇为提取溶剂，通过高压高温反应釜在130℃提取60min后利用反应釜内外压力差获取提取液(液相I)。待提取液冷却至室温后8000rpm离心10min，获得液相II与固相II。固相II在40℃风干后获得玉米醇溶蛋白D6。

该方法需要用到高温高压反应釜，反应条件苛刻且只能小批量制备，难以大规模生产，成本较高。

对比例3

采用实施例1中的方法，不同之处在于将70体积％丙二醇水溶液替换为70体积％的乙醇水溶液，在pH值为12.5的条件下进行提取，通过加入水来沉淀醇溶蛋白。离心冻干后获得玉米醇溶蛋白D7。

对比例4

采用实施例1中的方法，不同之处在于将70体积％丙二醇水溶液换为0.5M的氢氧化钠水溶液。其余步骤与实施例1相同。离心冻干后获得玉米醇溶蛋白D8。

测试例1

分别采用凯氏定氮法检测精制蛋白原料以及以上实施例和对比例中获得的玉米醇溶蛋白的含量，通过以下公式计算提取率。

提取率(％)＝玉米醇溶蛋白质量/精制蛋白原料质量×100％

将样品溶于75％的乙醇溶液后，4000rpm离心10min，观察是否有沉淀产生，采用凯氏定氮法检测上清液中的蛋白含量，以确定以上实施例和对比例中获得的玉米醇溶蛋白的溶解度(即玉米醇溶蛋白的纯度，也即产品中以干基计的玉米醇溶蛋白百分含量)。结果详见表3。

表3

玉米醇溶蛋白编号	提取率/％	纯度/％	沉淀情况*
				A1	11.5	92.01	有少量沉淀
A2	18.2	91.83	有少量沉淀
				A3	31.2	91.74	有少量沉淀
A4	35.7	91.37	有少量沉淀
				A5	37.9	85.25	有明显沉淀
A6	4.6	92.23	有少量沉淀
				A7	35.8	91.26	有少量沉淀
A8	36.2	91.44	有少量沉淀
				A9	36.3	89.06	有少量沉淀
A10	36.6	84.57	有明显沉淀
				A11	35.6	90.54	有少量沉淀
A12	35.4	90.97	有少量沉淀
				A13	31.7	90.66	有少量沉淀
A14	34.9	91.54	有少量沉淀
				A15	35.8	89.77	有少量沉淀
A16	37.8	80.65	有大量沉淀
				A17	17.6	90.65	有少量沉淀
D1	18.1	92.64	有少量沉淀
				D2	21.9	92.88	有少量沉淀
D3	30.3	91.64	有少量沉淀
				D4	34.4	91.94	有少量沉淀
D5	34.8	91.23	有少量沉淀
				D6	15.8	91.75	无明显沉淀
D7	38.6	81.53	有明显沉淀
				D8	20.3	70.37	有明显沉淀

*通过对离心后在离心管底部的沉淀量进行观察，按照沉淀量由少到多的顺序可将观察结果分为“无明显沉淀”(离心管底部肉眼观察不到沉淀)、“有少量沉淀”(离心管底部仅有微量沉淀)、“有明显沉淀”和“有大量沉淀”。

测试例2

采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析实施例1中制备获得的玉米醇溶蛋白A4、A7、A8、A11、A12、A14的蛋白组成。具体方法如下：

0.25g样品用50mL的70体积％丙二醇水溶液溶解，60℃水浴60min。4000rpm离心5min，取上清液。采用表4中的配方制胶。采用表5中的配方制备电泳所用工作液。电泳条件：80V 40min，120V直至溴酚蓝条带跑至离电泳胶下部约0.5-1cm处。上样量5μL，按照表6中的顺序由左至右点样。

图1中示出了电泳结果图，从图中可以看出，本发明提供的方法制备获得的玉米醇溶蛋白与商用玉米醇溶蛋白标准品的蛋白组成相同。

表4

	浓缩胶(6％,20mL)	分离胶(15％,8mL)
			丙烯酰胺	0.47g	2.92g
甲叉双丙烯酰胺	0.013g	0.08g
			2mol/L Tris-HCl(pH 8.8)	-	3.75mL
2mol/L Tris-HCl(pH 6.8)	1mL	-
			10％SDS	0.08mL	0.2mL
10％过硫酸铵	40μL	60μL
			促凝剂(TEMED)	6μL	6μL

表5

表6

*第9泳道为商用玉米醇溶蛋白标准品，购自美国Sigma公司。

**第10泳道为2-245kD电泳Marker，购自北京索莱宝科技有限公司。

测试例3

(一)提取溶剂的直接循环利用

按照实施例1中的方法和表1中制备玉米醇溶蛋白A4的条件，将步骤(2)获得的液相II直接回用于步骤(1)中，进行玉米醇溶蛋白制备(操作流程可以参考图2)。循环过程中，每次提取时需补充约12体积％的新鲜提取溶剂(即循环过程中，100mL的提取溶剂中约含88mL回收的液相II和12mL浓度为70体积％的丙二醇水溶液)。

采用氧化钙脱水减重法和凯氏定氮法检测每次回用前液相II中的水分和杂质(如残留的少量醇溶蛋白等杂质)含量。采用测试例1中的方法检测每次制备获得的玉米醇溶蛋白的纯度，计算每次制备玉米醇溶蛋白的提取率，结果详见表7。

表7

循环次数*/次	丙二醇含量/体积％	杂质含量/重量％	蛋白纯度/％	提取率/％
					0	70.00	0	91.37	35.7
1	69.07	0.23	91.15	35.6
					5	65.68	1.24	91.10	35.2
10	62.04	1.77	90.05	35.3
					20	53.27	4.28	88.60	24.1

*循环次数指的是提取溶剂的回用次数，“0”即为采用新鲜的提取溶剂进行制备，“1”即为第一次循环使用液相II作为提取溶剂进行制备，依次类推。

(二)提取溶剂纯化后循环利用

按照试验(一)中的方法，不同的是，每次循环前，对液相II进行纯化处理再回用于步骤(1)。具体纯化方法为：加入少量氧化钙脱去部分水分，离心去除杂质后补充新鲜丙二醇至丙二醇含量为70％。

采用氧化钙脱水减重和凯氏定氮法分别检测每次回收的液相II和纯化后的液相II中的杂质(如残留的少量醇溶蛋白等杂质)含量。采用测试例1中的方法检测每次制备获得的玉米醇溶蛋白的纯度，计算每次制备玉米醇溶蛋白的提取率，结果详见表8。

表8

**表8中“纯化前”是指对提取溶剂进行对应次数的回用时，在回收后(未进行纯化时)，提取溶剂中的丙二醇/杂质的含量。例如，循环次数为5时，“纯化前”的丙二醇/杂质含量对应的是在第四次循环使用液相II作为提取溶剂，提取获得玉米醇溶蛋白后，回收的提取溶剂中的丙二醇/杂质含量。

(三)提取溶剂在模拟生产条件下循环利用

实际生产中不仅需要考虑产品的纯度和提取率，还需要考虑生产成本，因此，若每次循环均对提取溶剂进行纯化，则会增加操作流程，还会产生较高的纯化费用，使生产成本提高。因此，一般当回收的提取溶剂中的丙二醇含量或杂质含量在一定范围内时直接回用，当丙二醇和杂质中的任意一项超过规定范围时，才对循环使用的提取溶剂进行纯化处理。

采用试验(一)中的方法，进行玉米醇溶蛋白制备。期间检测每次回用前液相II中的丙二醇含量和杂质(如残留的少量醇溶蛋白等杂质)含量。当回收的液相II中的丙二醇含量低于60体积％，或杂质含量超过2重量％时，先采用试验(二)中的方法进行纯化，而后再回用于步骤(1)。采用测试例1中的方法检测每次制备获得的玉米醇溶蛋白的纯度，计算每次制备玉米醇溶蛋白的提取率，结果详见表9。

表9

**达到该循环次数前需要进行过多次纯化。

以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。

Claims

1.一种提取醇溶蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括：

（1）溶解：将蛋白原料与提取溶剂进行第一混合，而后进行第一固液分离，获得液相I，其中，所述提取溶剂为丙二醇或丙二醇水溶液；

（2）粗提：将所述液相I依次进行酸沉和第二固液分离，获得液相II和固相II；

（3）精提：将所述固相II与水进行第二混合，而后进行第三固液分离；

其中，步骤（1）中，所述蛋白原料选自玉米蛋白粉、小麦蛋白粉和高粱蛋白粉中的至少一种；

其中，步骤（2）中，所述酸沉的条件包括：pH 5-7；

其中，所述第二混合的条件包括：pH 1-3；

其中，所述第一混合的pH 11-13，温度为40-80℃。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（1）中，所述提取溶剂为浓度60-80体积%的丙二醇水溶液。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白原料的粒径为10-50μm。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述蛋白原料与提取溶剂的体积比为1:5-15。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一混合的时间为30-120min。

6.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一固液分离的方式包括：温度20-40℃，6000-10000rpm离心分离5-20min。

7.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）中，所述第二固液分离的方式包括：温度0-20℃，6000-10000rpm离心分离15-30min；

和/或，步骤（2）中，所述酸沉的方式为在0-20℃的温度下静置1-10h。

8.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中，所述固相II与水的体积比为1:5-15。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中，所述第二混合的条件包括：温度40-80℃，时间30-120min。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中，所述第三固液分离的方式包括：温度20-30℃，3000-5000rpm离心分离5-15min。

11.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法还包括在与提取溶剂进行第一混合前，对蛋白原料进行精制的步骤：将蛋白原料与复合酶混合进行酶解，获得酶解产物。

12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述复合酶包括纤维素酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶中的至少一种。

13.根据权利要求11所述的方法，其中，所述酶解的条件包括：pH 4-6，温度30-60℃，时间30-90min。

14.根据权利要求11所述的方法，其中，以所述蛋白原料的重量为基准，所述复合酶的用量为0.1-2重量%。

15.根据权利要求12所述的方法，其中，所述复合酶中，纤维素酶、淀粉酶和葡萄糖苷酶的重量比为1:1-5:1-5。

16.根据权利要求11所述的方法，其中，所述精制还包括将所述酶解产物依次进行酶失活和第四固液分离，获得的固相用于与提取溶剂进行第一混合。

17.根据权利要求16所述的方法，其中，所述酶失活的条件包括：pH 5-7，温度70-100℃，时间10-30min。

18.根据权利要求16所述的方法，其中，所述第四固液分离的方式包括：温度20-30℃，3000-5000rpm离心分离1-10min。

19.根据权利要求16所述的方法，其中，所述酶失活的pH值比酶解的pH值高0.5-1.5。

20.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还进一步地包括对步骤（3）中第三固液分离获得的固相III进行干燥，以获得醇溶蛋白的步骤。

21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述干燥的方式包括冷冻干燥、热风干燥和流化床干燥中的至少一种。

22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述干燥的条件包括：温度-50至80℃，时间30-40h。

23.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述方法还包括回收步骤（2）中获得的液相II作为提取溶剂，并将回收的提取溶剂回用于步骤（1）。

24.根据权利要求23所述的方法，其中，所述回收的提取溶剂中，丙二醇的含量为50-75重量%。

25.根据权利要求23所述的方法，其中，所述回收还包括将液相II进行纯化的步骤。

26.根据权利要求25所述的方法，其中，所述纯化的方式包括：氧化钙脱水和/或热风干燥。