CN103751215A - 一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法。本方法以活体蚯蚓为原料，经高渗试剂浸提、低温高速离心、混合纤维素微孔滤膜抽滤、交联葡聚糖凝胶过滤柱层析分离纯化、冷冻干燥后得到具有强镇痛活性的一种生物活性物质。本方法有效富集了蚯蚓中的镇痛活性成分，且活体浸提的方法极大地降低了其他非有效成分的干扰，使该制备工艺具有提取步骤简单、成本低廉、活性成分得率高等特点，适合实验室分析以及大规模生产。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，尤其是蚯蚓中镇痛活性物质的分离纯化。
背景技术
蚯蚓，又称为地龙，别名“地龙子”、“曲缮”，系环节动物。其味咸性寒，具有清热定惊、通络、平喘、利尿之功效。地龙作为我国传统的中药成分，广泛应用于皮肤烧烫伤的镇痛和治疗，且效果显著。吕金胜等研究了地龙醇提物的抗炎及镇痛作用，发现地龙醇提物可明显抑制致炎动物局部肿胀程度，降低血管通透性，大剂量显示有明显的镇痛效果，但其作用机制不明；陈斌艳等考查了地龙粉剂对小鼠、大鼠与兔的镇痛解热作用，结果显示地龙粉剂有明显的镇痛作用；北京中医药大学赵永烈等就芎芷地龙汤对偏头痛模型动物镇痛镇静作用及机制进行了研究，但应用材料为中药方剂，属混合物。
地龙的应用历史悠久，但目前主要的应用形式为研磨粉剂、贴剂和中药复方等混合物，对其镇痛活性成分的分离、纯化及表征尚未有明确报道，这极大地限制了该活性物质在临床上的推广应用，以及相关镇痛药物的研发。本发明意在对蚯蚓中镇痛活性成分进行初步的分离纯化，为其镇痛活性的作用机制及相关药理学、毒理学研究打下基础。
发明内容
据资料报道，蚯蚓中活性物质的分离纯化多以蚯蚓匀浆液为原料，其成分复杂，分离步骤繁琐，成本高且活性物质的得率较低；同时目前已有的蚯蚓镇痛药物主要为中药研磨粉剂和贴剂，有效成分不明确且含量较低。本发明的目的在于：克服以上问题，提供一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，通过高渗试剂浸提活体蚯蚓得到粗提液，采用交联葡聚糖凝胶层析柱进行分离纯化，得到具有高镇痛活性的活性物质。该方法操作简单、成本低廉，适合实验室分析及规模化生产。
为实现上述目的，本发明的技术方案是：
以活体蚯蚓为原料，经高渗试剂浸提、低温高速离心、混合纤维素微孔滤膜抽滤、交联葡聚糖凝胶过滤柱分离纯化后获得镇痛活性成分。包括以下步骤：
（1）粗提液的制备
取活体蚯蚓以去离子水清洗3-5次，使其吐尽泥沙，沥干待用，按每千克蚯蚓50-150g的量均匀地将高渗试剂洒在蚯蚓体表，静置浸提30-120min，浸提液10,000-15,000g、4-10℃低温高速离心5-20min后取上清液，以孔径0.45μm、0.3μm或0.22μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
（2）镇痛活性物质的纯化
取上述粗提液，上样于交联葡聚糖凝胶层析柱，加流动相进行分离洗脱，紫外检测仪280nm检测，分别收集各色谱峰组分，收集液经-40--50℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
在上述方法中，步骤（1）中所用的高渗试剂为葡萄糖、硫酸铵或蔗糖；步骤（1）中高渗试剂应用于活体蚯蚓，蚯蚓选自赤子爱胜蚓、双胸蚓、异唇蚓、正蚓、锯齿蚓中的一种；步骤（2）中使用的柱层析填料为交联葡聚糖，包括G10、G15、G25或G50；步骤（2）中使用的流动相为去离子水、0.01M-0.05M PBS缓冲液或0.01M-0.05M Tris-HCl缓冲液。
附图说明
图为蚯蚓粗提液经交联葡聚糖凝胶G25分离纯化所得色谱图（实验参数见实施例4），由图可见，粗提液经分离得到了四个主要色谱峰，按出现先后顺序分别标记为p1、p2、p3及p4。G10、G15、G25、G50 对p1、p2、p3的分离效果各不相同，但有效组分p4都能得到较好的分离纯化。p1、p2、p3初步鉴定为蛋白质，p4的成分初步鉴定为萜类衍生物，其紫外区内吸收范围较宽，没有特定的吸收波长，故280nm处的吸收峰较低。
本发明的有益效果
采用高渗试剂对活体蚯蚓进行浸提，浸提液主要为小分子物质，成分较简单，避免了传统匀浆方法中引入的蚯蚓机体构成大分子的干扰，使镇痛活性成分的提取步骤简单、得率高。已通过动物实验初步证实了该镇痛活性成分的镇痛效果，简介如下：
蚯蚓中镇痛活性物质的镇痛活性测定
选择健康成年小鼠30只（体重20±2g），购自山东鲁抗医药集团公司实验动物中心，分为三组：空白组、实验组及阳性对照组。经初步检测，图1中四个色谱峰组分只有色谱峰p4具有明显的镇痛活性，故只对该组分进行进一步活性测定。实验数据用mean±s 表示，组间同一时间点比较采用t 检验，与空白组相比，*P＜0.05 为显著性差异，* *P＜0.01为高度显著性差异。
热刺痛仪测定缩足潜伏期（PWTL）
采用PL-200 热刺痛仪（成都泰盟科技有限公司）测定PWTL，热刺痛仪从下方照射小鼠损伤侧足底中部，测定刺激开始至小鼠出现逃避性抬腿或舔足的时间，测定3次，间隔5分钟，取其平均值。空白组足底涂抹生理盐水，实验组涂抹p4色谱峰组分，阳性对照组均匀涂抹扶他林乳胶剂。
表1缩足潜伏期测定结果（mean±s，n=10）
光热尾痛测试仪测定甩尾反应潜伏期（TFL）
将小鼠装入小鼠圆筒以限制其随意行动，圆筒置于测痛仪上，鼠尾末端1/3 处对准仪器的热光线照射，选择温度为（55.0±0.5）℃，仪器记录从开始照射到鼠尾逃避的时间。实验前对实验动物进行筛选，方法为： SW-200光热尾痛测试仪（成都泰盟科技有限公司）测定TFL， TFL 小于2s 或大于20s，表示该动物反应过敏或者迟钝，剔除不用。共筛选出合格小鼠共30 只，随机分三组，尾部末端照射区域空白组涂抹生理盐水，实验组涂抹p4色谱峰组分，阳性对照组均匀涂抹扶他林乳胶剂。测定3次，间隔5分钟，取其平均值。若痛阈升高到20s 不甩尾时，即中断照射，并以20s 计算。
表2甩尾潜伏期测定结果（mean±s，n=10）
表1和表2中的实验结果表明， P4的镇痛活性与扶他林相当，与空白组相比，具有高度显著的镇痛活性。
具体实施方式
实施例1：一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，包括如下步骤：
1)活体蚯蚓用自来水清洗干净，待其吐净泥沙，用去离子水清洗3遍，使其身体表面的粘液、泥沙等污物完全去除。将清洗干净的蚯蚓沥干放置于烧杯中，按每千克蚯蚓50g的量均匀的将硫酸铵洒在蚯蚓体表，静置浸提90min，浸提液10,000g、4℃低温高速离心20min后取上清液，以孔径0.22μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
2) 取上述粗提液5mL，上样于填料为G10的交联葡聚糖凝胶层析柱（内径1.6cm，柱长50cm），以0.01M Tris-HCl缓冲液作为流动相进行洗脱3h，紫外检测仪280nm下检测，收集色谱峰组分P4，经 -40℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
实施例2：一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，包括如下步骤：
1) 活体蚯蚓用自来水清洗干净，待其吐净泥沙，用去离子水清洗3遍，使其身体表面的粘液、泥沙等污物完全去除。将清洗干净的蚯蚓沥干放置于烧杯中，按每千克蚯蚓100g的量均匀的将葡萄糖洒在蚯蚓体表，静置浸提60min，浸提液15,000g、4℃低温高速离心5min后取上清液，以孔径0.45μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
2) 取上述粗提液5mL，上样于填料为G15的交联葡聚糖凝胶层析柱（内径1.0cm，柱长40cm），以0.05M PBS缓冲液为流动相进行洗脱2.5h，紫外检测仪280nm下检测，收集色谱峰组分P4，经 -50℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
实施例3：一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，包括如下步骤：
1) 活体蚯蚓用自来水清洗干净，待其吐净泥沙，用去离子水清洗5遍，使其身体表面的粘液、泥沙等污物完全去除。将清洗干净的蚯蚓沥干放置于烧杯中，按每千克蚯蚓150g的量均匀的将蔗糖洒在蚯蚓体表，静置浸提30min，浸提液10,000g、10℃低温高速离心10min后取上清液，以孔径0.3μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
2) 取上述粗提液5mL，上样于填料为G25的交联葡聚糖凝胶层析柱（内径1.0cm，柱长40cm），以0.02M PBS缓冲液为流动相进行洗脱2.5h，紫外检测仪280nm下检测，收集色谱峰组分P4，经 -50℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
实施例4：一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，包括如下步骤：
1) 活体蚯蚓用自来水清洗干净，待其吐净泥沙，用去离子水清洗5遍，使其身体表面的粘液、泥沙等污物完全去除。将清洗干净的蚯蚓沥干放置于烧杯中，按每千克蚯蚓50g的量均匀的将硫酸铵洒在蚯蚓体表，静置浸提120min，浸提液15,000g、10℃低温高速离心15min后取上清液，以孔径0.45μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
2) 取上述粗提液10mL，上样于填料为G25的交联葡聚糖凝胶层析柱（内径4.5cm，柱长60cm），以去离子水为流动相进行洗脱3.0h，紫外检测仪280nm下检测，收集色谱峰组分P4，经 -50℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
实施例5：一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，包括如下步骤：
1) 活体蚯蚓用自来水清洗干净，待其吐净泥沙，用去离子水清洗5遍，使其身体表面的粘液、泥沙等污物完全去除。将清洗干净的蚯蚓沥干放置于烧杯中，按每千克蚯蚓50g的量均匀的将葡萄糖洒在蚯蚓体表，静置浸提120min，浸提液15,000g、10℃低温高速离心15min后取上清液，以孔径0.22μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
2) 取上述粗提液10mL，上样于填料为G50的交联葡聚糖凝胶层析柱（内径4.5cm，柱长60cm），以去离子水为流动相进行洗脱3h，紫外检测仪280nm下检测，收集色谱峰组分P4，经 -40℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
Claims (6)
1.一种蚯蚓中镇痛活性物质的制备方法，其特征在于该镇痛活性成分是以活体蚯蚓为原料，经高渗试剂浸提、低温高速离心、混合纤维素微孔滤膜抽滤、交联葡聚糖凝胶过滤柱层析分析纯化后获得。
2.权利要求1所述的镇痛活性物质的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）粗提液的制备
取活体蚯蚓以去离子水清洗3-5次，使其吐尽泥沙，沥干待用，按每千克蚯蚓50-150g的量均匀地将高渗试剂洒在蚯蚓体表，静置浸提30-120min，浸提液10,000-15,000g、4-10℃低温高速离心5-20min后取上清液，以孔径0.45μm、0.3μm或0.22μm的混合纤维素微孔滤膜抽滤，即得镇痛活性物质粗提液；
（2）镇痛活性物质的纯化
取上述粗提液，上样于交联葡聚糖凝胶层析柱，加流动相进行分离洗脱，紫外检测仪280nm检测，收集特定色谱峰组分，收集液经-40℃至-50℃冷冻干燥，即得镇痛活性物质。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，高渗试剂为葡萄糖、硫酸铵或蔗糖。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，高渗试剂应用于活体蚯蚓，蚯蚓选自赤子爱胜蚓、双胸蚓、异唇蚓、正蚓、锯齿蚓中的一种。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，交联葡聚糖凝胶层析柱填料为G10、G15、G25或G50。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，流动相为去离子水、0.01M-0.05M PBS缓冲液或0.01M-0.05M Tris-HCl缓冲液。
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| 程果: ""蚯蚓提取物镇痛有效成分分离纯化及镇痛作用的研究"", 《中国优秀硕士学位论文全文数据库（医药卫生科技辑）》 * |
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