CN111647554A - 从脐带间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种从脐带血骨髓间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法，所述外泌体从包含至少104个细胞细胞培养物获得，当所述细胞培养物达到融合时，在PBS中洗涤，加入KO‑DMEM培养基并放回含有二氧化碳的培养箱中培养，将所述细胞培养物培养2～20天，通过超速离心技术，尺寸排阻过滤，化学沉淀，不连续密度梯度，免疫亲和，超滤和/或高效液相色谱，优选使用PEG沉淀制备外泌体。本方法制备的外泌体稳定，纯度高，阳性标记物全面，可用于激活增殖再生，促进伤口愈合等医学临床用途。

Description

从脐带间充质干细胞制备的外泌体制剂及其方法
技术领域
本发明涉及细胞生物学，尤其涉及一种包括用于产生稳定的外泌体的制剂方法。
背景技术
外泌体是细胞衍生的囊泡(Hong,C.S.,Muller,L.,Boyiadzis,M.and Whiteside,T.L.,2014.Isolation and characterization of CD34+blast-derived exosomes inacute myeloid leukemia.PloS one,9(8),p.e103310)。它们存在于生物体液中，例如尿液，血浆和腹水。外泌体由内体多泡体的向内出芽产生。外泌体的转运的分子包括在细胞膜上表达的蛋白质/糖蛋白以及存在于亲代细胞胞质溶胶中的分子和可溶性因子。外泌体通常具有40-100nm的直径，并含有蛋白质，脂类，RNA和微RNA(Zhang,Z.,Wang,C.,Li,T.,Liu,Z.and Li,L.,2014.Comparison of ultracentrifugation and density gradientseparation methods for isolating Tca8113 human tongue cancer cell line-derived exosomes.Oncology letters,8(4),pp.1701-1706)。
由间充质干细胞产生的外泌体对心脏，肾脏，皮肤和肝脏中的组织修复和再生发挥调节作用(Tan,C.Y.,Lai,R.C.,Wong,W.,Dan,Y.Y.,Lim,S.K.and Ho,H.K.,2014.Mesenchymal stem cell-derived exosomes promote hepatic regeneration indrug-induced liver injury models)。间充质干细胞衍生的外泌体在药物诱导的肝损伤模型中促进肝再生(Stem cell research&therapy,5(3),p.76；Zhang,J.,Guan,J.,Niu,X.,Hu,G.,Guo,S.,Li,Q.,Xie,Z.,Zhang,C.and Wang,Y.,2015.)。从人源化的多能干细胞衍生的间充质干细胞(MSC)释放的外泌体通过促进胶原合成和血管生成促进皮肤伤口愈合(Journal of translational medicine,13(1),p.49.)。间充质干细胞来源的外泌体主要通过激活增殖和再生反应来引发再生效应。
MSC是非造血基质细胞，其能够分化并有助于再生(G.,Fox,J.,Ashton,B.andMiddleton,J.,2007.Concise review:mesenchymal stem cells:their phenotype,differentiation capacity,immunological features,and potential for homing.Stemcells,25(11),pp.2739-2749.)。MSC的治疗能力正在通过临床试验评估中。外泌体代表下一代再生医学的平台治疗手段。这些纳米级尺寸的细胞外膜囊泡是功能性信使RNA(mRNA)，microRNA(miRNA)和DNA分子以及蛋白质的有效递送载体，并且越来越多的证据表明它们可以赋予与生产细胞相似的治疗益处。已显示MSC衍生的外泌体在许多临床前模型中重现了MSC的作用(Théry,C.,Ostrowski,M.and Segura,E.,2009.Membrane vesicles asconveyors of immune responses.Nature reviews immunology,9(8),p.581；
Figure BDA0002498826200000021
M.,2009.Tetraspanins:push and pull in suppressing and promotingmetastasis.Nature Reviews Cancer,9(1),p.40；Yu,B.,Zhang,X.and Li,X.,2014.Exosomes derivedfrom mesenchymal)。MSC及其分离的外泌体具有很大的治疗潜力，可以减轻伤口愈合的全球负担。
纳米大小的外泌体相对于细胞具有主要的制造和毒理学优势，例如在使用微生物保持过滤器(例如0.22μm过滤器)的过程中增加无菌的确定性。作为非生物体的外泌体由于其非生命性质而潜在地降低了致瘤性和免疫原性反应的不良风险。与细胞相比，外泌体在选择稳定的药物储存温度方面当然也具有更大的灵活性(例如室温和低温，相比液氮)。目前用于产生MSC-外泌体的研究过程包括首先接种和在含有胎牛血清(FBS)的条件下生产MSC。对于外泌体产生，将MSC的汇合层洗涤并在无血清(不含FBS-外泌体)，含氧量正常(20％的氧气)的条件下培养48小时。然后使用沉淀方法(仅供研究使用)从解冻的条件培养基(含有外泌体)中分离外泌体，并在无血清基础培养基(研究级试剂)中配制。本领域需要更好的外泌体制剂，特别是用于临床用途，并且是稳定的。
外泌体在细胞间通讯、疾病生物学标志和药物传递上具有高潜力的临床运用价值，因此一个高效率且高纯度的外泌体制剂对于未来的临床十分重要。当前许多的各种技术都含有其弊端，不太适合用于临床的应用，其中包括超速离心法(费时，收率不稳定，纯度低损害囊泡)，密度梯度离心(步骤繁琐，十分耗时)，磁珠免疫法(效率低，外泌体生物活性易受pH和盐浓度影响，不利于下游应用)和沉淀法(纯度不高，颗粒大小不均一)。
发明内容
针对现有技术中的上述问题，本申请提供如下的技术方案：
本申请的第一方面提供了一种从细胞中制备外泌体的方法，包括：
所述细胞为细胞培养物，所述细胞培养物包含至少104个细胞，
当所述细胞培养物达到融合时，在PBS中洗涤，加入KO-DMEM培养基并放回含有二氧化碳的培养箱中培养，任选地，可将培养基离心15分钟以去除培养基中的细胞碎片；
将所述细胞培养物培养2～20天，通过超速离心技术，尺寸排阻过滤，化学沉淀，不连续密度梯度，免疫亲和，超滤和/或高效液相色谱制备外泌体。
在本申请一个优选的实施例中，所述细胞是原代细胞，永生化细胞，人类细胞和/或干细胞。
在本申请一个优选的实施例中，所述干细胞是间充质干细胞(简称MSC)，心脏组织来源的干细胞，脂肪组织来源的干细胞，神经组织来源的干细胞，或产生胰岛素的细胞。
在本申请一个优选的实施例中，所述细胞培养条件为在36～38℃和1～19％二氧化碳，在含有体积比5％～20％胎牛血清(FBS)或纯化人血小板裂解液和1％～5％的青霉素/链霉素(pen/strep)的KO-DMEM中培养。优选的所述二氧化碳浓度为2-8％，更优选的4.5-5.5％，最优选的为5％；优选的纯化人血小板裂解液为MesenCultTM-hPL，其为间充质基质细胞的扩增培养液，含有胎牛血清替代物纯化人血小板裂解液。
优选的所述细胞培养1～15天，更优选地培养5～10天。
在本申请一个优选的实施例中，所述使用差异超速离心使用1000～10,000g的离心力，所述尺寸排阻过滤使用孔径为0.1um～5um的过滤器；任选地，用0.22μm微生物排除过滤器对分离的外泌体进行过滤灭菌，任选地，使用0.45um过滤外泌体以去除细胞碎片；所述使用化学沉淀为使用沉淀试剂添加到细胞培养基中沉淀外泌体，优选的所述沉淀试剂为体积排除聚合物；所述高效液相色谱为流场流分级。
在本申请一个优选的实施例中，所述沉淀试剂为聚乙二醇，优选的，所述聚乙二醇的使用终浓度为5％～12.0％，所述聚乙二醇具有4,000～23,000道尔顿的分子量。
本发明的第二方面提供了一种外泌体制剂，所述外泌体制剂含有的外泌体直径为50nm～250nm；所述外泌体制剂含有105～1012个外泌体。
在本申请一个优选的实施例中，所述外泌体制剂为液体，所述细胞为间充质干细胞，所述外泌体制剂为零下20℃以下的状态，所述外泌体制剂包含质量体积比低于0.01％的聚乙二醇；
任选地，所述外泌体制剂通过使用0.10～1.00μM的排阻膜过滤器来除去可能的微生物污染物；任选地，所述细胞的培养基于500g～2,500g离心以除去死细胞和凋亡小体，并收集上清；任选地，所述细胞的培养基用聚乙二醇持续沉淀至少2小时，然后将沉淀的溶液以至少2,000g的离心力离心以获得外泌体；任选地，将外泌体进行第二，第三或更多的PEG沉淀以进一步纯化。
在本申请一个优选的实施例中，所述外泌体制剂预先进行冷冻干燥，并随后重悬于水溶液中；任选地，在冻干之前将纯化的外泌体与1％～6％的甘露醇，乳糖，蔗糖或海藻糖的冻干保护剂混合。
在本申请一个优选的实施例中，所述冻干步骤还包括在-70℃下将外泌体保持0.4～0.8mBar的真空处理，在-60℃～0℃的温度下处理4～72小时。
任选地，所述外泌体制剂已在药学上可接受的组合物中在保持外泌体制剂无菌的条件下制备。
本申请制备的外泌体制剂显示出保留有优异的颗粒大小和蛋白质表达，并且外泌体的冻干和再水化不会引起体外生物活性的任何显着的降低。并且本申请的制备方法可以获得更高纯度的外泌体，获得阳性标记物也更全，实验显示所有阳性标记CD63,CD9,CD81,TSG101，HSP70在本发明制备的外泌体制剂中均能检测到。
本申请的制备外泌体的方法，通过改善聚乙二醇沉淀法，包括胎盘间充质干细胞培养液方式，聚乙二醇的质量选择，增加离心次数，增加离心速度，因而可以提取大量MSC培养液而获取高回收率，步骤不繁琐，不耗时，并且，不影响外泌体形态，拥有很高的临床价值。此技术制备外泌体制剂在各个收藏环境下依然保持其活性，相比其他方法制备的外泌体的纯度也更高。
附图说明
图1A和1B描绘了源自UC(“Umbilical cord”脐带的简称)的MSC的形态表征。外泌体来源显示成纤维细胞样形态。比例尺为100微米。
图2描绘了使用流式细胞术对源自UC的MSC的表征。UC-MSC的细胞表面标志物的流式细胞术分析表达CD73，CD90，CD105和CD44的阳性标志物，但不是CD34，CD11b，CD19，CD45和HLA-DR，它们是阴性标志物。
图3描绘了从脐带分离的MSC的分化潜能。
图3A显示了UC-MSC的脂肪形成。在诱导培养中3周后，细胞用茜素红染色。骨细胞的小球染成红色。比例尺，100微米
图3B显示了UC-MSC的成骨作用。在成骨诱导3周后，用甲苯胺蓝对细胞染色。软骨细胞的钙沉积物染成蓝色。比例尺，100微米
图3C显示了UC-MSC的脂肪形成。在诱导诱导3周后，细胞用油红O染色。脂肪细胞的蛋白多糖沉积物染成红色。比例尺1005微米。
图4A显示了使用动态光散射(DLS)预冻干(广泛分布于30至400nm并且在102nm处的峰)和冻干后(广泛分布于50至600nm并且在184nm处的峰)UC-MSC衍生的外泌体的大小分布(DLS)系统。
图4B显示了冻干前和冻干后外泌体的总蛋白质浓度。
图5描绘了使用蛋白质印迹的冻干前和冻干后的MSC衍生的外泌体的蛋白质表达。
图5A的Western blot结果显示所有源自MSC的外泌体富含四跨膜蛋白阳性标记物CD63。图5B的Western blot结果显示所有源自MSC的外泌体富含内体阳性标记TSG101。图5C的Western blot结果显示所有源自MSC的外泌体显示不存在内质网阴性标记物GRP94。
图6描绘了使用纳米颗粒跟踪分析(Nano Tracking Analysis)的成果。
图6A显示了外泌体广泛分布于50至150nm并且在85nm处处于顶峰，CD63染色颗粒为1.4x 10 10颗粒/mL，CD81染色颗粒为2.1x 10 10颗粒/mL，CD63染色颗粒为2.4x 10 10颗粒/mL。图6B显示了纳米颗粒跟踪分析截图(发亮体为外泌体)。
图7显示了两种分离外泌体技术所制备的外泌体颗粒直径(nm)
图7A显示目前制备法(PEG沉淀法)的外泌体直径为101nm。
图7B显示
Figure BDA0002498826200000063
Plus-70旋转超滤法的外泌体直径为127nm。
图8描绘了两种分离技术所制备的外泌体总蛋白质浓度及蛋白质标记物表达。图8A显示目前制备法(PEG沉淀法)和旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000061
Plus-70)隔离的外泌体总蛋白质。两种方法显示明显的总蛋白质。图8B显示目前制备法(PEG沉淀法)和旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000062
Plus-70)隔离的外泌体蛋白质标记物表达。两种技术的外泌体显示不存在内质网阴性标记物GRP94，但目前制备法显示所有阳性标记(CD63,CD9,CD81,TSG101，HSP70)而旋转超滤法外泌体只显示三种阳性标记(CD63,CD9,CD81)。
图9描绘了两种隔离技术所隔离的外泌体纳米颗粒跟踪分析(Nano TrackingAnalysis)的成果。
图9A显示目前制备法(PEG沉淀法)外泌体广泛分布于50至150nm，CD63染色颗粒为1.4x 10 10颗粒/mL，CD81染色颗粒为2.1x 10 10颗粒/mL，CD63染色颗粒为2.4x 10 10颗粒/mL。
图9B显示目前制备法(PEG沉淀法)颗粒跟踪分析截图(发亮体为外泌体)。
图9C显示旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000071
Plus-70)外泌体广泛分布于50至150nm，CD63染色颗粒为1.9x 10 10颗粒/mL，CD81染色颗粒为5.3x 10 10颗粒/mL，CD63染色颗粒为2.7x10 10颗粒/mL。
图9D显示旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000072
Plus-70)外泌体广泛分布于颗粒跟踪分析截图(发亮体为外泌体)。
具体实施方式
对分离的UC-MSC衍生的外泌体进行检查和表征。通过形态学和可塑性(图1)，特异性表面抗原(Ag)表达分析(图2)和多能分化潜能(图3)根据国际细胞疗法学会定义间充质干细胞的标准确认外泌体的来源为MSC(Dominici M,Le Blanc K,Mueller I,Slaper-Cortenbach I,Marini F,Krause D,Deans R,Keating A,Prockop Dj,Horwitz E.Minimalcriteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells.The InternationalSociety for Cellular Therapy position statement.Cytotherapy.2006；8(4):315-7.)。
对分离的UC-MSC衍生的外泌体进行检查和表征。粒径(图4A)和外泌体蛋白质表达分析(图4B)结果满足根据国际细胞外囊泡学会定义的细胞外囊泡最低要求(
Figure BDA0002498826200000073
J,HillAF,Hochberg F,Buzás EI,Di Vizio D,Gardiner C,Gho YS,Kurochkin IV,MathivananS,Quesenberry P,Sahoo S,Tahara H,Wauben MH,Witwer KW,Théry C.Minimalexperimental requirements for definition of extracellular vesicles and theirfunctions:a position statement from the International Society forExtracellular Vesicles.J Extracell Vesicles.2014Dec22；3:26913.)。
为了确定外泌体是否可以冻干并保持其活性，进行初始实验以评估该方法。使用speedvac导致外泌体的极大不稳定性，并且外泌体生物活性丧失。在冷冻干燥之前将浓缩的MSCs衍生的外泌体在-80℃下储存2-12小时或12-24小时，同时保持在升华条件下、低温、冻干，在-80℃下储存至少30天，并在水中进行再水化。然后测试再水化的外泌体的粒度和表面标志物表达(图4和5)。冻干的外泌体显示出保留有优异的颗粒大小和蛋白质表达，这与非冻干的外泌体相似。因此，外泌体的冻干和再水化不会引起体外生物活性的任何显着的降低。
本发明允许产生稳定的外泌体制剂。本发明包括这些外泌体制剂和制备它们的方法。
1.生产外泌体的方法
本发明包括通过培养细胞产生外泌体的方法。本发明包括产生外泌体的方法，其通过在至少2天内培养细胞并从细胞中收获外泌体。
优选地，细胞培养物包含至少104,105,106,107,108,109,1010,1011或1012个细胞。
优选地，细胞是原代细胞。原代细胞可以至少在第2,3,4,5,6,7,8,9或10代传代。
在一个实施方案中，本发明还包括永生化细胞。
优选地，所述细胞是人类细胞。特别优选的细胞类型是间充质干细胞(MSC)。其他优选的细胞类型是心脏组织来源的干细胞，脂肪组织来源的干细胞，神经组织来源的干细胞，产生胰岛素的细胞和其他组织来源的干细胞。
在一个实施方案中，细胞可以在常规培养条件下生长，例如，在37℃下和5％CO2下，在含有5％或10％或20％胎牛血清(FBS)或MesenCultTM-hPL(购自STEMCELLTechnologies,货号05439规格500mL)和1％或2％或3％或4％或5％pen/strep的KO-DMEM(购自ThermoFisher)中培养。
在各种实施方案中，二氧化碳浓度为1-2％、2-3％、4-5％、5-6％、6-7％、7-8％、8-9％、9-10％、10-11％、11-12％、12-13％、13-14％、14-15％、15-16％、17-18％、或18-19％。优选地，二氧化碳浓度为2-8％，氧为3-7％，4-6％或4.5-5.5％。
细胞可以培养至少2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17,18,19或20天。优选地，将细胞培5-10天，5-15天或10-15天。
2.外泌体的制备
本发明包括由本发明的细胞培养物产生的外泌体。在各种实施方案中，外泌体制剂含有直径为50nm至250nm的外泌体。优选地，至少25％，50％，65％，75％，80％，85％，90％或95％的外泌体至少为50nm，60nm，70nm，80nm，90nm，100nm，110nm，120nm，130nm，140nm，150nm或160nm。优选至少25％，50％。65％，75％，80％，85％，90％或95％外泌体的直径小于250nm，240nm，230nm，220nm，210nm，200nm，190nm，180nm，170nm，160nm，150nm或140nm。因此，本发明包括外泌体，其中至少25％，50％65％，75％，80％，85％，90％或95％的外泌体的直径为50nm至250nm，直径为60nm至250nm，直径为60nm至240nm，和/或直径为50nm至240nm(图6和图7所示)。
在一些实施例中，所述的外泌体含有至少105,106,107,108,109,1010,1011或1012个外泌体。在一些实施方式中，所述外泌体制剂含有105,106,107,108,109,1010,or 1011to106,107,108,109,1010,1011或1012个外泌体。
在各种实施方案中，产生外泌体的细胞培养物中的二氧化碳浓度为1-2％，2-3％，4-5％，5-6％，6-7％，7-8％，8-9％，9-10％，10-11％，11-12％，12-13％，13-14％，14-15％，15-16％，17-18％或18-19％。优选地，二氧化碳浓度为2-8％，二氧化碳3-7％，二氧化碳4-6％，二氧化碳4.5-5.5％。
3.稳定的液体MSC外泌体制剂
在一些实施方案中，本发明包括稳定的液体外泌体制剂。在本发明的“稳定液体MSC外泌体制剂”的上下文中，术语“液体”是指制剂在20℃，25℃，27℃或29℃下的状态。因此，当在-20℃，-80℃和/或冻干粉末形式下冷冻时，稳定的液体MSC外泌体制剂可以是固体。短语“适合于对人施用”是指制剂已在药学上可接受的组合物中在保持制剂无菌的条件下制备。
稳定的液体MSC外泌体制剂可含有至少105,106,108,109,1010,1011,1012个MSC外泌体。在一些实施方案中，稳定的液体MSC外泌体制剂含有105,106,107,108,109,1010或1011至106,107,108,109,1010,1011或1012个MSC外泌体。
在一些实施方案中，稳定的液体外泌体制剂包含小于1.0％，0.1％，0.01％，0.001％，0.0001％等的聚乙二醇(w/v)。优选地，稳定的液体外泌体制剂包含少于0.01％的聚乙二醇。
优选地，稳定的液体外泌体制剂通过化学沉淀产生。最优选地，通过化学沉淀从间充质干细胞(MSC)中化学沉淀产生稳定的液体外泌体制剂。
4.稳定的冻干的外泌体制剂
在一些实施方案中，本发明包括稳定的冻干外泌体制剂。在“本发明的稳定的冻干外泌体制剂”的上下文中，术语“冻干的”是指预先进行冻干(即冷冻干燥)步骤的外泌体制剂。因此，“稳定的冻干外泌体制剂”可以指干燥的外泌体制剂或已经进行冻干并随后重悬于水溶液中的外泌体制剂。短语“适合于对人施用”是指制剂已在药学上可接受的组合物中在保持制剂无菌的条件下制备。
稳定的冻干外泌体制剂可含有至少105,106,108,109,1010,1011或1012个MSC外泌体。在一些实施方案中，稳定冻干外泌体制剂含有105,106,107,108,109,1010或1011至106,107,108,109,1010,1011或1012个外泌体。
在一些实施方案中，稳定的冻干外泌体制剂包含小于1.0％，0.1％，0.01％，0.001％，0.0001％等的聚乙二醇(w/v)。
在一些实施方案中，稳定的冻干外泌体制剂外泌体制剂由间充质干细胞(MSC)产生。在一些实施方案中，稳定的冻干外泌体制剂由心脏组织衍生的干细胞、脂肪组织衍生的干细胞、神经组织衍生的干细胞、产生胰岛素的细胞和其他组织来源的干细胞产生。
优选地，稳定的冻干外泌体制剂是由化学沉淀产生的。最优选地，稳定的冻干外泌体制剂是通过来自间充质干细胞(MSC)的化学沉淀产生的。
5.外泌体的获得
外泌体可以通过常规技术从细胞培养物中获得。例如，当细胞达到融合时，可以在25ml PBS中洗涤一次，两次或三次，加入30ml KO-DMEM(不含FBS)并放回指定浓度的二氧化碳的培养箱中。一段时间后可以取出KO-DMEM培养基并置于50ml锥形管中。可将培养基以3000g离心15分钟以消除细胞碎片。将培养基在15ml锥形管中分离成10ml份并储存在-80℃的环境下。
外泌题可以在培养至少1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14或15天后获得。
在一些实施方案中，每2天，3天，4天或5天培养收获外泌体。
6.外泌体的纯化
外泌体制剂可通过本领域的常规技术制备。在一些实施方案中，外泌体的制备包括离心细胞和/或根据细胞调节培养基。在一些实施方案中，使用超速离心技术。在一些实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备是通过尺寸排阻过滤。在一些实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备包括使用化学沉淀，不连续密度梯度，免疫亲和，超滤和/或高效液相色谱(HPLC)。
在一些实施方案中，使用差异超速离心，包括使用至少1000xg，2000xg，3000xg，4000xg，5000xg，6000xg，7000xg，8000xg或9000xg，至2000xg，3000xg，4000xg，5000xg，6000xg，7000xg，8000xg的离心力，9000xg，10,000xg或更大，以将更大尺寸的颗粒与来自细胞的外泌体分离。
在一些实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备包括使用过滤或超滤。在某些实施方案中，使用具有不同孔径的尺寸排阻膜。例如，尺寸排阻膜可包括使用孔径为至少0.1um，0.5um，1.0um，2.5um，5um，0.5um，1.0um，2.5um，5um或更大的过滤器。
优选地，用0.22μm微生物排除过滤器对分离的外泌体进行过滤灭菌。优选地，使用0.45um过滤外泌体以去除细胞碎片。
在其他实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备包括使用沉淀试剂。例如，可以将沉淀试剂(例如EXOQUICKCR)添加到条件细胞培养基中以快速地沉淀外泌体群。在一些实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备包括使用体积排除聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))。
在另一个实施方案中，来自细胞群的外泌体的制备包括使用流场流分级(FIFFF)，这是一种基于洗脱的技术。
在一些实施方案中，PEG的使用终浓度为5％，10％，15％或20％，7.0％，7.5％，8.0％，8.5％，9.0％，9.5％，10.0％，10.5％，11.0％，11.5％或12.0％沉淀外泌体。在一些实施方案中，PEG具有约4,000,6,000,8,000,10,000,12,000,15,000或23,000道尔顿的分子量。
7.外泌体表征的方法
一些实施方案中，二辛可宁酸测定法(BCA测定法)用于定量纯化的外泌体蛋白质含量。使用BCA测定可以检测到0.5μg/mL至50μg/mL的蛋白质。在每次蛋白质印迹法或流式细胞术中使用0.5μg，1.0μg，2.0μg，5.0μg，10μg，20μg或50μg蛋白质含量。
在一些实施方案中，在Western印迹分析中富含CD9，CD63，CD81，TSG101，膜联蛋白或HSP70的阳性外泌体标记蛋白的外泌体。在一些实施方案中外泌体在Western blot分析中没有表达或较少表达GRP94或钙联接蛋白的外泌体标记蛋白(图5所示)。
在一些实施方案中，外泌体在电子透射电子显微镜(TEM)或扫描电子显微镜下呈现球形，圆形，碟状形状，并且具有20-50nm，50-80nm，80-120nm，120-150nm，150-200nm，200-300nm，300-400nm或400-500nm的直径。
8.制备稳定的液体外泌体制剂的方法
本发明包括制备稳定的液体外泌体制剂的方法。在一个实施方案中，使用体积排除聚合物(例如，聚乙二醇(PEG))对外泌体进行化学沉淀。优选地，PEG具有约4,000,6,000,8,000,10,000,12,000,15,000或23,000道尔顿的分子量。
液体培养基于约500g，1,000g，1,500g，2,000g或2,500g离心以除去死细胞和凋亡小体，并收集上清。
在一些实施方案中，使用0.10,0.20,0.22,0.45,0.80或1.00μM的排阻膜过滤器来除去可能的微生物污染物。
在一些实施方案中，培养基用4,000,6,000,8,000,10,000，12,000,15,000或23,000道尔顿PEG中持续2小时，4小时，8小时，12小时或超过12小时沉淀。将沉淀的溶液以2,000g，2,500g，3,000g，3,500g，4,000g或更高的速度离心以获得外泌体。
将外泌体进行第二，第三或第四PEG沉淀以进一步纯化。
9.稳定的冻干的外泌体制剂的制备方法
本发明包括制备稳定的液体外泌体制剂的方法。在优选的实施方案中，保持在升华条件下的低温
在优选的实施方案中，外泌体在PBS或PLASMALYTE的溶液中提供。
在一个实施方案中，在升华之前将外泌体冷冻至-70℃。
在一个实施方案中，在冻干之前将纯化的外泌体与1％，2％，3％，4％，5％或6％的甘露醇，乳糖，蔗糖或海藻糖的冻干保护剂混合。
在一个实施方案中，该方法包括在-70℃下使外泌体经受0.5mBar真空处理。在各种实施方案中，该方法包括在-70℃下将外泌体保持0.4,0.5,0.6,0.7或0.8mBar在-60℃至-0℃，优选-50℃，-40℃，-30℃，-10℃或0℃的温度下处理4-72小时。
在优选的实施方案中，将冻干的外泌体重悬于水溶液中，优选水或盐水。
10.稳定的外泌体制剂的储存方法
在一些实施方案中，本发明包括储存稳定的外泌体制剂的方法。在一些实施方案中，将制剂维持在环境室温下。在一些实施方案中，将制剂维持在或低于20℃，10℃，4℃，0℃，-10℃，-20℃，-40℃，-80℃等。在一些实施方案中将制剂在给定温度下维持至少1周，1个月，2个月，3个月，6个月，1年等。
11.外泌体的分析
外泌体的数量和大小可以定量，例如使用Nanosight定量方法。
可以使用常规技术分析外泌体的蛋白质含量以确定总蛋白质水平，或者通过使用常规蛋白质检测技术(例如蛋白质印迹法)来确定特定蛋白质的水平。
12.本发明与现有商业外泌体隔离技术比较
除了利用各种分析确认了本技术成功隔离外泌体，本技术也和市场上现有旋转超滤法外泌体隔离技术
Figure BDA0002498826200000141
Plus-70(Millipore)进行比较。图7描绘了两种隔离技术所的外泌体颗粒直径(nm)，目前制备法(PEG沉淀法)的外泌体直径为101nm。而对比
Figure BDA0002498826200000144
Plus-70旋转超滤法的外泌体直径为127nm，两种技术隔离的外泌体都在30-150nm范围内。图8描绘了两种隔离技术所隔离的外泌体总蛋白质浓度及蛋白质标记物表达。图8(A)显示目前制备法(PEG沉淀法)和旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000142
Plus-70)隔离的外泌体总蛋白质。两种方法显示明显的总蛋白质。图8(B)显示目前制备法(PEG沉淀法)和旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000143
Plus-70)隔离的外泌体蛋白质标记物表达。两种技术的外泌体显示不存在内质网阴性标记物GRP94，但目前制备法显示所有阳性标记(CD63,CD9,CD81,TSG101，HSP70)而旋转超滤法外泌体只显示三种阳性标记(CD63,CD9,CD81)。这显示目前制备方法取得更高的外泌体纯度。
图9描绘了两种隔离技术所隔离的外泌体纳米颗粒跟踪分析(Nano TrackingAnalysis)的成果。
(A)目前制备法(PEG沉淀法)外泌体广泛分布于50至150nm，CD63染色颗粒为1.4x10 10颗粒/mL，CD81染色颗粒为2.1x 10 10颗粒/mL，CD63染色颗粒为2.4x 10 10颗粒/mL。
(B)目前制备法(PEG沉淀法)颗粒跟踪分析截图(发亮体为外泌体)。
(C)旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000152
Plus-70)外泌体广泛分布于50至150nm，CD63染色颗粒为1.9x 10 10颗粒/mL，CD81染色颗粒为5.3x 10 10颗粒/mL，CD63染色颗粒为2.7x 10 10颗粒/mL。
(D)旋转超滤法(
Figure BDA0002498826200000153
Plus-70)外泌体广泛分布于颗粒跟踪分析截图(发亮体为外泌体)。
表1描述了描绘了两种隔离技术所隔离的外泌体纳米颗粒跟踪分析(NanoTracking Analysis)总汇。
Figure BDA0002498826200000151
Figure BDA0002498826200000161
Figure BDA0002498826200000171
结果显示目前制备方法可以取得更高的外泌体纯度。
以上内容是结合具体实施方式对本申请所作的详细说明，不能认定本申请的实现方式只局限于这些说明。对于本申请技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请基本发明构思的前提下，还可以进行若干简单推演或替换。

Claims (10)

1.从细胞中制备外泌体的方法，包括：
所述细胞为细胞培养物，所述细胞培养物包含至少104个细胞，
当所述细胞培养物达到融合时，在PBS中洗涤，加入KO-DMEM培养基并放回含有二氧化碳的培养箱中培养，任选地，可将培养基离心15分钟以去除培养基中的细胞碎片；
将所述细胞培养2～20天，通过超速离心技术，尺寸排阻过滤，化学沉淀，不连续密度梯度，免疫亲和，超滤和/或高效液相色谱制备外泌体。
2.权利要求1所述的从细胞中制备外泌体的方法，其特征在于：所述细胞是原代细胞，永生化细胞，人类细胞和/或干细胞。
3.权利要求2所述的从细胞中制备外泌体的方法，其特征在于：所述干细胞是间充质干细胞，心脏组织来源的干细胞，脂肪组织来源的干细胞，神经组织来源的干细胞，和/或产生胰岛素的细胞。
4.权利要求1所述的从细胞中制备外泌体的方法，其特征在于：所述细胞培养条件为在36～38℃和1～19％二氧化碳，在含有体积比5％～20％胎牛血清或纯化人血小板裂解液和1％～5％的青霉素/链霉素的KO-DMEM中培养。
5.权利要求1所述的从细胞中制备外泌体的方法，其特征在于：所述超速离心使用1000～10,000g的离心力，所述尺寸排阻过滤使用孔径为0.1um～5um的过滤器，所述化学沉淀为使用沉淀试剂添加到细胞培养基中沉淀外泌体，所述高效液相色谱为流场流分级；任选地，用0.10～1.00μm微生物排除过滤器对分离的外泌体进行过滤灭菌，任选地，使用0.45μm过滤外泌体以去除细胞碎片。
6.权利要求5所述的从细胞中制备外泌体的方法，其特征在于：所述沉淀试剂为聚乙二醇，优选的，所述聚乙二醇的使用终浓度为体积比5％～12.0％，所述聚乙二醇具有4,000～23,000道尔顿的分子量。
7.权利要求1～6中任一项的方法制备的外泌体制剂，所述外泌体制剂含有105～1012个外泌体；所述外泌体制剂含有的外泌体直径为50nm～250nm。
8.权利要求7所述的外泌体制剂，其特征在于：所述外泌体制剂为液体，所述细胞培养物为间充质干细胞，所述外泌体制剂为零下20℃以下的状态，所述外泌体制剂包含质量体积比低于0.01％的聚乙二醇；
任选地，所述细胞的培养基于500g～2,500g离心以除去死细胞和凋亡小体，并收集上清；任选地，所述细胞的培养基用聚乙二醇持续沉淀至少2小时，然后将沉淀的溶液以至少2,000g的离心力离心以获得外泌体；任选地，将外泌体进行第二，第三或更多PEG沉淀以进一步纯化。
9.权利要求8所述的外泌体制剂，其特征在于：所述外泌体制剂预先进行冷冻干燥，并随后重悬于水溶液中；任选地，在冻干之前将纯化的外泌体与1％～6％的甘露醇，乳糖，蔗糖或海藻糖的冻干保护剂混合。
10.权利要求9所述的外泌体制剂，其特征在于：所述冻干步骤还包括在-70℃下将外泌体保持0.4～0.8mBar的真空处理，在-60℃～0℃的温度下处理4～72小时。
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