CN113416709A - 促使iPSC分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统，S1：诱导多能干细胞的培养，所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞，使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用无动物源性外周神经诱导培养基‑01；S3：外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞，使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基‑02进行培养。对比现有方法，本专利工艺整体优化，2种培养基即可制备高纯度的外周神经元细胞，培养基化学成分明确，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，工艺整体可做到无动物源性，避免了动物源性致病因子污染风险，适用于大的表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的外周神经元细胞产量，有利工业化生产。

Description

促使iPSC分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统
技术领域
本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种促使iPSC分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统。
背景技术
外周神经系统的神经元细胞(Peripheral Nervous System Neurons，iPN)在疾病治疗、药物研发、科学研究等领域有巨大应用潜力。其中，疾病治疗和药物研发都需要数量较大、纯度较高的外周神经元细胞。外周神经元细胞的现有获得方法主要为干细胞分化法，通过体外分化手段，将胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell，ESC)或诱导多能干细胞(induced Pluripotent Stem Cell，iPSC)分化为外周神经系统前体细胞，再进一步分化为外周神经元细胞。然而，现有体外分化方法大多工艺欠成熟，使用化学成分不完全明确的培养基，对培养基关键成分的浓度也未有深入研究，所得到的外周神经元细胞批次间质量差异较大，不利工业生产，限制了外周神经元细胞的应用。分化过程所使用的试剂和物料包含了牛血清白蛋白、鼠源细胞分泌物(基质胶，Matrigel)等大量的动物源性物料。故以现有干细胞分化法制备得到的外周神经元细胞，和工业规模生产和实际临床应用仍有较大的距离。另一方面，ESC本身的获得需要消耗胚胎组织，有一定的道德争议。此外，现有技术多用于科学研究，未尝试摸索外周神经元细胞大量生产的方法，未能满足工业生产和治疗应用的需求。
综上，目前外周神经元细胞的获得途径有限，制备工艺步骤欠成熟，使用化学成分不完全明确、含动物源性成分的试剂和培养基，所得到的外周神经元批次间质量差距较大，制备成本高、产量低，局限了其应用，亟需一种制备过程简化、制备时间短、成本低、污染风险小、产量和纯度高、利于工业化生产的分化方法和培养基。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的方法及培养基和系统，S1：诱导多能干细胞的培养，所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；S2：诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞，使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，同时使用无动物源性外周神经诱导培养基-01；S3：外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞，使用重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02。
本发明提供一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的方法，包括以下步骤：
S1：诱导多能干细胞的培养；
包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；
S2：诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞(Peripheral Nervous SystemNeural Progenitor，NP)；
将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，以胰酶替代物对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。
S3：外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞；
将外周神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。
进一步的，所述步骤S1中所述原代培养和/或所述传代培养中诱导多能干细胞的接种密度为1.0～2.5×104个/cm2，优选为1.5×104个/cm2。在1.5×104个/cm2的接种密度下诱导多能干细胞的相对产量最高。
进一步的，所述步骤S2中所述诱导多能干细胞的接种密度为1.0～4.0×104个/cm2，优选为2.0×104个/cm2。在2.0×104个/cm2的接种密度下外周神经干细胞的产量最高。
进一步的，所述步骤S3中所述外周神经干细胞的接种密度为0.5～3.0×104个/cm2，优选为3.0×104个/cm2。在3.0×104个/cm2的接种密度下外周神经元细胞的产量最高。
进一步的，所述步骤S2中所述无动物源性外周神经诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、全反式维生素A酸、Y27632。其中，LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、Y27632为潜在候选药物的代号。所述无动物源性外周神经诱导培养基-01完全无动物源性。
进一步的，所述步骤S3中所述无动物源性外周神经诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。其中，Y27632为潜在候选药物的代号。所述无动物源性外周神经诱导培养基-02完全无动物源性。
本发明还提供一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的无动物源性外周神经诱导培养基-02，包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。GlutaMAX是生产商的一个产品名称，为谷氨酰胺的替代物，功能上等同于谷氨酰胺，因为高浓度的谷氨酰胺长期培养可产生细胞毒性。其中，Y27632为潜在候选药物的代号。所述无动物源性外周神经诱导培养基-02完全无动物源性。
进一步的，所述GlutaMAX的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述脑源性神经营养因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述神经生长因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述Y27632的浓度为0.5～25μg/mL；所述5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度为0.5～25μg/mL。
本发明还提供一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的系统，包括以下组分：
(1)玻连蛋白处理的细胞培养器皿；
(2)重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿；
(3)所述的无动物源性外周神经诱导培养基-01；
(4)所述的无动物源性外周神经诱导培养基-02。
其中，玻连蛋白和重组层粘连蛋白处理细胞培养器皿在培养器皿层面避免了动物源性物料。
进一步的，所述重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿的表面面积为25～75cm2。75cm2的大器皿可以实现大体积量的外周神经元细胞制备，有利于工业化生产。
综上，与现有技术相比，本发明达到了以下技术效果：
1.本发明的方法改良试剂组合，培养基配方可做到化学成分明确，成功摸索关键试剂的浓度范围，在每个批次的培养基进行配制时，可对所有原材料进行控制，并减少因培养基成分不明或试剂浓度不确定带来的终产品质量波动，在培养基的质量控制和终产品的质量控制上有明显优势，上述改进使外周神经元细胞的制备工艺得到整体优化，有利于工业化生产。
2.本发明的方法以非动物源性物料完全取代牛源性、鼠源性物料，开发了“无动物源性培养体系”，减少动物病原体污染等风险。其中，现有技术往往使用B27这个血清替代物，但B27仍含有动物源性，并且其各个原料浓度是不公开的，不利质量控制。上述改进有利包括临床治疗在内的各类应用。
3.本发明的方法对细胞接种密度、培养用器皿的大小、培养基使用量等条件进行了摸索，有利于外周神经元细胞大量生产，满足工业生产和治疗应用的需求。
4.本发明的方法获得的外周神经元细胞的纯度高，可收获纯度大于90％的外周神经元细胞。
5.本发明的方法可以缩短分化为外周神经元细胞的时间，可在最短10天内收获较高纯度的外周神经元细胞。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为各个培养基配方在不同外周神经干细胞接种密度下进行10～12天分化后，iPN的纯度。§：在相同NP接种密度下，pNiM-02AF对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
图2为各个培养基配方在不同外周神经干细胞接种密度下进行10～12天分化后，iPN的产量。※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义；※※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104和1.0×104，P≤0.05，有统计学意义；※※※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104、1.0×104和2.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
图3为使用pNiM-02AF对接种在25cm2或75cm2培养皿的外周神经干细胞进行10～12天分化后，iPN的纯度。
图4为使用pNiM-02AF对接种在25cm2或75cm2培养皿的外周神经干细胞进行10～12天分化后，iPN的产量。*：对比接种密度0.5×104，P≤0.05。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
本发明的方法具体包括以下几个步骤：
(1)iPSC的培养
将iPSC以1.0～2.5×104个/cm2的密度接种在经过玻连蛋白(Vitronectin，Vc，无动物源性，代替鼠源性的基质胶Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用Essential 8培养基(E8)进行原代培养，每隔24小时更换培养基，3～4天后、iPSC融合度达到60～80％时以胰酶替代物(TrypLE)或EDTA(浓度为0.5mM)对iPSC进行处理，收集iPSC后进行传代培养，传代时同样以1.0～2.5×104个/cm2的密度接种在经过玻连蛋白处理的细胞培养皿。
(2)iPSC的NP分化
将iPSC以1.0～4.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Laminin，Lm，无动物源性，代替鼠源性的基质胶Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01(pNiM-01AF)进行培养，每隔36～48小时更换培养基，在培养8～10天后以TrypLE对iPSC分化后得到的NP进行处理，收集到的NP用于下一步iPN分化。
(3)外周神经元细胞(iPN)的制备
将外周神经干细胞(NP)以0.5～3.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm，无动物源性，代替鼠源性的Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞(iPN)进行分析，检测其纯度和产量。
(4)iPSC的iPN制备—更大规模制备摸索
将NP以0.5×104个/cm2和3.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的、表面面积各异的细胞培养器皿，以pNiM-02AF进行培养，10～12天后移除培养基，检测iPN纯度和产量，对表面面积(大小)各异的培养器皿生产iPN的能力进行测试。
实施例1iPSC的培养
将iPSC以1.0～2.5×104个/cm2的密度(实施例接种密度：1.5×104个/cm2)接种在经过玻连蛋白(Vc)处理的细胞培养器皿(实施例培养皿：6孔板)，使用E8进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)，每隔24小时更换培养基，3～4天后、iPSC融合度达到60～80％时以EDTA(0.5mM)对iPSC进行处理(EDTA处理时间范围：3～8分钟，实施例处理时间：5分钟)，收集iPSC后进行传代，传代时同样以1.0～2.5×104个/cm2的密度(实施例接种密度：1.5×104个/cm2)的密度接种在经过Vc处理的细胞培养皿。
实施例2iPSC的NP分化
将iPSC以1.0～4.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的细胞培养器皿(实施例最佳接种密度：2.0×104个/cm2)，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01(pNiM-01AF)进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)，pNiM-01AF的配方见表1，在序号为1的DMEM/F12基础培养基中添加序号2～23的组分，在培养8～10天后以胰酶替代物对iPSC分化后得到的NP进行收集。
表1无动物源性外周神经诱导培养基-01(pNiM-01AF)
Figure BDA0003124728960000081
Figure BDA0003124728960000091
**：Y27632在培养的首36～48小时加入。
其中，LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、Y27632为潜在候选药物的代号。
实施例3外周神经干细胞(NP)进一步分化为外周神经元细胞(iPN)
将NP以0.5～3.0×104个/cm2的密度接种在经过重组层粘连蛋白(Lm，无动物源性，代替鼠源性的Matrigel等物料)处理的细胞培养器皿，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)进行培养(实施例用量：6孔板每孔2mL)。
pNiM-02AF的最终配方经过对比试验确定，首先设计了“无动物源性外周神经诱导培养基-02”(pNiM-02AF)，pNiM-02AF的配方见表3，在序号为1的神经元培养基中添加序号2～21的组分。再和现有工艺中含动物源性成分的培养基(Control)进行对比，含动物源性成分的培养基(Control)的配方见表2，在序号为1的DMEM/F12基础培养基中添加序号2～8的组分。
表2现有含动物源性成分外周神经诱导培养基(Control)
序号 成分 浓度范围
1 DMEM/F12 /
2 B27(50x)* 0.5～1.0x，即0.5～1％(体积比)
3 胰岛素 0.05～5μg/mL
4 全铁转铁蛋白 1～50μg/mL
5 黄体酮 0.5～5ng/mL
6 腐胺 2～100μg/mL
7 脑源性神经营养因子 0.5～50ng/mL
8 神经生长因子 0.5～50ng/mL
*：B27为动物源性。
表3无动物源性外周神经诱导培养基-02(pNiM-02AF)
Figure BDA0003124728960000101
*：仅在培养第1天加入。
**：仅在培养第1～3天加入。
其中，GlutaMAX是生产商的一个产品名称，为谷氨酰胺的替代物，功能上等同于谷氨酰胺，因为高浓度的谷氨酰胺长期培养可产生细胞毒性。Y27632为潜在候选药物的代号。
为验证2种配方诱导NP分化为iPN的效力，按照下列表4接种NP并以表2～3所示的外周神经诱导培养基进行为期10～12天的分化培养，期间每36～48小时更换培养基，完成后统计iPN的纯度。
表4外周神经干细胞接种密度及各个培养基配方的外周神经元细胞分化结果
Figure BDA0003124728960000111
注：iPN纯度通过统计外周神经元细胞标志物Peripherin的阳性百分比计算。
※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104，P≤0.05，有统计学意义。
※※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104和1.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
※※※：使用同种培养基，对比接种密度0.5×104、1.0×104和2.0×104，P≤0.05，有统计学意义。
§：在相同NP接种密度下，pNiM-02AF对比Control，P≤0.05，有统计学意义。
通过表4数据得到结论，“无动物源性外周神经诱导培养基-02”在0.5×104个/cm2到3.0×104个/cm2的接种密度范围下，均可以分别收获纯度≥90％的iPN，纯度显著高于现有配方(对应图1)。随着接种密度的上升，iPN的产量也成比例上升，可对应不同的应用需求，而使用“无动物源性外周神经诱导培养基-02”的iPN产量批次间差异小于现有培养基配方，并且在NP接种密度为2.0×104和3.0×104的情况下，iPN产量也高于现有配方(对应图2)。基于上述结论，“无动物源性外周神经诱导培养基-02”命名为pNiM-02AF。“pNiM-02AF”的配方是成功制备高纯度iN的必要条件。“pNiM-02AF”完全不含动物源性成分，化学成分明确，而现有技术往往使用B27这个血清替代物，但B27的各个原料浓度是不公开的。本发明的“pNiM-02AF”在每个批次的培养基进行配制时，可对所有原材料进行控制，在培养基的质量控制上有明显优势，可用于临床治疗用iPN的制备。
实施例4大规模iPN制备摸索
鉴于在0.5×104个/cm2到3.0×104个/cm2的NP接种密度范围下，均可以分别收获纯度≥90％的iPN，此部分分别以实施例3摸索的最低接种密度(0.5×104个/cm2)和最大接种密度(3.0×104个/cm2)将NP接种在经过重组层粘连蛋白(Lm)处理的、表面面积各异的细胞培器皿，使用pNiM-02AF进行培养，10～12天后移除培养基，检测iPN纯度和产量，详见表5。
表5不同表面面积培养器皿外周神经元细胞分化结果
Figure BDA0003124728960000121
※：对比0.5×104个/cm2，P≤0.05，有统计学意义。
通过表5数据得到结论，在25和75cm2两种表面面积，使用pNiM-02AF对NP进行10～12的分化，均可收获纯度≥90％的iPN，而随着接种密度的上升，iPN的产量也成比例上升，可对应不同的应用需求(对应图3～4)。
综上，本发明的培养体系以玻连蛋白和重组层粘连蛋白取代基质胶对培养器皿进行处理，首先在培养器皿层面避免了动物源性物料。
使用“pNiM-02AF”，对接种密度为0.5～3.0×104个/cm2，接种在6孔板(每孔表面面积9.5cm2)的NP进行分化，可收获纯度≥90％的iPN，并且iPN的产量也随着接种密度上升而成比例上升，可对应不同的应用需求。
使用“pNiM-02AF”，对接种密度为0.5×104个/cm2和3.0×104个/cm2，接种在25cm2培养皿和75cm2培养皿的NP进行时长为10～12天的分化，结果显示“pNiM-02AF”在较小(25cm2)和较大(75cm2)表面面积的细胞培养器皿，经过10～12天分化均可收获纯度≥90％的iPN。
pNiM-02AF完全避免了动物源性、并且培养基配方化学成分明确，增加了iPN制备过程的可控性，适合临床治疗在内的各类iPN的制备，也可用于临床治疗以外的应用，例如药物研发和药物安全性验证。
综合以上实施例，本发明相对于现有技术具有明显的优势和进步：
(1)iPSC分化为外周神经元细胞工艺的优化
本发明通过使用“pNiM-02AF”培养基配方以及相对应的培养方法，不但可制备高纯度iPN，更显著提升了绝对产量和缩小了批次间产量的差异，有利工业化生产。
(2)培养基配方“pNiM-02AF”化学成分明确
一些现有iPN制备法使用血清或化学成分不明确的添加物，但本发明的培养基配方“pNiM-02AF”所有化学成分明确，在每个批次的培养基进行配制时，可对所有原材料进行控制，在培养基的质量控制上有明显优势。
(3)工艺整体无动物源性
一些现有iPN制备法使用牛源性血清、鼠源细胞分泌物(Matrigel)等，引入动物源性致病因子污染风险，本发明的方法可做到全流程无动物源性，相当程度上避免了动物源性致病因子污染风险。
(4)可在较大培养器皿实施iPN制备
经验证，本发明方案的适用范围涵盖从较小(25cm2)至较大(75cm2)表面面积的细胞培养器皿，加大了每个批次的iPN产量，有利工业化生产，这是本发明的重要进步，因为目前现有技术中并无大体积量制备外周神经干细胞且能达到很高纯度和产量的先例。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1：诱导多能干细胞的培养；
包括原代培养和传代培养，所述原代培养和所述传代培养中所用的细胞培养器皿均经过玻连蛋白处理；
S2：诱导多能干细胞分化为外周神经干细胞；
将诱导多能干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-01进行培养，更换培养基，培养8～10天，以胰酶替代物对诱导多能干细胞分化后得到的外周神经干细胞进行处理，收集外周神经干细胞。
S3：外周神经干细胞进一步分化为外周神经元细胞；
将外周神经干细胞接种在经过重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿中，使用无动物源性外周神经诱导培养基-02进行培养，每隔24～36小时更换培养基，在培养10～12天后对外周神经元细胞进行分析，检测其纯度和产量。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S1中所述原代培养和/或所述传代培养中诱导多能干细胞的接种密度为1.0～2.5×104个/cm2，优选为1.5×104个/cm2。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述诱导多能干细胞的接种密度为1.0～4.0×104个/cm2，优选为2.0×104个/cm2。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述外周神经干细胞的接种密度为0.5～3.0×104个/cm2，优选为3.0×104个/cm2。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中所述无动物源性外周神经诱导培养基-01包括以下成分：DMEM/F12培养基、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、LDN193189、SB431542、CHIR99021、RO4902097、SU5402、全反式维生素A酸、Y27632。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S3中所述无动物源性外周神经诱导培养基-02包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。
7.一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的无动物源性外周神经诱导培养基，其特征在于，包括以下成分：神经元培养基、GlutaMAX、非必需氨基酸、胰岛素、全铁转铁蛋白、腐胺、人血白蛋白、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、黄体酮、视网醇、维生素A、dl-α-生育酚乙酸酯、维生素E、亚油酸、α-亚麻酸、硫辛酸、脑源性神经营养因子、神经生长因子、Y27632、5-氟-2’-脱氧尿苷。
8.根据权利要求7所述的培养基，其特征在于，所述GlutaMAX的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述非必需氨基酸的含量为0.1～5％，所述含量为体积比；所述胰岛素的浓度为0.1～10μg/mL；所述全铁转铁蛋白的浓度为2～100μg/mL；所述腐胺的浓度为5～200μg/mL；所述人血白蛋白的浓度为250～2500μg/mL；所述超氧化物歧化酶的浓度为1～10μg/mL；所述谷胱甘肽的浓度为0.1～10μg/mL；所述黄体酮的浓度为1～10ng/mL；所述视网醇的浓度为0.01～2μg/mL；所述维生素A的浓度为0.01～2μg/mL；所述dl-α-生育酚乙酸酯的浓度为0.1～10μg/mL；所述维生素E的浓度为0.1～10μg/mL；所述亚油酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述α-亚麻酸的浓度为0.1～10μg/mL；所述硫辛酸的浓度为1～10ng/mL；所述脑源性神经营养因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述神经生长因子的浓度为0.5～50ng/mL；所述Y27632的浓度为0.5～25μg/mL；所述5-氟-2’-脱氧尿苷的浓度为0.5～25μg/mL。
9.一种促使诱导多能干细胞分化为外周神经元细胞的系统，其特征在于，包括以下组分：
(1)玻连蛋白处理的细胞培养器皿；
(2)重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿；
(3)权利要求5所述的无动物源性外周神经诱导培养基-01；
(4)权利要求7～8任一项所述的无动物源性外周神经诱导培养基。
10.根据权利要求9所述的系统，其特征在于，所述重组层粘连蛋白处理的细胞培养器皿的表面面积为25～75cm2。
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