CN110431149A - 肽化合物用于促进存活、生长和细胞分化的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的用途。

Description

肽化合物用于促进存活、生长和细胞分化的用途
本发明涉及肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的用途。
由于预期寿命的延长，神经系统紊乱和神经退行性疾病在西方国家构成了越来越多的社会经济影响，超过任何其他疾病。已经开发了多种药理学方法来治疗这些疾病，但是几乎没有取得成功，并且继续积极寻求新的治疗方法。在这方面，最近关于干细胞的研究提出了许多希望。特别是，干细胞特别有吸引力，因为它们有两个有趣的能力：
·自我更新的能力，这意味着它们能够相同地增殖以获得大量细胞，并且
·分化的能力，这意味着它们能够提供成熟的成体细胞，准备好以确保特定的功能，特别是神经元。
因此，干细胞可用于修复中枢神经系统的损伤。然而，干细胞是少有的，并且基于这些细胞的临床方法的开发需要能够根据治疗实践进行扩增和/或分化的新方案。
已经开发了一些方法来使用优化的培养基和/或使用添加剂化合物如生长因子来增殖和分化干细胞。还使用血小板反应蛋白(一种细胞外糖蛋白家族)的特性开发了一些方法。这些糖蛋白参与发育过程中表型的调控和参与多种细胞功能，例如细胞-细胞接触、细胞粘附或细胞间或细胞与其环境之间的通讯。
在本发明的上下文中，本发明提供了特定肽化合物的用途，所述肽化合物的序列衍生自存在于SCO-海绵蛋白(spondin)中的TSR模式(血小板反应蛋白1型重复)的部分，SCO-海绵蛋白是在所有脊椎动物中发现的中枢神经系统的特定的糖蛋白。该糖蛋白是由哺乳动物中的连合下器(SCO)分泌的细胞外基质的分子。SCO-海绵蛋白是超过4,500个氨基酸的大蛋白质，具有包含多种保守模式、特别是哺乳动物中的26种TSR模式的多模块组织。
基于保守氨基酸半胱氨酸、色氨酸和精氨酸的比对，TSR模式是约55个残基的蛋白质结构域。这些模式首先在血小板反应蛋白1(TSP-1)中得到鉴定，TSP-1是一种参与凝血的分子。然后，它们已在具有多种生物学功能例如细胞附着、迁移、增殖、细胞聚集、蛋白酶的调控或对血管生成的抑制的许多分子中被发现。
特别地，已经显示衍生自SCO-海绵蛋白的TSR模式的某些肽在神经细胞上表现出生物学活性(WO 99/03890)，并且这些肽通过特定的受体作用于神经细胞(Bambad M.等人，Cell&Tissue Research，vol.315,15-25(2004))。还显示这些肽促进神经炎延伸的萌芽(WO2008/090285)。
然而，需要能够扩增和/或分化干细胞以获得特定类型的细胞(例如神经元)的方法。
本发明的目的是提供用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的肽化合物和方法。
在第一方面，本发明涉及至少一种肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的体外或离体用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：1)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G、V、A、S或Abu，
X3是S、D或A，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接。
本发明基于发明人意外的观察，即这些肽化合物可以刺激祖细胞或干细胞的存活、生长和分化。
本文所用的表述“肽化合物”是指肽、寡肽、多肽和蛋白质。该术语也不排除肽的表达后修饰。例如，术语“肽化合物”涵盖包含二硫键或糖基、乙酰基、脂基等的共价连接的肽。
形成本发明肽化合物的氨基酸能够为天然或非天然氨基酸。
表述“天然氨基酸”是指在天然蛋白质中发现的L-型氨基酸，即：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、酸天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、甲硫氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。
表述“非天然氨基酸”是指天然氨基酸的D-型，某些天然氨基酸(如精氨酸、赖氨酸、苯丙氨酸和丝氨酸)的同型，以及亮氨酸和缬氨酸的正型。它还包括合成氨基酸，例如α-氨基丁酸(Abu)、胍丁胺(Agm)、α-氨基异丁酸(alpha-arinoisobutyrique acid)(Aib)、N-甲酰基-Trp(F-trp)、肌氨酸、抑胃酶氨酸(statine)、鸟氨酸、脱氨基酪氨酸。脱氨基酪氨酸掺入在这些肽的N-末端，而胍丁胺和他汀掺入在这些肽的C-末端。
在实施方案中，本发明涉及至少一种肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的体外或离体用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：1)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G、V、A、S或Abu，
X3是S、D或A，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接，
某些特定的氨基酸能够被其衍生物或类似物代替，
所述肽化合物能够通过酰胺化，通过酰化，通过PEG化，通过在N-末端和/或在C-末端添加氨基酸，通过改变主要肽或通过任何缀合方法，特别是用白蛋白或聚合物如PEG，或者使用凝胶或水凝胶的组合来修饰，
所述肽能够环化。
在实施方案中，本发明涉及至少一种肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的体外或离体用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：1)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G、V、A或S，
X3是S、D或A，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接。
本发明的肽化合物能够以不同方式获得：通过化学合成，通过基于重组技术和包含编码肽化合物的序列或片段DNA的遗传构建体的其他方法。如果需要，根据本发明的寡肽能够为去糖基化的或糖基化的形式。在某些情况下，并且取决于制备方法，可能需要使寡肽的某些三级结构复性。
在本发明中，“干细胞”是基于两个功能特性定义的：
-看似无限的自我更新能力，和
-产生多种成熟神经细胞类型的能力。
干细胞可以是全能的(产生生物体中所有分化的细胞的能力)、多能的(产生三个胚层中所有细胞的能力：内胚层、中胚层和外胚层)或专能的(分化成多个但有限的细胞类型能力)。
在本发明中，“祖细胞”是干细胞的早期后代。祖细胞是增殖细胞，具有有限的自我更新能力，并且它们通常是单能的。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：2)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G，
X3是S，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
W-S-G-W-S-S-[C/Abu]-S-R-S(SEQ ID NO：3)。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的肽化合物的用途，所述肽化合物与SEQ IDNO：3具有至少90％的同一性。
确定氨基酸“序列同一性”的技术是本领域熟知的。通常，此类技术包括确定由基因编码的氨基酸序列，并将该序列与第二氨基酸序列进行比较。通常，“同一性”指分别地两个多肽序列的精确的氨基酸与氨基酸的对应关系。通过确定它们的“百分比同一性”能够比较两个或更多个序列。两个氨基酸序列的同一性百分比是两个比对序列之间的精确匹配数除以较短序列的长度并乘以100。许多软件适合于计算序列之间的同一性百分比。例如，可以使用BLAST软件，以默认参数(遗传密码＝标准；过滤器＝无；链＝两条；截断值＝60；预期＝10；Matrix BLOSUM62；描述＝50个序列；通过HIGH SCORE排序；数据库＝非冗余，GenBank+EMBL+DDBJ+PDB+GenBank CDS翻译+Swiss protein+Spupdate+PIR)。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S(SEQ ID NO：4)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：5)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：8)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：9)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-Abu-Cs-G(SEQ ID NO：10)，
W-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：11)，
W-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：12)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-K-iPr-S-Cs-G(SEQ ID NO：13)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S(SEQ ID NO：14)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：16)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：17)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：18)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：19)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：20)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S(SEQ ID NO：21)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：22)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：23)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：24)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：25)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：26)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-R-Abu-Cs-G(SEQ ID NO：27)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：28)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：29)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-K-iPr-S-Cs-G(SEQ ID NO：30)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S(SEQ ID NO：31)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：32)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：33)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：34)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：35)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：36)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：37)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接，
所述肽化合物优选选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接。
SEQ ID NO：6对应于称为NX210的肽的序列。
SEQ ID NO：7对应于称为NX218的肽的序列。
SEQ ID NO：15对应于称为NS640的肽的序列。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞和所述干细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述干细胞是间充质干细胞或胚胎干细胞，优选间充质干细胞。
在本发明中，表述“胚胎干细胞”是指衍生自胚泡的内细胞团的干细胞。
胚胎干细胞(ESC)是全能的，这意味着它们能够分化形成生物体的所有细胞类型。
在优选的实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述干细胞是人胚胎干细胞(hESC)系。
在优选的实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述干细胞是人胚胎干细胞(hESC)系，其最初不是通过涉及破坏人胚胎的方法获得的。
在本发明中，表述“间充质干细胞”(MSC)是指存在于多种组织中的成体干细胞。
间充质干细胞(MSC)是组织或“成体”干细胞的实例。它们是专能的，这意味着它们能够产生机体的一种以上类型的特化细胞，但不是所有类型。它们能够分化成中胚层谱系(骨形成、脂肪形成、软骨形成)，但也能分化成非中胚层衍生物(例如神经细胞)。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述间充质干细胞已经从骨髓、脐带血、脂肪组织、牙髓或肌肉获得。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物用于促进祖细胞或干细胞、优选间充质干细胞向神经细胞的分化。
在本发明中，表述“神经细胞”是指衍生自神经干细胞的细胞。神经细胞主要对应于神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞。
通过干细胞或通过祖细胞表达神经标志物能够评估向神经细胞的分化。
例如，神经标志物包括但不限于：
-GFAP(胶质纤维星形胶质细胞蛋白)：一种由神经胶质细胞和星形胶质细胞表达的蛋白质，
-Musashi 1：一种结合RNA并存在于祖细胞中的蛋白质，
-巢蛋白：一种可以在神经祖细胞的中间丝中发现的蛋白质，
-βIII-微管蛋白：一种在分化中期阶段的神经细胞的微管中发现的蛋白质，
-MAP-2(微管相关蛋白)：一种在成熟神经细胞的神经突或树突中的微管中发现的蛋白质。
向神经细胞的分化也能够通过神经突萌芽来评估，这意味着神经元的延伸(轴突或树突延伸)。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物用于促进祖细胞或干细胞、优选间充质干细胞或神经干细胞的存活。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物用于促进祖细胞或干细胞、优选间充质干细胞的生长。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物促进间充质干细胞向神经细胞的分化的用途，所述肽化合物选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有所述肽化合物的培养系统中生长。
在本发明中，表述“培养系统”能够指多种培养材料，例如培养基、基质、载体或培养瓶。特别地，培养系统还能够指培养材料的组合，例如含有培养基的培养瓶。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在0.02μg/ml至20μg/ml或1至1000μg/cm2、优选0.2μg/ml至2μg/ml或10至500μg/cm2的肽化合物存在下在培养系统中生长。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、15或20μg/ml存在下在培养系统中生长。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在1、2、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000μg/cm2的肽化合物存在下在培养系统中生长。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有至少一种生长因子，优选选自包含以下的组：bFGF、LIF、激活素A、TGF、Wnt、Oct-4、Sox-2、BMP-4、Nanog、Shh、PDGF、视黄酸、EGF、IGF1、IGF2、HGF、VEGF、胰岛素和转铁蛋白。
在实施方案中，所述祖细胞或干细胞在含有肽化合物并含有0.01ng/ml至1000ng/ml、优选1ng/ml至100ng/ml、更优选1ng/ml至10ng/ml的至少一种生长因子的培养基中生长。
在实施方案中，所述祖细胞或干细胞在含有肽化合物并含有0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200、500或1000ng/ml的至少一种生长因子的培养基中生长。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有0至20％、优选2％至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有bFGF和胎牛血清，
优选在培养基中含有：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物对应于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：15，并且间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有bFGF和胎牛血清，
优选在培养基中含有：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物对应于SEQ ID NO：6，并且间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基进一步含有bFGF和胎牛血清，
优选在培养基中含有：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物对应于SEQ ID NO：7，并且间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基进一步含有bFGF和胎牛血清，
优选在培养基中含有：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物对应于SEQ ID NO：15，并且间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基进一步含有bFGF和胎牛血清，
优选在培养基中含有：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有肽化合物的载体上生长，所述肽化合物优选包被在该载体上。
另一方面，本发明还涉及用于促进祖细胞或干细胞存活和/或生长和/或分化的方法，包括在如上定义的至少一种肽化合物存在下培养所述祖细胞或所述干细胞的步骤。
另一方面，本发明还涉及试剂盒，包含：
-如上定义的至少一种肽化合物
-适合祖细胞和/或干细胞生长的培养系统，
-并且可能包含祖细胞和/或干细胞。
本发明的试剂盒能够用于测试产品对干细胞的治疗功效。
在实施方案中，本发明涉及含有一种以上肽化合物的如上定义的试剂盒。
例如，本发明的试剂盒能够含有2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多种不同肽化合物的混合物。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的试剂盒，其进一步包含经处理或未经处理的多孔板，以使得细胞能够贴壁。
在实施方案中，本发明涉及如上定义的试剂盒，其中所述培养基包含明胶和/或生长因子，例如bFGF、LIF、激活素A、TGF、Wnt、Oct-4、Sox-2、BMP-4、Nanog、Shh、PDGF、视黄酸、EGF、IGF1、IGF2、HGF、VEGF、胰岛素和转铁蛋白。
通过所附附图和实施例来示例说明本发明。这些实施例不是对本发明的限制。
附图说明
图1.巢蛋白在明胶上培养7天并用0.5mg/ml NX210肽处理的ESC中的表达。与具有少量巢蛋白+细胞(白色箭头)的NX210处理的培养物(B)相比，对照未处理的培养物(A)显示更多数量的巢蛋白+细胞(最亮点，白色箭头)。
图2.MAP2在0.5mg/ml NX210肽存在下5天后的ESC中的表达。与未观察到表达MAP2的细胞的对照培养物相比，仅在NX210存在下观察到MAP2+细胞(白色箭头)。
图3.与未处理的条件(A)相比，处理的培养物(B)中巢蛋白的表达显示更多的神经元前体细胞(白色箭头)。
图4.细胞增殖取决于培养条件。
图5.对在bFGF和ATRA存在下生长的来自患者n°1的hMSC进行的基因表达分析。
图6.对在没有ATRA的bFGF 10％存在下生长的来自患者n°1的hMSC进行的基因表达分析。
图7.对在没有ATRA的bFGF 10％存在下生长的来自患者n°2的hMSC进行的基因表达分析。
图8.在不同条件下培养12天后，hMSC的免疫细胞化学分析。
图9.MAP-2和巢蛋白免疫标记的荧光强度。
实施例
实施例1：早期分化
材料和方法
将129S v/J胚胎干细胞(ESC)以0.7×106个细胞的浓度接种在35mm直径的培养皿中，所述培养皿覆盖有明胶底物。
使用的培养基是补充了N2补充剂的Glasgow’s最低必需培养基(G-MEM)。
为了使ESC能够分化为神经上皮祖细胞，培养基去除了LIF(白血病抑制因子)，因为LIF是ESC自我更新的关键因素。
多种测试在不存在血清的情况下进行，因为血清限制了特异性定向分化的可能性，并且它可以隐藏或至少减少本发明的肽化合物的作用。
ESC在第1、3和5天加入0.5mg/ml NX210(SEQ ID NO：6)的如上定义的培养基中生长。
然后，培养7天后，用4％多聚甲醛固定培养物。
为了分析ESC向神经上皮祖细胞和向分化的神经元的分化，通过免疫细胞化学显示多种细胞类型：
-使用抗巢蛋白的一抗(巢蛋白＝中间丝蛋白)，对神经上皮祖细胞具有特异性，和
-使用抗MAP2的一抗(MAP2＝微管相关蛋白2)，对树突是特异性的，并因此对分化的神经元是特异性的。
通过使用双苯甲亚胺/Hoechst 33342标记细胞核来测量细胞总数，所述双苯甲酰亚胺/Hoechst 33342是一种对DNA具有亲和力的荧光染料，其通常用于将细胞核着色为蓝色。
结果
培养7天后，观察到与在没有NX210(SEQ ID NO：6)的培养物中表达巢蛋白的ESC群体相比，在存在NX210(SEQ ID NO：6)的培养物中表达巢蛋白的ESC群体减少(图1)。
实际上，在没有NX210(SEQ ID NO：6)的情况下，观察到一些表达巢蛋白的细胞(神经上皮祖细胞的特征)但没有表达MAP2蛋白的细胞(这意味着没有分化的神经元)，而在存在NX210的情况下，观察到一些表达MAP2蛋白的细胞(图2)。
因此，在NX210(SEQ ID NO：6)存在下，分化已迅速达到更高级阶段。
这些结果证明NX210(SEQ ID NO：6)在动力学方面诱导ESC向神经元分化途径的优先定向。
实施例2：神经上皮祖细胞的选择
材料和方法
对于这些实验，根据改编自Okabe等人的方案(Mechanisms of Development，59:89-102,1996)，ESC的分化优选定向于神经元分化途径。
简言之，将ESC在没有LIF的明胶上生长两天以开始分化。仔细地将细胞胰蛋白酶消化以收集小的ESC聚集体。然后，将这些聚集体转移到没有任何包被的培养皿上，以产生不贴壁的球形细胞体，即胚状体(EB)。
培养5天后，将EB转移到覆盖有明胶的新培养皿上以使细胞贴壁。
培养24小时后，用不含血清的培养基替换含有10％胎牛血清的培养基以选择神经上皮祖细胞，并在培养基中加入浓度为0.5mg/ml的肽NX210(SEQ ID NO：6)。
培养6天后，实现表达巢蛋白(对神经上皮祖细胞具有特异性的细胞骨架蛋白)的细胞的最大含量。
然后对针对神经上皮祖细胞富集的细胞群进行胰蛋白酶消化，并以1×105个细胞/cm2的浓度接种在由聚鸟氨酸和层粘连蛋白混合物构成的基质上。
在FGF2(成纤维细胞生长因子2)存在下培养2天以产生前体库后，固定并处理细胞，然后进行巢蛋白免疫染色。
结果
与未处理的培养物相比，在用NX210(SEQ ID NO：6)处理的培养物中观察到更多表达巢蛋白的细胞(图3)。
在NX210(SEQ ID NO：210)存在下产生分化标记物如巢蛋白表明ESC加速分化至神经元途径。
因此，在选择神经上皮祖细胞期间，NX210促进对FGF2导致的特异性刺激的更有效应答。
实施例3：人间充质干细胞的神经分化
材料和方法
从Lonza获得Ficoll提取自两个供体的成人骨髓单核细胞。细胞每周传代一次。通过塑料贴壁选择人间充质干细胞(hMSC)并通过在补充有10％胎牛血清(FBS，PAALaboratoires)和0.1％青霉素/链霉素(P/S，Lonza)的改良Eagle培养基α(MEMα，MacoPharma)中铺板50000个细胞/cm2进行扩增。3天后更换培养基，然后每天更换。在37℃，潮湿环境和5％CO2下培养2至5周后，通过胰蛋白酶消化收获hMSC。通过FACS分析(BDBioscience，BD LSR II)确认表型，其具有CD73、CD90和CD105(阳性)，以及CD34和CD45(阴性)(表1)。
表1.从两个供体获得的hMSC的免疫表型分析。
细胞表面标志物 患者n°1 患者n°2
CD105 42.5％ 40.4％
CD73 57.9％ 86.8％
CD90 58.3％ 87.0％
CD34 2.8％ 11.5％
CD45 12.8％ 41.6％
在两名患者中观察到的差异是标准的个体间差异。
此外，细胞的自我更新能力通过集落形成单位-成纤维细胞测定法(CFU-F)确认。对于该测定法，将hMSC以两种不同的密度接种在具有上述完全培养基的25cm2培养瓶中：20,000个细胞/cm2和60,000个细胞/cm2。7天和10天后，计数具有超过50个细胞(大集落)、少于25个细胞(小集落)和25-50个细胞(中等大小集落)的CFU-F集落数。
表2.CFU-F测定法的结果。
从D7到D10，来自患者n°2的样品比来自患者1的样品形成针对每种类型的集落(小、中和大)的更高数量的CFU-F。在D10，对于患者n°2的CFU-F的总数更大，表明更好的增殖能力。CFU-F的平均计数＝平均超过2至3计数的测量值。P1＝患者n°1。P2＝患者n°2。
为了研究肽的神经分化能力，用浓度为80μg/cm2的NX210或NS640的无菌水溶液包被25cm2培养瓶和12孔培养板。在细胞铺板之前，在37℃和5％CO2下包被过夜。
在第0天(D0)，将hMSC以3000个细胞/cm2的浓度接种在预先包被的25cm2培养瓶或12孔培养板中的完全培养基中，并将培养物置于37℃，潮湿环境和5％CO2下。24小时后，更换培养基并用不同组合的培养基替换，所述不同组合的培养基含有：MEMα-bFGF 12.5ng/mL-FBS 2％-P/S 0.1％；MEMα-bFGF 12.5ng/mL-FBS 10％-P/S 0.1％；MEMα-FBS 2％-P/S0.1％(对照条件)；MEMα-FBS 10％-P/S 0.1％(对照条件)。将细胞置于37℃、潮湿环境和5％CO2下，每周更换培养基两次。在第8天，培养基被含有ATRA代替bFGF的培养基替换，并因此更换为：MEMα–ATRA 20μM-FBS 2％-P/S 0.1％；MEMα–ATRA 20μM-FBS 10％-P/S 0.1％；MEMα-FBS 2％-P/S0.1％(对照条件)；MEMα-FBS 10％-P/S 0.1％(对照条件)。将细胞置于37℃、潮湿环境和5％CO2下。培养基每周更换两次。在第15天(D15)，通过胰蛋白酶消化收获细胞用于mRNA提取或固定的免疫细胞化学分析。
在不同时间点(DO、D1、D8和D15)提取mRNA后通过基因表达进行分化评估，并在培养期结束时(D15)进行免疫细胞化学分析。
使用标准方案对固定在4％多聚甲醛中的细胞进行免疫细胞化学分析。在30分钟内用Triton 1X 0.1％/BSA 5％封闭后，将细胞与针对巢蛋白的抗体(Millipore)或针对MAP-2的抗体(Sigma)的抗体在+4℃孵育过夜。洗涤后，加入适当的FITC或Cyandidine-5标记的二抗。细胞核用Hoescht 33258(Sigma)复染。使用Leica TCS LSI系统进行观察。
使用RNAeasy总纯化试剂盒按照制造商(Qiagen)的说明提取总RNA。如制造商所述，使用High-Capacity cDNA Reverse Transcription试剂盒(Applied Biosystems)产生cDNA。
使用TaqMan gene Expression Master Mix(Applied Biosystems)在AppliedBiosystems 7900Real time PCR系统(Life technologies)上通过实时PCR分析基因(GFAP、Musashi 1、巢蛋白、β3-微管蛋白、MAP-2和GAPDH)的表达水平。一式三份分析样品。使用GAPDH基因作为内部对照标准化数据，并根据等式2-ΔCt确定样品中基因的相对定量(RQ)。
结果
尽管患者间存在变异，但与2％FBS相比，存在10％FBS时MSC的数量增加。无论FBS浓度如何，bFGF对细胞增殖都有积极作用。此外，ATRA(来自J5)的添加导致在2％FBS存在下的微小差异和在10％FBS存在下MSC数量的减少(图4)。无论测试条件如何，NX210或NS640对增殖均无影响。
所测试的方案似乎不利于神经胶质细胞途径中MSC的分化。因此，GFAP的表达随后未定量。
在2％FBS存在下，bFGF和随后ATRA(来自J5)的顺序分化导致与对照条件相比，巢蛋白(x6.7对比x1.8)、βIII-微管蛋白(x22对x9.2)和MAP-2(x9.9对比x3.5)的基因表达增加。NX210或NS640不会修改此增加。在存在10％FBS的情况下，表达的增加不太明显。NX210和NS640具有通过增加MAP-2和巢蛋白表达观察到的中等效果(分别为x1.21和1.46对比x0.75，x2和1.5对比x1.2)(图5)。
对于来自患者n°1的细胞，在bFGF存在下的培养导致Musashi-1和巢蛋白表达的降低以及βIII微管蛋白和MAP-2的表达的增加(分别对于J0为x9.3和x2.3)。在第5天，NX210和NX640的存在与单独的bFGF相比，导致巢蛋白表达的增加(在没有NX210或NX640处理的bFGF条件下x2对比x0.6)(图6)。
与患者n°1相似，在bFGF存在下培养来自患者n°2的hMSC导致Musashi-1和巢蛋白表达的减少，并且βIII微管蛋白和MAP-2的表达增加(分别对于J0为x9.3和x2.3)。NX210的存在导致与单独bFGF相比，巢蛋白表达的增加(在没有包被的bFGF条件下为x1.95对比x0.6)。此外，在培养5天后，在NX210或NX640存在下，βIII-微管蛋白也最大化。尽管在单独使用bFGF的条件下MAP-2表达降低，但在NX210存在下该基因的表达在D5增加(图7)。
Musashi-1、巢蛋白、βIII-微管蛋白和MAP-2的基因表达结果总结在表3中。
表3.基因表达的诱导。
P1＝患者n°1。P2＝患者n°2。
在2％FBS存在下添加bFGF增加了巢蛋白和MAP-2标记物的表达。在这种情况下，当存在NX210或NS640时，免疫细胞化学分析显示更强的染色。在10％FBS条件下，与对照条件相比，bFGF增加巢蛋白表达，并且这种增加在用NX210或NX640时最大化(染色强度增加)。只有NX210和NX640的存在才能观察到MAP-2蛋白的存在(图8)。
根据培养条件观察对应于巢蛋白或MAP-2的表达的染色强度的等级(图9)。
序列表
<110> 埃克斯欧力提斯药物公司
<120> 肽化合物用于促进存活、生长和细胞分化的用途
<130> WOB 16 BO NEU STEM
<160> 37
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为W或L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> X为G, V, A, S或Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> X为S, D或A
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为C或Abu，其中半胱氨酸残基可以通过二硫键连接至9位的X的半胱氨酸残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> X为R-S, R-S-Nm, R-S-C-G, R-Abu-Nm, R-Abu-C-G, K-iPr-S-Nm或
K-iPr-S-C-G，其中半胱氨酸残基可以通过二硫键连接至7位的X的半胱氨酸残基
<400> 1
Xaa Ser Xaa Trp Ser Xaa Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 2
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> X为W或L-Nal2
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (3)..(3)
<223> X为G
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> X为S
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> X为C或Abu，其中半胱氨酸残基可以通过二硫键连接至9位的X的半胱氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (9)..(9)
<223> X为R-S, R-S-Nm, R-S-C-G, R-Abu-Nm, R-Abu-C-G, K-iPr-S-Nm或
K-iPr-S-C-G，其中半胱氨酸残基可以通过二硫键连接至7位的X的半胱氨酸残基
<400> 2
Xaa Ser Xaa Trp Ser Xaa Xaa Ser Xaa
1 5
<210> 3
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为C或Abu
<400> 3
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 4
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<400> 4
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 5
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 5
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 6
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<400> 6
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 7
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至11位的半胱氨酸残基
<220>
<221> DISULFID
<222> (11)..(11)
<223> 11位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 7
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 8
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu，OOH末端已被NH2末端替换
<400> 8
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa
1 5 10
<210> 9
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<400> 9
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 10
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至11位的半胱氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<220>
<221> DISULFID
<222> (11)..(11)
<223> 11位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 10
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 11
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 11
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser
1 5 10
<210> 12
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<400> 12
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至12位的半胱氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> DISULFID
<222> (12)..(12)
<223> 12位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 13
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 14
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<400> 14
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 15
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 15
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 16
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<400> 16
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu，COOH末端已被NH2末端替换
<400> 17
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Xaa
1 5 10
<210> 18
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<400> 18
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 19
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 19
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Lys Xaa Ser
1 5 10
<210> 20
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<400> 20
Trp Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 21
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<400> 21
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 22
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 22
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 23
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<400> 23
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 24
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至11位的半胱氨酸残基
<220>
<221> DISULFID
<222> (11)..(11)
<223> 11位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 24
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 25
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu，COOH末端已被NH2末端替换
<400> 25
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa
1 5 10
<210> 26
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<400> 26
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 27
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至11位的半胱氨酸残基
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<220>
<221> DISULFID
<222> (11)..(11)
<223> 11位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 27
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 28
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 28
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser
1 5 10
<210> 29
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<400> 29
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 30
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> DISULFID
<222> (7)..(7)
<223> 7位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至12位的半胱氨酸残基
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> DISULFID
<222> (12)..(12)
<223> 12位的半胱氨酸残基通过二硫键连接至7位的半胱氨酸残基
<400> 30
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Cys Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 31
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<400> 31
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 32
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 32
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<400> 33
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Ser Cys Gly
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu，COOH末端已被NH2末端替换
<400> 34
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Xaa
1 5 10
<210> 35
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为Abu
<400> 35
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Arg Xaa Cys Gly
1 5 10
<210> 36
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> COOH末端已被NH2末端替换
<400> 36
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Lys Xaa Ser
1 5 10
<210> 37
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 肽化合物
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1)
<223> X为L-Nal2
<220>
<221> misc_feature
<222> (7)..(7)
<223> X为Abu
<220>
<221> misc_feature
<222> (10)..(10)
<223> X为iPr
<400> 37
Xaa Ser Gly Trp Ser Ser Xaa Ser Lys Xaa Ser Cys Gly
1 5 10

Claims (17)

1.包含以下或由以下组成的至少一种肽化合物用于促进祖细胞或干细胞的存活和/或生长和/或分化的体外或离体用途：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：1)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G、V、A、S或Abu，
X3是S、D或A，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接。
2.根据权利要求1的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
X1-S-X2-W-S-X3-X4-S-X5(SEQ ID NO：2)，
其中：
X1是W或L-Nal2，
X2是G，
X3是S，
X4是C*或Abu，
X5是R-S、R-S-Nm、R-S-C*-G、R-Abu-Nm、R-Abu-C*-G、K-iPr-S-Nm或K-iPr-S-C*-G，
Abu对应于2-氨基丁酸残基，
iPr对应于异丙基-赖氨酸残基，
Nal2对应于2-萘基丙氨酸，
Nm表示COOH末端已被NH2末端代替，
*表示当X4和X5二者均代表或包含半胱氨酸残基时，所述半胱氨酸残基能够通过二硫键连接。
3.根据权利要求1或2的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物包含以下或由以下组成：
W-S-G-W-S-S-[C/Abu]-S-R-S(SEQ ID NO：3)。
4.根据权利要求1至3中任一项的至少一种肽化合物的用途，所述肽化合物选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S(SEQ ID NO：4)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：5)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：8)，
W-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：9)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-Abu-Cs-G(SEQ ID NO：10)，
W-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：11)，
W-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：12)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-K-iPr-S-Cs-G(SEQ ID NO：13)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S(SEQ ID NO：14)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：16)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：17)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：18)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：19)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：20)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S(SEQ ID NO：21)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：22)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：23)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：24)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：25)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：26)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-R-Abu-Cs-G(SEQ ID NO：27)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：28)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-C-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：29)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Cs-S-K-iPr-S-Cs-G(SEQ ID NO：30)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S(SEQ ID NO：31)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：32)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：33)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-Nm(SEQ ID NO：34)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-R-Abu-C-G(SEQ ID NO：35)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-Nm(SEQ ID NO：36)，
L-Nal2-S-G-W-S-S-Abu-S-K-iPr-S-C-G(SEQ ID NO：37)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接，
所述肽化合物优选选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接。
5.根据权利要求1至4中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞和所述干细胞是哺乳动物细胞，优选人细胞。
6.根据权利要求1至5中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述干细胞是间充质干细胞或胚胎干细胞，优选间充质干细胞。
7.根据权利要求1至6中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述间充质干细胞已经从骨髓、脐带血、脂肪组织、牙髓或肌肉获得。
8.根据权利要求1至7中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物用于促进祖细胞或干细胞、优选间充质干细胞向神经细胞的分化。
9.根据权利要求1至8中任一项的至少一种肽化合物的用途，其用于促进间充质干细胞向神经细胞的分化，所述肽化合物选自包含以下的组：
W-S-G-W-S-S-C-S-R-S-C-G(SEQ ID NO：6)，
W-S-G-W-S-S-Cs-S-R-S-Cs-G(SEQ ID NO：7)，
W-S-G-W-S-S-Abu-S-R-S-Nm(SEQ ID NO：15)，
其中s表示半胱氨酸残基通过二硫键连接。
10.根据权利要求1-9中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有所述肽化合物的培养系统中生长。
11.根据权利要求1至10中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有该肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有至少一种生长因子，所述生长因子优选选自包含以下的组：bFGF、LIF、激活素A、TGF、Wnt、Oct-4、Sox-2、BMP-4、Nanog、Shh、PDGF、视黄酸、EGF、IGF1、IGF2、HGF、VEGF、胰岛素和转铁蛋白。
12.根据权利要求1-11中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有该肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有0-20％(v/v)、优选2％至10％(v/v)的胎牛血清。
13.根据权利要求1至12中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中间充质干细胞在含有该肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有bFGF和胎牛血清，
优选在含有以下的培养基中生长：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
14.根据权利要求1-13中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述肽化合物对应于SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：15，并且间充质干细胞在含有肽化合物的培养基中生长，所述培养基还含有bFGF和胎牛血清，
优选在含有以下的培养基中生长：
1至100ng/ml的bFGF，和
1至10％(v/v)的胎牛血清。
15.根据权利要求1-14中任一项的至少一种肽化合物的用途，其中所述祖细胞或所述干细胞在含有该肽化合物的载体上生长，所述肽化合物优选包被在该载体上。
16.用于促进祖细胞或干细胞存活和/或生长和/或分化的方法，其包括在权利要求1至15中任一项所定义的至少一种肽化合物存在下培养所述祖细胞或所述干细胞的步骤。
17.试剂盒，其包含：
-权利要求1-15中任一项所定义的至少一种肽化合物，
-适合祖细胞和/或干细胞生长的培养系统，
-并且可能包含祖细胞和/或干细胞。
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