CN103805566B - 人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法，包括以下步骤：将三维材料在37℃聚胶30分钟；再加入人脂肪间充质干细胞，于37℃，5%CO2培养，隔日更换培养液；所述聚胶溶液为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。本发明利用三维培养技术为神经分化提供一种体内样的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，同时可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性；无化学诱导因子的作用，分化后神经样干细胞可直接用于后续临床试验，更安全。
Description
技术领域
本发明涉及一种诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经样干细胞的方法，具体涉及一种无化学诱导因子的人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化为神经样干细胞的方法。
背景技术
神经样干细胞(neuralstemcell，NSCs)是一类具有分裂潜能和自更新能力的母细胞，它可以通过不对等的分裂方式产生神经组织的各类细胞。长期以来，人们一直认为成年哺乳动物脑内神经细胞不具备更新能力，一旦受损乃至死亡不能再生。这种观点使人们对中枢神经系统疾病的治疗受到了很大限制。虽然传统的药物、手术及康复治疗取得了一定的进展，但是仍不能达到满意的效果。神经样干细胞的发现，解决传统药物治疗固有的缺点，神经样干细胞治疗是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。该疗法就像给机体注入新的活力，是从根本上治疗许多疾病的有效方法。
三维培养指在一定的环境条件下，将细胞种植在三维支架中，构建出具有特定形态和功能细胞的方法。三维球状形态（或者克隆形态）与干细胞特性密切相关，如胚胎干细胞在滋养层上以克隆形态生长，神经样干细胞以神经球的形态生长；克隆形成实验是鉴定干细胞的重要手段，干细胞分化后失去克隆样形态；多项研究也表明三维培养可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性。
目前，三维培养在诱导间充质干细胞向软骨细胞或肝样细胞等分化中有报道。但是，还没有利用三维培养诱导人脂肪间充质干细胞分化为神经样干细胞的相关报道。
发明内容
本发明提供了一种无化学诱导因子的人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法。为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案。
人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法，包括以下步骤：将三维材料在37℃聚胶30分钟；再加入人脂肪间充质干细胞，于37℃，5%CO2培养，隔日更换培养液；所述三维材料为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液。所述三维材料25微升/孔，所述人脂肪间充质干细胞5×105个细胞/孔。
优选地，所述I型胶原溶液的浓度为3mg/mL。
优选地，所述聚乳酸溶液的浓度为2.5mg/mL。
优选地，所述丝素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。
优选地，培养时间为14天。
与现有技术相比，本发明的有益效果显著。
1、本发明无化学诱导因子的人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法，不依赖基因、RNA及蛋白的导入，更易于诱导分化成熟；无化学诱导因子的作用，分化后神经样干细胞可直接用于后续临床试验，更安全；
2、利用三维培养技术为神经分化提供一种体内样的三维立体生长环境，促进了细胞之间的联系，使细胞形成多层生长，同时可以更好地维持干细胞的自我更新和多向分化特性；
3、脂肪来源的干细胞可跨胚层分化为神经样干细胞，无任何伦理问题，细胞增殖能力强。
附图说明
图1为人脂肪间充质干细胞及诱导分化后的神经样干细胞形态图。左图为人脂肪间充质干细胞形态图，中图为诱导分化7天后神经样干细胞形态图，右图为诱导分化14后神经样干细胞形态图。
图2为荧光定量PCR检测基因相对表达水平图。左侧柱形图表示对照人脂肪间充质干细胞的表达水平，中间柱形图表示诱导分化7天后神经样干细胞的相对表达水平，右侧柱形图表示诱导分化14后神经样干细胞的相对表达水平。
具体实施方式
为了更好的理解本发明，下面结合具体实施方式做进一步说明。本领域的公知常识、常用的物质检测、鉴定方法等，因是本领域技术人员所熟知的，本发明未一一赘述。本发明中使用的各种试剂都是市售试剂。
实施例1
（1）获得离体人脂肪来源的间充质干细胞。
取5g脂肪组织，先用无菌的手术剪刀或者小刀剪碎，长度要求不大于3毫米，然后收集于15毫升离心管，加入等体积的磷酸盐缓冲液，剧烈震荡后室温静至5分钟，等分为两层后小心收集上层部分（包含有间充质干细胞、脂肪细胞、磷酸盐缓冲液及红细胞），去掉下层的油脂/脂质，收集的上层部分采用磷酸盐缓冲液洗涤3遍；加入等体积的0.075%的胶原酶I，37℃水浴30分钟；加入等体积的含10%胎牛血清的DMEM终止消化，充分混均后室温静至10分钟分层；去掉上层（脂质/碎片），20℃，280g离心5min收集下层部分（基质血管部分、干细胞、红细胞）；红细胞裂解，采用160mMNH4Cl重悬3分钟，40微米滤膜过滤到含5mLDMEM，10%FBS的管中；20℃，280g离心5min收集细胞，并于1%青霉素/链霉素、10%FBS的DMEM中培养，即获得人脂肪间充质干细胞。
（2）诱导人脂肪间充质干细胞向神经样干细胞的分化。
I型胶原溶液的配制(3mg/mL)：量取30mg的I型胶原，溶于无菌预冷的8mL，0.1MNaOH溶液，于冰上混匀，最后以无菌预冷的dH2O定容为10mL。
三维材料的聚胶:将制备好的3mg/mLI型胶原加入到12孔培养板中，25微升/孔，37℃培养箱中聚胶30分钟，即可得到多孔的已聚胶的I型胶原三维支架。
在已聚胶的I型胶原三维支架上加入混匀的人脂肪间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105个细胞/孔。加入人脂肪间充质干细胞培养液（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日换液。
（3）获得神经样干细胞。于倒置显微镜下观察细胞形态的变化，结果见图1。左图人脂肪间充质干细胞呈纤维状，中图为诱导分化7天后细胞形态图，细胞变圆；右图为诱导分化14后细胞形态图，细胞呈典型的神经样干细胞形态。
实施例2
（1）获得离体人脂肪来源的间充质干细胞：同实施例1。
（2）诱导人脂肪间充质干细胞向神经样干细胞的分化。
三维支架的聚胶:将2.5mg/mL聚乳酸溶液加入到12孔培养板中，25微升/孔，37℃培养箱中聚胶30分钟，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。
在已聚胶的三维支架上加入混匀的人脂肪间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105个细胞/孔。加入人脂肪间充质干细胞培养液（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日更换培养液。
（3）获得神经样干细胞。
实施例3
（1）获得离体人脂肪来源的间充质干细胞：同实施例1。
（2）诱导人脂肪间充质干细胞向神经样干细胞的分化。
三维支架的聚胶:将5mg/mL丝素蛋白溶液加入到12孔培养板中，25微升/孔，37℃培养箱中聚胶30分钟，即可得到多孔的已聚胶的三维支架。
在已聚胶的三维支架上加入混匀的人脂肪间充质干细胞悬液，使细胞密度为5×105个细胞/孔。加入人脂肪间充质干细胞培养液（L-DMEM+10%FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素），置于培养箱中37℃，5%CO2进行培养，隔日换培养液。
（3）获得神经样干细胞。
实施例4
荧光定量聚合酶反应（Realtime-PCR）验证神经样干细胞特异性基因表达。未分化的人脂肪间充质干细胞作为对照组，实施例1三维培养诱导分化7天的人脂肪间充质干细胞作为实验组1，实施例1三维培养诱导分化14天的人脂肪间充质干细胞作为实验组2。
采用Invitrogen公司总RNA提取试剂盒提取细胞总RNA，使用TAKARA公司的反转录试剂盒制备cDNA，使用Promega公司的qPCRMasterMix试剂盒进行Realtime-PCR，以b-Actin作为内参基因，检测神经样干细胞特异性基因Nestin、MaP2的表达。
具体操作步骤如下：
1.总RNA的提取：按照Invitrogen公司总RNA提取试剂盒进行。
2.cDNA合成：按照TAKARA公司cDNA合成说明书进行操作，步骤如下：
（1）反应体系如下：
| total RNA | 10ng-2μg |
| oligo(dT)15(50μM) | 1μL |
| random6mers(50μM) | 1μL |
| 10mM dNTP mix | 1μL |
| 无核酸酶水 | to18μL |
（2）将反应液在PCR仪上65-70℃条件下孵育5分钟，然后在冰上至少放2分钟；
（3）制备cDNA合成混合物，按顺序添加反应物，体系如下：
| 5×RT Buffer | 5μL |
| M-MLV Reverase Transcriptase | 1μL |
| RNase Inhibitor(40U/μL) | 1μL |
（4）将7μL的cDNA合成混合物加到步骤（2）中的反应液中，轻轻混合，短暂离心收集；
（5）反转录：42℃，60min；85℃，5min；
（6）反应完成后，合成的cDNA保存在-20℃备用。
3.Realtime-PCR
将反转录得到的cDNA进行realtimeRT-PCR，反应体系如下：
Nestin的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO.1-2所示，Map2的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO.3-4所示，Gfap的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO.5-6所示，B-actin的上游引物和下游引物的序列分别如SEQIDNO.7-8所示。
Realtime-PCR扩增条件为：95℃10min，95℃15s，56℃1min，在Bio-RadReal-TimePCRSystem中进行40个循环，结果见图2。整体上，实验组2的表达水平比实验组1的表达水平高。Nestin的表达水平变化最大，实验组1中Nestin的相对表达水平为3，实验组2中Nestin的相对表达水平为9。因此，本发明方法可以很好的诱导人脂肪间充质干细胞向神经样细胞的分化。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (5)
1.人脂肪间充质干细胞经三维培养后分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：将三维材料在37℃聚胶30分钟；再加入人脂肪间充质干细胞，于37℃，5％CO2培养，隔日更换培养液；所述三维材料为I型胶原溶液、聚乳酸溶液或丝素蛋白溶液，所述培养液为：L-DMEM+10％FBS+100u/L青霉素+100u/L链霉素。
2.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，所述I型胶原溶液的浓度为3mg/mL。
3.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，所述聚乳酸溶液的浓度为2.5mg/mL。
4.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，所述丝素蛋白溶液的浓度为5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的人脂肪间充质干细胞三维培养分化成神经样干细胞的方法，其特征在于，培养时间为14天。
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