CN103865875A - 一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法。本发明提供了一种制备神经干细胞的方法，是将离体的成纤维细胞进行悬浮培养，得到神经干细胞。本发明通过低贴附的物理方法使小鼠成纤维细胞生长为三维立体球状，从而模拟神经球的形态。实验结果表明通过三维球状培养，小鼠成纤维细胞(胚胎成纤维细胞和尾尖成纤维细胞)可以转分化为神经干细胞样的细胞。本发明提供的制备神经干细胞的方法，操作简便、成本低廉，对于神经干细胞的制备和应用具有重大价值。
Description
技术领域
本发明涉及一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法。
背景技术
神经干细胞具有自我更新能力以及分化为神经系统各类细胞的能力，在科研与临床上都具有重要意义。神经干细胞为修复受损的神经组织提供了可能途径，但是由于神经干细胞的来源受限，大量获取比较困难。
细胞转分化技术的出现可以将其他谱系的较容易获取的细胞（如成纤维细胞）转分化为神经干细胞。目前转分化主要采取转基因的方法，但是由于基因组的改变，细胞面临癌变的风险，众多科研人员正在致力于寻找更安全的细胞转分化的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种用成纤维细胞制备神经干细胞的方法。
本发明提供了一种制备神经干细胞的方法，是将离体的成纤维细胞进行悬浮培养，得到神经干细胞。
所述悬浮培养是在三维悬浮培养基上进行的；所述三维悬浮培养基为在细胞培养液中添加琼脂糖得到的凝胶。
所述细胞培养液可为DMEM培养基，具体可为高糖DMEM培养基。
所述琼脂糖在所述凝胶中的浓度具体可为0.5g/100mL。
所述凝胶的制备方法具体如下：将2倍浓度的所述细胞培养液与琼脂糖溶液混合，得到混合液；所述混合液凝固后得到所述凝胶。
所述琼脂糖溶液具体可为将琼脂糖溶于DPBS缓冲液得到的溶液。
所述成纤维细胞在进行所述悬浮培养前，可先进行胰酶消化。
所述胰酶消化采用的消化液的制备方法具体如下：在100mL DPBS缓冲液中溶解胰蛋白酶干粉0.25g、EDTA-4Na 0.04g，用0.22μm滤膜过滤除菌。
所述成纤维细胞可为小鼠成纤维细胞。所述小鼠成纤维细胞具体可为小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。
所述小鼠具体可为ICR小鼠。
以上任一所述方法制备得到的神经干细胞也属于本发明的保护范围。
以上任一所述神经干细胞为神经干细胞标志物表达量大于所述成纤维细胞的细胞。所述神经干细胞为如下各个标志物中的至少一种：Sox2、Nestin、Pax6、Olig2、Blbp、Nkx2.2、Ascl1、Brn2和Gpm6a。
以上任一所述神经干细胞为具有分化成星形胶质细胞和/或少突胶质细胞和/或神经元的能力的细胞。
所述星形胶质细胞可为表达星形胶质细胞分化标志物GFAP和/或星形胶质细胞分化标志物S100的细胞。
所述少突胶质细胞可为表达少突胶质细胞分化标志物O4的细胞。
所述神经元可为表达神经元分化标志物的细胞。
细胞命运不仅受内部基因的调控，外部环境的影响也是很关键的。神经干细胞在体外一般以神经球的形态生长，本发明通过低贴附的物理方法使小鼠成纤维细胞生长为三维立体球状，从而模拟神经球的形态。实验结果表明通过三维球状培养，小鼠成纤维细胞(胚胎成纤维细胞和尾尖成纤维细胞)可以转分化为神经干细胞样的细胞。
本发明提供的制备神经干细胞的方法，操作简便、成本低廉，对于神经干细胞的制备和应用具有重大价值。
附图说明
图1为实施例1中对细胞形态进行电子显微镜观察并拍照的照片。
图2为实施例1中神经干细胞标志物的定量PCR检测的结果。
图3为实施例1中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。
图4为实施例2中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。
图5为实施例3中对细胞形态进行电子显微镜观察并拍照的照片。
图6为实施例2中神经干细胞标志物的定量PCR检测的结果。
图7为实施例3中神经干细胞标志物的免疫荧光染色的结果和诱导分化后分化标志物的免疫荧光染色的结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
实施例中的PBS缓冲液均为购自Hyclone的货号为SH30013.09的pH7.0-7.4的DPBS缓冲液。
胎牛血清:Gibco。高糖DMEM培养基：Gibco。
ICR小鼠：购自维通利华，名称为
(ICR)，品系代码为201。
GFP转基因的ICR小鼠：购自南京模式动物研究所，品系名为EGFP。
雄性SD大鼠：购自维通利华，名称为(SD)，品系代码为101。
0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液的制备方法：在100mL DPBS缓冲液中溶解胰蛋白酶干粉（sigma)0.25g、EDTA-4Na 0.04g，用0.22μm滤膜过滤除菌。
petri dish（陪替氏培养皿）：corning VISTA Petri Dish，货号CLS7016560。
实施例1、用小鼠胚胎成纤维细胞制备神经干细胞
一、小鼠胚胎成纤维细胞的分离
取刚刚死亡的怀孕13.5天的ICR小鼠，75%酒精消毒后，剪开腹壁以暴露出子宫角。将子宫角移到10cm的皿里。用10mL DPBS缓冲液洗三遍.用剪刀剪开每一侧的胚囊,并将胚胎移到培养皿中。将胎盘和膜与胚胎分离开,分离后除去头、四肢、内脏、脊柱、和尾巴。将胚胎剩余部分转移到新的培养皿中，用10mL DPBS缓冲液洗三遍，将组织剪碎，加入0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液(每只胚胎剩余物的组织碎片加1mL),37℃孵育10分钟,然后用含10%（体积比）胎牛血清的高糖DMEM培养基终止胰酶反应，吹打胚胎组织，将上清转移到新的离心管中，250g离心5分钟，收集细胞沉淀。用含10%（体积比）胎牛血清的高糖DMEM培养基悬浮细胞沉淀，接种到10cm的细胞培养皿中(每两只胚胎获得的细胞接种一个皿)，此为P0代细胞。将P0代细胞放置于37℃、5%CO2培养箱中培养，细胞融合度达95%以后进行1:3传代，第一次传代得到P1代细胞，第二次传代得到P2代细胞。
二、培养皿的制备
1、三维悬浮培养皿的制备
2×高糖DMEM培养基的制备方法：将13.4g高糖DMEM培养基粉末(Gibco)和3.7g碳酸氢钠用500mL去离子水溶解，用0.22μm滤膜过滤除菌。1%琼脂糖溶液的制备方法：将1g琼脂糖溶于100mL DPBS缓冲液，用微波炉加热至沸腾。
将1体积份2×高糖DMEM培养基预热至37℃，与1体积份1%琼脂糖溶液混匀，得到混合液；将混合液倒入60mm petri dish（5ml/dish），混合液会凝成胶状，附着在petri dish底部，得到三维悬浮培养皿。
2、二维贴壁培养皿的制备
将高糖DMEM培养基倒入60mm petri dish（5ml/dish），得到二维贴壁培养皿。
三、小鼠胚胎成纤维细胞的培养
1、小鼠胚胎成纤维细胞的三维悬浮培养
将步骤一得到的P2代细胞用DPBS缓冲液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化，然后接种到步骤二得到的三维悬浮培养皿的凝胶表面（6×106个/皿），放置于37℃、5%CO2培养箱中培养7天，用电子显微镜观察并拍照。
2、小鼠胚胎成纤维细胞的二维贴壁培养
将步骤一得到的P2代细胞用DPBS缓冲液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化，接种到二维贴壁培养皿上（5×105个/皿），放置于37℃、5%CO2培养箱中培养7天，用电子显微镜观察并拍照。
结果见图1，A为二维贴壁培养的照片，B为三维悬浮培养的照片，标尺为200μm。小鼠胚胎成纤维细胞在二维贴壁培养后仍然成单层纤维状生长，小鼠胚胎成纤维细胞在三维悬浮培养后形成三维球状结构。结果表明：在传统的二维贴壁培养中，小鼠胚胎成纤维细胞会沉降于培养皿底部，在底部进行贴壁生长；在三维悬浮培养中，小鼠胚胎成纤维细胞接种于三维悬浮培养皿的凝胶表面，由于凝胶的存在，细胞不会由于重力沉降于培养皿底部，而是在凝胶中上部悬浮生长，成为三维球状细胞。
四、神经干细胞标志物的定量PCR检测
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行如下鉴定：提取的mRNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，分别鉴定各个神经干细胞标志物（Sox2、Nestin、Pax6、Olig2、Blbp、Nkx2.2、Ascl1、Brn2和Gpm6a）的表达情况。
用于鉴定神经干细胞标志物Sox2的编码基因的引物对如下：
F1:5’-CTGGACTGCGAACTGGAGAAG-3’；
R1:5’-TTTGCACCCCTCCCAATTC-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Nestin的编码基因的引物对如下：
F2:5’-TCTTCCCCCTTGCCTAATACC-3’；
R2:5’-TTAGGATAGGGAGCCTCAGACATAG-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Pax6的编码基因的引物对如下：
F3:5’-ACCTGTCTCCTCCTTCACATCAG-3’；
R3:5’-TTGGTGAGGGCGGTGTCT-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Olig2的编码基因的引物对如下：
F4:5’-CTGGCGCGAAACTACATCCT-3’；
R4:5’-GCTCACCAGTCGCTTCATCTC-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Blbp的编码基因的引物对如下：
F5:5’-CGCAACCTGGAAGCTGACA-3’；
R5:5’-GCCCAGAGCTTTCATGTACTCA-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Nkx2.2的编码基因的引物对如下：
F6:5’-ATCCCCTTTTCCGCCTACAG-3’；
R6:5’-CTGGGCGTTGTACTGCATGT-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Ascl1的编码基因的引物对如下：
F7:5’-TCGTCCTCTCCGGAACTGAT-3’；
R7:5’-TAGCCGAAGCCGCTGAAGT-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Brn2的编码基因的引物对如下：
F8:5’-GCGCTTGGCACCCTGTAC-3’；
R8:5’-GCCTCAAACCTGCAGATGGT-3’。
用于鉴定神经干细胞标志物Gpm6a的编码基因的引物对如下：
F9:5’-TCTGCCGGAACACCACTCTAG-3’；
R9:5’-AACTGACGCAGATCCAAGCA-3’。
以完成二维贴壁培养的细胞中各个神经干细胞标志物的表达量作为1，计算完成三维悬浮培养的细胞中各个相应的神经干细胞标志物的相对表达倍数，结果见图2。结果表明，将小鼠胚胎成纤维细胞进行三维悬浮培养后，显著上调了细胞的神经干细胞标志物（Sox2、Nestin、Pax6、Olig2、Blbp、Nkx2.2、Ascl1、Brn2和Gpm6a）的水平。
五、神经干细胞标志物的免疫荧光染色
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行如下免疫荧光染色鉴定：采用4%多聚甲醛室温固定细胞40分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用0.1%Triton X-100透化处理5分钟，用DPBS缓冲液清洗两遍；然后用含10%马血清和0.1%Triton X-100的DPBS缓冲液将细胞4℃孵育过夜；然后加入用DPBS缓冲液稀释的一抗，37℃孵育2小时，用DPBS缓冲液清洗三遍；然后加入用DPBS缓冲液稀释的二抗，37℃孵育40分钟，然后含1μg/ml染料Hoechst 33342的DPBS缓冲液37℃孵育20分钟，用DPBS缓冲液清洗三遍后拍照。
一抗及其稀释比例如下：
用于检测神经干细胞标志物Sox2的一抗：购自Invitrogen，1:50稀释。
用于检测神经干细胞标志物Nestin的一抗：购自eBioscience，1:50稀释。
照片见图3，标尺为100μm，A和B为神经干细胞标志物Nestin的检测结果，C和D为神经干细胞标志物Sox2的检测结果，A、C为二维贴壁培养的细胞的结果，B、D为三维悬浮培养的细胞的结果。二维贴壁培养的细胞中，均未检测到各个神经干细胞标志物。三维悬浮培养7天的细胞中，Nestin和Sox2显示阳性染色。
六、分化标志物的检测
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行如下操作：
1、将细胞消化后接种在包被了0.001g/100mL多聚鸟氨酸（Sigma，P4957）和10ng/mL层粘连蛋白（Sigma，L2020）的48孔细胞培养板上，在神经细胞分化培养基(DMEM/F12培养基+B27，B27购买于Life Technologies，货号17504-044，使用时原液稀释50倍)中培养2周，培养是在于37℃、5%CO2培养箱中进行的。
2、将完成步骤1的培养的细胞进行免疫荧光染色鉴定，方法参见步骤五，差异仅在于采用针对分化标志物（Tuj1、GFAP、O4）的一抗。
一抗及其稀释比例如下：
用于检测神经元分化标志物Tuj1的一抗：购自Millipore，1:500稀释；
用于检测星形胶质细胞分化标志物GFAP的一抗：购自Millipore，1:500稀释；
用于检测少突胶质细胞分化标志物O4的一抗：购自Sigma，1:200稀释。
照片见图3，标尺为100μm，E和F为分化标志物Tuj1的检测结果，G和H为分化标志物GFAP的检测结果，I和J为分化标志物O4的检测结果，E、G和I为二维贴壁培养的细胞的结果，F、H和J为三维悬浮培养的细胞的结果。二维贴壁培养的细胞进行步骤1后，均未检测到各个分化标志物。三维悬浮培养的细胞进行步骤1后，分化标志物（Tuj1、GFAP、O4）均显示阳性染色结果，即三维悬浮培养的细胞具有向神经系统三个谱系细胞分化的能力。
实施例2、用小鼠胚胎成纤维细胞制备神经干细胞并进行体内分化实验
一、小鼠胚胎成纤维细胞的分离
用GFP转基因的ICR小鼠代替ICR小鼠，其它完全同实施例1的步骤一。
二、培养皿的制备
同实施例1的步骤二。
三、小鼠胚胎成纤维细胞的培养
同实施例1的步骤三。
四、体内分化实验
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行如下鉴定：
1、将细胞用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化后用DPBS缓冲液重悬，得到5×104cells/μl的细胞悬液。
2、使用10%水合氯醛将成年雄性SD大鼠(230–250g)麻醉(400mg/kg)，使用立体定位仪，以Bregma点为零点后移5.0mm、旁开2.5mm、深度3.5mm，向大鼠脑部注射10μl步骤1得到的细胞悬液。从注射细胞前一天到实验结束，每天给大鼠注射环孢素A(15mg/kg/day)。注射细胞悬液4周后将大鼠进行灌注和大脑取材，冰冻切片并免疫染色。
染色时采用的一抗及其稀释比例如下：
用于检测星形胶质细胞分化标志物GFAP的一抗：购自Millipore，1:200稀释；
用于检测神经元分化标志物NeuN的一抗：购自Millipore，1:50稀释；
用于检测神经元分化标志物MAP2的一抗：购自Sigma，1:200稀释；
用于检测少突胶质细胞分化标志物O4的一抗：购自Sigma，1:200稀释。
用于检测绿色荧光蛋白GFP的一抗：购自Abcam，1:400稀释。
结果见图4，标尺为100μm。二维贴壁培养的细胞移植后存活数量较少且不能分化为神经系统的细胞，如图A，C，E和G所示。三维悬浮培养的细胞移植到大鼠海马区域后具有较强的生存能力，并且能分化为神经元，星形胶质细胞和少突胶质细胞，如图B，D，F和H所示。
实施例3、用小鼠尾尖成纤维细胞制备神经干细胞
一、小鼠尾尖成纤维细胞的分离
取刚刚死亡的出生24小时的ICR小鼠，75%酒精消毒后，从尾尖游离端开始计量，取1/4-1/5位置，用剪刀剪碎，剪碎的组织块接种到10cm的细胞培养皿中，放置于37℃、5%CO2培养箱中培养，成纤维细胞会逐渐从组织块中爬出，此为P0代细胞。于37℃、5%CO2培养箱中培养P0代细胞，细胞融合度达95%以后进行1:3传代，第一次传代得到P1代细胞，第二次传代得到P2代细胞，第三次传代得到P3代细胞。
二、培养皿的制备
同实施例1的步骤二。
三、小鼠尾尖成纤维细胞的培养
1、小鼠尾尖成纤维细胞的三维悬浮培养
将步骤一得到的P3代细胞用DPBS缓冲液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化，然后接种到步骤二得到的三维悬浮培养皿的凝胶表面（6×106个/皿），放置于37℃、5%CO2培养箱中培养7天，用电子显微镜观察并拍照。
2、小鼠尾尖成纤维细胞的二维贴壁培养
将步骤一得到的P3代细胞用DPBS缓冲液清洗一遍，使用0.25%胰蛋白酶-1mM EDTA混合消化液消化，接种到二维贴壁培养皿上（5×105个/皿），放置于37℃、5%CO2培养箱中培养7天，用电子显微镜观察并拍照。
结果见图5，A为二维贴壁培养的照片，B为三维悬浮培养的照片，标尺为200μm。小鼠尾尖成纤维细胞在二维贴壁培养后仍然成单层纤维状生长，小鼠尾尖成纤维细胞在三维悬浮培养后形成三维球状结构。结果表明：在传统的二维贴壁培养中，小鼠尾尖成纤维细胞会沉降于培养皿底部，在底部进行贴壁生长；在三维悬浮培养中，小鼠尾尖成纤维细胞接种于三维悬浮培养皿的凝胶表面，由于凝胶的存在，细胞不会由于重力沉降于培养皿底部，而是在凝胶中上部悬浮生长，成为三维球状细胞。
四、神经干细胞标志物的定量PCR检测
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行如下鉴定：提取的mRNA并反转录为cDNA，以cDNA为模板，采用Power SYBR Green RT-PCR Kit(Applied Biosystems)进行荧光定量PCR反应，分别鉴定各个神经干细胞标志物（Sox2、Nestin、Pax6、Olig2、Blbp、Nkx2.2、Ascl1和Brn2）的表达情况。
采用的引物同实施例1的步骤四。
以完成二维贴壁培养的细胞中各个神经干细胞标志物的表达量作为1，计算完成三维悬浮培养的细胞中各个相应的神经干细胞标志物的相对表达倍数，结果见图6。结果表明，将小鼠尾尖成纤维细胞进行三维悬浮培养后，显著上调了细胞的神经干细胞标志物（Sox2、Nestin、Pax6、Blbp、Nkx2.2、Ascl1和Brn2）的水平。
五、神经干细胞标志物的免疫荧光染色
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行免疫荧光染色鉴定，方法同实施例1的步骤五。
照片见图7，标尺为100μm，A和B为神经干细胞标志物Nestin的检测结果，C和D为神经干细胞标志物Sox2的检测结果，A、C为二维贴壁培养的细胞的结果，B、D为三维悬浮培养的细胞的结果。二维贴壁培养的细胞中，均未检测到各个神经干细胞标志物。三维悬浮培养7天的细胞中，Nestin和Sox2显示阳性染色。
六、分化标志物的检测
分别将步骤三中完成三维悬浮培养的细胞和完成二维贴壁培养的细胞进行分化标志物的检测，方法同实施例1的步骤六。
一抗及其稀释比例如下：
用于检测神经元分化标志物Tuj1的一抗：购自Millipore，1:500稀释；
用于检测星形胶质细胞分化标志物S100的一抗：购自Sigma，1:50稀释；
用于检测少突胶质细胞分化标志物O4的一抗：购自Sigma，1:200稀释。
照片见图7，标尺为100μm，E和F为分化标志物Tuj1的检测结果，G和H为分化标志物S100的检测结果，I和J为分化标志物O4的检测结果，E、G和I为二维贴壁培养的细胞的结果，F、H和J为三维悬浮培养的细胞的结果。二维贴壁培养的细胞进行步骤1后，均未检测到各个分化标志物。三维悬浮培养的细胞进行步骤1后，分化标志物（Tuj1、S100、O4）均显示阳性染色结果，即三维悬浮培养的细胞具有向神经系统三个谱系细胞分化的能力。
Claims (8)
1.一种制备神经干细胞的方法，是将离体的成纤维细胞进行悬浮培养，得到神经干细胞。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：所述悬浮培养是在三维悬浮培养基上进行的；所述三维悬浮培养基为在细胞培养液中添加琼脂糖得到的凝胶。
3.如权利要求2所述的方法，其特征在于：所述凝胶的制备方法如下：将2倍浓度的所述细胞培养液与琼脂糖溶液等体积混合，得到混合液，所述混合液凝固后得到所述凝胶。
4.如权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述琼脂糖在所述凝胶中的浓度为0.5g/100mL。
5.如权利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞在进行所述悬浮培养前，先进行胰酶消化。
6.如权利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于：所述成纤维细胞为小鼠成纤维细胞。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于：所述小鼠成纤维细胞为小鼠胚胎成纤维细胞或小鼠尾尖成纤维细胞。
8.权利要求1至7中任一所述方法制备得到的神经干细胞。
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