JP7199427B2 - 炎症ヒト皮膚のex vivoモデルおよび抗炎症化合物のスクリーニングのためのその使用 - Google Patents
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Description
a)あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗CD3抗体および抗CD28抗体の皮膚常在T細胞を活性化するための有効量および場合によってはIL-2を含む組成物を注射するステップ、
b)ステップa)において活性化されたT細胞のLTh1および/またはLTh17への極性化ならびにIL-1β、IL-23、およびTGF-βの少なくとも1つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップa)において得られた注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む、炎症を起こした皮膚のex vivoモデルを得るためのin vitro法に関する。
c)候補化合物と、ステップb)の終了時に得られ、LTh1および/またはLTh17極性化T細胞を含む炎症を起こした皮膚のex vivoモデルを接触させるステップ;
d)炎症を起こした皮膚のex vivoモデルの少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ;
e)ステップd)で得られた前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ;
f)ステップd)で測定した前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
a)あらかじめ哺乳動物から採取した健康な皮膚生検の真皮内に、抗CD3抗体および抗CD28抗体の皮膚常在T細胞を活性化するための有効量および場合によってはIL-2を含む組成物を注射するステップ、
b)ステップa)において活性化されたT細胞のLTh1および/またはLTh17への極性化ならびにIL-1β、IL-23、およびTGF-βの少なくとも1つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップa)において得られた注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む方法に関するものである。
c)候補化合物と、ステップb)の終了時に得られ、LTh1および/またはLTh17極性化T細胞を含む炎症を起こした皮膚のモデルを接触させるステップ;
d)炎症を起こした皮膚のモデルの少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ;
e)ステップd)で得られた前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ;
f)ステップd)で測定した前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。
- 容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部は、多孔性膜(40)からなり、前記挿入物は、固化したマトリックス(20)に埋め込まれた本発明の方法のステップa)の終了時に得られた注射された健康な皮膚生検(30)を含み、前記マトリックスは、挿入物の内縁および多孔性膜に接触しており、皮膚生検の表皮は、大気および真皮に接触しており、皮膚生検の表皮および表皮付属物は、固化したマトリックスに浸漬されている、少なくとも1つの細胞培養挿入物(10)、
- IL-1β、IL-23、およびTGF-βの少なくとも1つの混合物を含む組成物B。
- 容器または培養ボックスウェルに含まれるのに適しており、その底部は、多孔性膜(40)からなり、前記挿入物は、少なくともIL-1β、IL-23、およびTGF-βの混合物を含有する固化したマトリックス(20)に埋め込まれた本発明の方法のステップa)の終了時に得られた注射された健康な皮膚生検(30)を含み、前記マトリックスは、挿入物の内縁および多孔性膜に接触しており、皮膚生検の表皮は、大気および真皮に接触しており、皮膚生検の表皮および表皮付属物は、固化したマトリックスに浸漬されている、少なくとも1つの細胞培養挿入物(10)、
- IL-1β、IL-23、およびTGF-βの少なくとも1つの混合物を含む組成物B。
皮膚生検は、表皮、真皮、および皮下を含む完全な皮膚試料から調製する。これらの生検に基づき、試験すべき抗炎症化合物の性質に応じて、2つの異なる実施形態が可能である。
クランプを使って、皮膚生検を、真皮を上にして平らに保つ。死腔のない針を、701Nまたは705Nのハミルトンシリンジ(それぞれ直径8mmまたは15mmの生検用)を用いて真皮側から生検に挿入する。それぞれ直径8または15mmの生検についての活性化溶液(50ng/μLの抗CD3抗体、50ng/μLの抗CD28抗体、および10ng/mLのIL-2)の10μLまたは35μLを、生体検査の側面から、上皮への損傷を避けるために注射する。
活性化された常在T細胞が活性化されている皮膚生検は、in vitroで培養したヒト皮膚または表皮外植片に対する物理的支持および栄養層としての天然マトリックスの使用に基づき、NativeSkin(登録商標)モデルに使用されるのと同じ方法を用いて、培養挿入物に注入された液体マトリックス上にマウントされる。その後、外植片を、プレート(インキュベーター培養、毎日の培養培地の更新)で培養する。
WILLIAMのE合成培養培地中で、以下のサプリメントを添加する:10ng/mLのIL-1β、50ng/mLのIL-23、および10ng/mLのTGFβ。培養は、37℃でCO2インキュベーター中で7日間行う。サプリメントを含む培養培地を、毎日交換する。
5.1-ミクロトーム切断
この分析は、ミクロトームを用いた連続切片によりパラフィンブロックに含まれる試料について実施することができる。
また、脱水時の細胞/スフェロイド(複数可)の蛍光を変化させないために、凍結切片上で分析を行うこともできる。
6.1-炎症マーカー
モデルにより産生されたサイトカインIL-17A、IL-22およびIFNγを、Meso Scale Discoveryからの特異的検出キット(U-PLEX TH 17 Combo 2 Human Reference K15076K)を用いた、およびmultiplex assayプラットフォーム(MESO QuickPlex SQ 120)を用いたELISAアッセイにより、培養培地中で解析した。
本発明の方法のステップb)の終了時において、炎症を起こした皮膚のex vivoモデルは、乾癬患者の乾癬病変で観察されるものと同等の特徴的な徴候を示す。下の表は、これらのマーカーのいくつかの外観を示している。
本発明の方法によって得られた炎症を起こした皮膚のモデルの関連性を試験するために、それらの抗炎症作用について知られている化合物を試験した。これらは、ベタメタゾンジ-プロピオネートおよびPDE4阻害剤である。これらの生成物の局所適用(直径8mmの生検で10μLの一定の体積)は、InflammaSkin(登録商標)モデル(予防的処置)の活性化および製造直後に、または処置(治療的処置)のない培養の3日後に実施し、培養の7日目まで毎日繰り返した。
- IL-17A分泌(図6)は、それぞれのプラセボ対照と比較して、予防的処置としてベタメタゾンジプロピオネート(3)とPDE4阻害剤(5)によって強く阻害され(図6A)、一方ベタメタゾンジプロピオネート(3)のみが、治療的処置としてIL-17A分泌を阻害する(図6B)。
- IL-22の分泌(図7)は、ベタメタゾンジプロピオネート(3)によって強く阻害され、PDE4阻害剤(5)によって、それぞれのプラセボ対照に比べて予防的処置としてさらにより強く阻害され(図7A)、一方ベタメタゾンジプロピオネート(3)は、治療的処置としてIL-22分泌を阻害する(図7B)。
- IFNγ分泌(図8)は、それぞれのプラセボ対照と比較して予防的処置としてベタメタゾンジプロピオネート(3)およびPDE4阻害剤(5)によって強く阻害され、一方ベタメタゾンジプロピオネート(3)のみが、治療的処置としてIFN分泌を阻害する(図8B)。
- TNFα分泌(図9)は、それぞれのプラセボ対照と比較して予防的処置(図9A)だけでなく、治療的処置(図9B)としてもベタメタゾンジプロピオネート(3)およびPDE4阻害剤(5)によって強く阻害される。
抗CD3抗体の取り込みに関する比較試験を、ヒト皮膚生検で実施した。蛍光色素Alexa Fluor 647(ThermoFisher,ref.A51001)と結合した抗CD3e抗体40ng/μlは、厚さ4mm、直径8mmのヒト皮膚生検の真皮内に直接注入するか、または皮膚生検を浮遊状態に維持した培養培地に添加した。培養24時間後、皮膚生検を10%ホルマリン溶液に固定し、パラフィンブロックに包埋する。生検の一定の厚さ5μmの連続切片を作製する。細胞核は、DAPIでマークされている。分析には、Leica DM5000蛍光顕微鏡を用いる。
本発明の方法により得られた炎症を起こした皮膚のモデル(Hypo-InflammaSkin(登録商標))の妥当性を検証するために、その抗炎症作用について知られている抗体を試験した。これは、アダリムマブ抗TNFα抗体である。本発明の方法により、厚さ1cmの炎症を起こした皮膚(Hypo-InflammaSkin(登録商標)-I)の生検を得た。T0(予防的処置、Hypo-InflammaSkin(登録商標)-I+抗TNFα-P)または炎症生検のex vivo培養の3日後(治療的処置、Hypo-InflammaSkin(登録商標)-I+抗TNFα-T)で、アダリムマブ50nMの皮下注射(すなわち真皮内)を行った。7日間のex vivo培養後、培養培地を採取し、皮膚生検を10%ホルマリン溶液に固定した後、パラフィンブロックに包埋する。生検組織の一定の厚さ5μmの連続切片を作製する。皮膚生検の形態学的外観を、ヘマトキシリンおよびエオジン染色を用いて光学顕微鏡下で検討した。蛍光色素と結合した抗S100A7抗体を用いて、蛍光顕微鏡(Leica DM 5000顕微鏡)によりソリアシン(S110A7)の存在を確認する。細胞核は、DAPIでマークされている。炎症を起こしていない皮膚の生検(HypoSkin(登録商標)-表皮、真皮、および皮下を含む生検)を、対照に用いる。
Claims (14)
- 以下のステップ:
a)あらかじめ哺乳動物から採取した3mm~1cmの範囲の厚さを有する健康な皮膚生検の真皮内に、抗CD3抗体および抗CD28抗体の皮膚常在T細胞を活性化するための有効量を含む組成物を注射するステップ、
b)ステップa)において活性化されたT細胞のLTh1および/またはLTh17への極性化ならびにIL-1β、IL-23、およびTGF-βの少なくとも1つの混合物の炎症マーカーの合成を得るための有効量を含む組成物の存在下で、ステップa)において得られた前記注射された皮膚生検をインキュベートするステップ
を含む、炎症を起こした皮膚のex vivoモデルを得るためのin vitro法。 - 前記注射された組成物が有効量のIL-2をさらに含む、請求項1に記載の方法。
- ステップa)が手動で実施される、請求項1に記載の方法。
- 前記ステップb)が少なくとも5日間続く、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。
- ステップa)およびb)の間に、固化可能な液体マトリックス上に、ステップa)の終了時に得られた前記注射した皮膚生検を堆積させる追加のステップa’)を含み、前記マトリックス自体が細胞培養挿入物内に含まれており、その底部は多孔性膜からなり、前記挿入物が容器またはウェル内に配置されており、したがって、マトリックスが固化した後に、前記皮膚生検の3D完全性が維持されることを可能にする、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記ステップa)で注射される前記組成物中の濃度が次のものである、請求項1~5のいずれか一項に記載の方法:
- 前記抗CD3および前記抗CD28抗体について10ng/μl~100ng/μl。 - 前記ステップb)で使用される前記組成物の少なくとも1つの混合物中の濃度が、次のものである、請求項1~6のいずれか一項に記載の方法:
- IL-1βおよびTGFβについて1ng/ml~50ng/ml、
- IL-23については10ng/ml~100ng/ml。 - 化合物の抗炎症効果を評価することをさらに目的とし、次の追加のステップを含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法:
c)候補化合物と、ステップb)の終了時に得られ、LTh1および/またはLTh17極性化T細胞を含む炎症を起こした皮膚のモデルを接触させるステップ;
d)炎症を起こした皮膚のモデルの少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルを測定するステップ;
e)ステップd)で得られた前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルをそれらの対照の発現レベルと比較するステップ;
f)ステップd)で測定した前記少なくとも2つの炎症マーカーの発現レベルがそれらの対照の発現レベルより低い場合に、前記候補化合物の抗炎症効果を同定するステップ。 - またステップd)においても、少なくとも3つの、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、IFNγ、TNFα、S100A7、S100A8、S100A9、S100A12、SERPINB3、SERPINB4、SERPINB13、DEFB4、KRT6A、KRT16、KRT17、CXCL9、CXCL10、CCL18、およびCCL20からなる群から選択される炎症マーカーの発現レベルを測定するステップを含む、請求項8に記載の方法。
- 真皮、表皮、表皮付属物、皮下組織、ならびにTh1および/またはTh17細胞を含む炎症を起こした皮膚のex vivoモデルであって、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法によって得られ、少なくとも2つの炎症マーカーのタンパク質レベルでの発現によって特徴付けられ、IL-8、IL-17A、IL-22、IL-23、IFNγ、TNFα、S100A7、S100A8、S100A9、S100A12、SERPINB3、SERPINB4、SERPINB13、DEFB4、KRT6A、KRT16、KRT17、CXCL9、CXCL10、CCL18、およびCCL20からなる群より選択される、ex vivoモデル。
- 容器または培養ボックスウェルに含有されるのに適しており、その底部は多孔性膜(40)からなる細胞培養挿入物(10)であって、前記挿入物が、固化したマトリックス(20)に埋め込まれている請求項10に記載の炎症を起こした皮膚のex vivoモデル(30)を含み、前記マトリックスが前記挿入物の内縁および前記多孔性膜に接触しており、炎症を起こした皮膚のex vivoモデルの表皮が大気および真皮と接触しており、前記炎症を起こした皮膚のex vivoモデルの表皮付属物が前記固化したマトリックスに浸漬されている、細胞培養挿入物(10)。
- 請求項1~9のいずれかに記載の方法を実施するためのキットであって、哺乳動物から以前に採取された健康な皮膚生検、抗CD3抗体および抗CD28抗体の有効量を含む組成物A、ならびに、IL-1β、IL-23およびTGF-βの少なくとも混合物を含む組成物Bを含む、キット。
- 注射装置をさらに含む、請求項12に記載のキット。
- ステップa)で使用される哺乳動物から以前に採取された前記健康な皮膚生検が、真皮、表皮、表皮付属物、場合により皮下組織を含む、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。
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