ES2933121T3 - Modelo ex vivo de piel humana inflamada y sus usos para el cribado de compuestos antiinflamatorios - Google Patents

Abstract

La invención se refiere a un modelo ex vivo de piel inflamada, un método in vitro para su obtención y sus usos para el cribado de compuestos antiinflamatorios. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Modelo ex vivo de piel humana inflamada y sus usos para el cribado de compuestos antiinflamatorios

Esta solicitud de patente reivindica la prioridad de la solicitud de patente francesa n.° 17/71020 presentada el 26 de septiembre de 2017.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un modelo ex vivo de piel inflamada, un kit para implementar este procedimiento, así como los usos del modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención para la identificación de compuestos que presentan un efecto antiinflamatorio, en particular para el tratamiento de la psoriasis.

Técnica anterior

La psoriasis es una patología autoinmunitaria inflamatoria crónica, que afecta aproximadamente al 2% de la población europea, caracterizada por una diferenciación y proliferación anormales de queratinocitos epidérmicos que se traducen en la formación de placas rojas a menudo irritantes y por una acumulación de piel muerta (escamas), que pueden encontrarse en todo el cuerpo (lo más frecuente en brazos, torso, rodillas, pies, uñas, cara y cuero cabelludo).

El análisis histológico de estas placas psoriásicas muestra un aumento del grosor de la epidermis, una diferenciación incompleta de los queratinocitos y un aspecto festoneado de la unión dermoepidérmica, la acumulación de neutrófilos polinucleares en la epidermis y la infiltración de la dermis por células mononucleares, en particular macrófagos y linfocitos T (LT), así como angiogénesis significativa.

Los estudios inmunohistoquímicos confirman que la dermis es el sitio de un infiltrado compuesto mayoritariamente por linfocitos T CD4+ de memoria, macrófagos y células dendríticas (DC) mientras que los linfocitos T CD8+ predominan en la epidermis normal (no inflamada).

La inflamación de la psoriasis es el resultado de la interacción entre las células epiteliales (queratinocitos), las células dendríticas y los linfocitos T. A nivel molecular, estas interacciones son mediadas por una compleja red de citoquinas que inician la patología y mantienen un círculo vicioso de activación celular recíproca, perpetuando así las lesiones cutáneas y su cronicidad (JF NICOLAS, Bull. Acad. Natle. Méd., 2014, 198 (1), pág. 17-30). Las principales citoquinas producidas en la piel psoriásica por las células dendríticas inflamatorias son la IL-12 y la IL-23, que juegan un papel importante en la diferenciación o expansión de los linfocitos T hacia los linajes Th1 (LTh1) o Th17 (LTh2) (PECK y MELLINS, Immunology, 2009, 129, pág. 147-153). Los LTh1 producen IFN^y, TNFa e IL-2 mientras que los LTh17 son responsables de la síntesis de IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22 y en menor medida de TNFa. Esta mayor producción de citoquinas está en el origen de la activación de los queratinocitos que, a su vez, darán lugar a una liberación de péptidos antimicrobianos, mediadores proinflamatorios (IL-1 p, IL-6, IL-17C, TNFa, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11 y CCL20) y psoriasina (S100A7). Los estudios realizados en 2014 han demostrado que las células T CD4+ que producen IL-22 y las células CD8+ que producen IL-17 permanecen presentes en la piel psoriásica previamente lesionada y tratada con terapias psoriásicas efectivas. Estos resultados deben compararse con los que muestran que los injertos de piel no lesionada, de aspecto normal, que proceden de pacientes que padecen psoriasis conducen al desarrollo de lesiones psoriásicas en ratones inmunodeficientes. En conjunto, estos trabajos demuestran que las células T residentes en la piel persisten en las lesiones psoriásicas clínicamente resueltas y producen citoquinas que se sabe que causan la patología primaria de la enfermedad (Rachael A. CLARCK, Sci TransíMed, 2015, 7(269):269rv1).

El tratamiento de la psoriasis se basa principalmente en el uso de corticoides, inhibidores de la fosfodiesterasa, inmunosupresores (ciclosporina, tacrolimus) o fototerapia UV. Más recientemente, se han desarrollado anticuerpos dirigidos contra el TNFa (infliximab, adalimumab, etanercept, golimumab), IL-17-A (secukinumab, ixekizumab), IL-12/IL-23 (ustekinumab, guselkumab, tildrakizumab) para luchar contra formas de psoriasis de moderadas a graves o están bajo estudio clínico (GOODERHAM et al., Skin Therapy Letter, 2015, 20(1), pág. 1-5). Algunos de estos anticuerpos se administran por vía subcutánea durante varias semanas, incluso varios años, según la gravedad de la psoriasis. A pesar de haber demostrado cierta eficacia, los tratamientos tienen efectos secundarios no despreciables y siguen siendo incapaces de curar la psoriasis. Existe una necesidad real de identificar nuevos compuestos capaces de superar estos inconvenientes. Para ello, es fundamental disponer de un modelo de piel inflamada, en particular psoriásica.

Los modelos murinos de psoriasis se basan en mutaciones espontáneas (Scd1ab/Scd1ab, Sharpincpdm/Sharpincpdm, Ttc7fsn/Ttc7fsn) o una modulación artificial de la expresión de genes implicados en diferentes vías de señalización, o que codifican citoquinas o factores de crecimiento (MP SCHON, Experimental Dermatology, 2008, 17, pág. 703-712). Sin embargo, estos modelos no presentan todas las características fenotípicas e histológicas de la psoriasis encontradas en el hombre o bien presentan características complementarias que limitan el uso de estos modelos animales para el cribado de nuevos compuestos. Además, las diferencias fisiológicas existentes entre seres humanos y animales no permiten predecir con certeza la respuesta inmunitaria en el hombre, lo que lleva al abandono de una serie de compuestos candidatos desde la fase preclínica del ensayo.

Para sortear estas dificultades, se realizaron xenotrasplantes de piel humana psoriásica en ratones atímicos o SCID y permitieron crear modelos de formas agudas de psoriasis. Sin embargo, al estar incompleto el sistema inmunitario de los ratones receptores, de nuevo es difícil extrapolar los resultados obtenidos a partir de estos modelos animales al hombre.

Además, la consideración del bienestar animal asociado a los nuevos requisitos normativos lleva al desarrollo de modelos más cercanos a la fisiología humana. Así, se han desarrollado modelos in vitro de piel artificial o incluso epidermis a partir del cultivo de queratinocitos y/o fibroblastos sobre matrices inertes de policarbonato (SkinEthic™ RHE, EpiSkin™, Episkin, Francia). Sin embargo, dichos modelos no contienen los anexos epidérmicos ni los componentes del sistema inmunitario, lo que limita su uso al cribado de compuestos potencialmente irritantes.

Para superar estos inconvenientes, los primeros modelos ex vivo de piel humana se han hecho a partir de muestras de piel humana, por extracción de la dermis y la epidermis. Sin embargo, la vida útil de estos modelos no supera los 7 días. Esta vida útil podría aumentar extrayendo, además de la dermis y la epidermis, los anexos epidérmicos y los folículos pilosos (documento EP 2019316 B1). Sin embargo, estos modelos no corresponden a un estado inflamatorio de la piel.

Se han obtenido equivalentes de piel humana psoriásica in vitro ya sea mediante la estimulación de fibroblastos dérmicos sanos o mediante el uso de fibroblastos procedentes de pacientes con psoriasis (TJABRINGA et al., Am. J. Pathol., 2008, 173, pág. 815-823). Aunque estos modelos 3D muestran un engrosamiento de la epidermis y producción de citoquinas inflamatorias (TNFa, II-1 a, IL-6, IL-8 e IL-22) características de la patología, el componente inmunitario permanece ausente.

Más recientemente, la adición de IL-1 p directamente al medio de cultivo durante varios días ha permitido inducir una inflamación aguda en explantes de piel humana (documento EP 2885637 B1). Ahora, este modelo no permite explicar la inflamación crónica que se observa en el caso de la psoriasis.

La adición de células T procedentes de sangre periférica, y activadas o diferenciadas en subpoblaciones Th1 o Th17, bajo la dermis de los modelos desarrollados por Tjabringa et al. ha permitido poner de manifiesto la influencia que ejercen las citoquinas producidas por estas células T sobre los queratinocitos y el establecimiento de la inflamación (VAN DEN BOGAARD et al., J. Invest. Dermatol., 2014, 134, pág. 719-727). Sin embargo, ciertas características de la psoriasis, como la expresión del marcador Ki67, la hiperproliferación de queratinocitos y la acantosis, siguen estando ausentes en este modelo. Además, las células T procedentes de la sangre periférica son distintas de las células T residentes en la piel y, en particular, de las células T de memoria residentes (T^rm) de la dermis y la epidermis (MUELLER y Ma Ck a Y, Nat Rev Immunol., 2016, 16(2), pág. 79-89). De hecho, las células T^rm poseen factores de transcripción y marcadores de superficie que las distinguen de otras células T de memoria de la sangre periférica. Así, la presencia de CD69 en la superficie de T^rm asociado a la subexpresión del gen S1PR1 (receptor 1 de esfingosina-1-fosfato) permite que se mantengan en tejidos periféricos como la piel durante varios meses, impidiendo así su recirculación en la sangre. La presencia de poblaciones de T^rm CD8+ y T^rm CD4+ se ha observado ampliamente en la epidermis y la dermis de la piel humana sana; la subpoblación T^rm CD8+CD49a+ está implicada en la síntesis de perforina e IFNy mientras que las células T^rm CD8+CD49a- producen principalmente IL-17 (HAIJING et al., Autoimmun Rev., 2018, pág. 906-911).

Otro enfoque basado en la activación de células T residentes en biopsias de piel humana se ha descrito en la solicitud internacional publicada con el número WO 2014/182655 A1. Sin embargo, en este modelo no se pudo identificar ningún marcador proteico característico de la psoriasis. Además, la eliminación del tejido adiposo subcutáneo conduce a la obtención de biopsias de piel que no superen los 300 pm de espesor. Tal finura hace que su manejo sea muy delicado y no permite realizar inyecciones subcutáneas.

Por lo tanto, existe una necesidad real de desarrollar nuevas herramientas, en particular modelos ex vivo de piel humana inflamada. Esta necesidad implica, en particular, la identificación de las condiciones de cultivo en las que las muestras de piel ex vivo, adecuadas para su uso en la modelización de la inflamación, pueden mantenerse durante un tiempo suficientemente largo sin inducir una desviación significativa del comportamiento de estas muestras con respecto a las condiciones encontradas in vivo.

De forma sorprendente, los autores de la invención han desarrollado un procedimiento in vitro que permite superar todos estos inconvenientes.

Sumario de la invención

La presente invención permite superar los inconvenientes antes mencionados proporcionando un modelo ex vivo de piel inflamada que refleja de manera más precisa y reproducible el entorno de la piel inflamada tal como se observa in vivo en un contexto fisiopatológico.

Así, un primer objeto de la invención se refiere a un procedimiento in vitro para obtener un modelo ex vivo de piel inflamada que comprende las siguientes etapas:

a) inyectar, en la dermis de una biopsia de piel sana previamente tomada de un mamífero, una composición que comprende una cantidad eficaz para activar las células T residentes de la dermis de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2,

b) incubar la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a) en presencia de una composición que comprende una cantidad eficaz, para obtener la polarización de las células T activadas en la etapa a) en LTh 1 y/o LTh17 y la síntesis de marcadores de inflamación, de al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p.

Un segundo objeto de la presente invención se refiere a un modelo ex vivo de piel inflamada tal como se define en la reivindicación 10.

El uso del modelo ex vivo de piel inflamada de la invención en procedimientos para identificar compuestos que modulan la inflamación de la piel ofrece las ventajas de basarse en un modelo de fácil producción, que refleja con mayor precisión el entorno in vivo de la piel inflamada, reduciendo así los errores en los ensayos de cribado de compuestos en forma de falsos positivos y/o falsos negativos.

Así, el procedimiento según la invención también se dirige a evaluar la eficacia antiinflamatoria de un compuesto y comprende las siguientes etapas adicionales:

c) poner en contacto, con un compuesto candidato, el modelo ex vivo de piel inflamada obtenida al final de la etapa b) y que comprende células T polarizadas en LTh1 y/o LTh17;

d) medir el nivel de expresión de al menos dos marcadores de inflamación en el modelo ex vivo de piel inflamada; e) comparar el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación obtenidos en la etapa d) con su nivel de expresión de control;

f) identificar la eficacia antiinflamatoria de dicho compuesto candidato cuando el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación medidos en la etapa d) es inferior a su nivel de expresión de control. Con el procedimiento de la invención, se facilitará la búsqueda de antiinflamatorios efectivos para tratar la inflamación de la piel, y en particular la psoriasis.

Otro objeto más de la invención se refiere al uso de un modelo ex vivo de piel inflamada obtenido mediante el procedimiento de la invención con fines de cribado de compuestos candidatos antiinflamatorios, en particular compuestos candidatos capaces de tratar la psoriasis.

Finalmente, otro objeto de la invención se refiere a un kit que permite la puesta en práctica del procedimiento de la invención, comprendiendo dicho kit una biopsia de piel sana previamente extraída de un mamífero, una composición A que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2, una composición B que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGFp, y opcionalmente un dispositivo de inyección por infusión.

La solicitud internacional WO 2014/182655 (STIEFEL LABORATORIES INC) describe un método para cribar un compuesto capaz de modular la síntesis de citoquinas proinflamatorias en la piel humana, comprendiendo el método suministrar un cultivo de piel humana a la interfase líquido-aire, exponerlo a un compuesto a ensayar, la exposición de este cultivo de piel a condiciones de activación de células Th17, la medida de la síntesis de citoquinas proinflamatorias y la comparación de los valores encontrados con los de un cultivo de piel que no se ha puesto en contacto con el compuesto de ensayo.

VAN DEN BOGAARD et al. (J. Invest. Dermatol., vol.134(3), p:719-727, 2014) describen en efecto la activación de una subpoblación de células T CD4pos derivadas de sangre periférica que se lleva a cabo durante 5 h en contacto con perlas recubiertas con anticuerpos anti-CD3/CD28. Ahora bien, estas células T no son células T residentes de la dermis. KOENEN et al. (Blood, vol. 112 (6), p: 2340-2352, 2008) describen en detalle la selección de la subpoblación de células T CD4pos derivadas de sangre periférica y su activación por anticuerpos anti-CD3/CD28 en recubrimiento sobre perlas colocadas en el medio de cultivo de las células T. Ahora bien, estas células T no son células T residentes de la dermis.

Descripción de los dibujos

La figura 1 ilustra la inyección intradérmica manual (M) o por infusión (P) de una solución coloreada en una biopsia de piel y su difusión comparando el gradiente de intensidad de tinción obtenido por inyección manual o por infusión. La figura 2 compara las características histológicas de una biopsia de piel sana no tratada (C) o tratada según las etapas a) y b) del procedimiento de la invención (Th17/Th1). Las observaciones se realizaron 5 días (T5) o 7 días (T7) después del inicio de la incubación de la biopsia de piel sana inyectada procedente de la etapa a) del procedimiento de la invención en la solución de polarización. Después de 7 días de cultivo en presencia de una composición que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGFp, se observa la aparición de espongiosis (S) en la epidermis y el alargamiento de las crestas epidérmicas (E).

La figura 3 ilustra el análisis histológico de la presencia de células de Langerhans (CD207), células T residentes (CD3), células dendríticas (HLA-DR) y mastocitos (triptasa) en una biopsia de piel sana no tratada (T0) y mantenida en cultivo. durante 7 días (T7).

La figura 4 ilustra la secreción de las citoquinas proinflamatorias IL-17A e IL-22 por el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención que demuestra la presencia de LTh17 y LTh1 en los modelos tratados según las etapas a) y b) del procedimiento de la invención (Th17/Th1). Se compara una biopsia de piel sana no tratada (1 - NativeSkin®), una biopsia de piel sana cultivada en presencia del cóctel de polarización de la etapa b) del procedimiento de la invención (2 - NativeSkin® pro Th17/Th1), una biopsia de piel sana tratada según las etapas a) y b) del procedimiento de la invención (3 - InflammaSkin®). Los resultados se expresan en pg/ml.

La figura 5 ilustra las características histológicas de una biopsia de piel sana no tratada (C) o tratada según la etapa b) únicamente (IL-1 p+IL-23+TGFp) o según las etapas a) y b) (Anti-CD3+anti-CD28+IL-2+IL-1 p+IL-23+TGFp) del procedimiento de la invención y después de 7 días de cultivo. Estas biopsias no se trataron (1), se trataron con un gel placebo (2) o una crema placebo (4), o se trataron con uno de los dos inhibidores de la inflamación el dipropionato de betametasona (3) y el inhibidor de la fosfodiesterasa tipo 4 (5). Solo los tratamientos con los inhibidores de la inflamación (3 y 5) conducen a una ausencia total de anomalías histológicas en la epidermis, lo que sugiere una inhibición de la secreción de citoquinas proinflamatorias y por tanto de la diferenciación de las células LTh17/LTh1.

La Figura 6 ilustra la inhibición de la síntesis proteica de IL-17A en tratamiento profiláctico (A) o terapéutico (B). Se comparan el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1), o tratado con el gel placebo (2), el gel que comprende dipropionato de betametasona (3), la crema placebo (4) o la crema que comprende el inhibidor de la PDE4 (5). Los resultados se expresan en % respecto al modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1).

La Figura 7 ilustra la inhibición de la síntesis proteica de IL-22 en tratamiento profiláctico (A) o terapéutico (B). Se comparan el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1), o tratado con el gel placebo (2), el gel que comprende dipropionato de betametasona (3), la crema placebo (4) o la crema que comprende el inhibidor de la PDE4 (5). Los resultados se expresan en % respecto al modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1).

La Figura 8 ilustra la inhibición de la síntesis proteica de IFN^y en tratamiento profiláctico (A) o terapéutico (B). Se comparan el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1), o tratado con el gel placebo (2), el gel que comprende dipropionato de betametasona (3), la crema placebo (4) o la crema que comprende el inhibidor de la PDE4 (5). Los resultados se expresan en % respecto al modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1).

La Figura 9 ilustra la inhibición de la síntesis proteica de TNFa en tratamiento profiláctico (A) o terapéutico (B). Se comparan el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1), o tratado con el gel placebo (2), el gel que comprende dipropionato de betametasona (3), la crema placebo (4) o la crema que comprende el inhibidor de la PDE4 (5). Los resultados se expresan en % respecto al modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención sin tratar (1).

La figura 10 es una representación esquemática del modelo ex vivo de piel inflamada obtenida por el procedimiento de la invención. Un inserto de cultivo celular (10) cuyo fondo está compuesto de una membrana porosa (40) contiene el modelo ex vivo de piel inflamada (30) encerrada en una matriz solidificada (20). En una realización particular, el inserto para cultivo celular dispone de unos salientes (60) y un anillo compuesto por un material hidrofóbico (50) fijado en la superficie epidérmica de dicho modelo ex vivo de piel inflamada.

La figura 11 ilustra la capacidad de un anticuerpo anti-CD3 para incorporarse en células dérmicas de una biopsia de piel humana. Se comparan la inyección del anticuerpo anti-CD3e directamente en la dermis de la biopsia (Inyección intradérmica (II) - paneles de la izquierda), y la difusión del anticuerpo anti-CD3e colocado en el medio de cultivo en el que flota la biopsia de piel (Adición al medio de cultivo (AMC) paneles de la derecha). Se ensayaron dos biopsias separadas (repeticiones (R) 1 y 2). Las flechas blancas identifican las células dérmicas que han incorporado el anticuerpo anti-CD3. La estrella blanca muestra la presencia del anticuerpo anti-CD3 en la superficie de la epidermis de una de las biopsias de piel (panel superior derecho).

La figura 12 ilustra la localización subcelular de un anticuerpo anti-CD3 en células dérmicas de una biopsia de piel humana. El anticuerpo anti-CD3e se inyectó directamente en la dermis de la biopsia.

La figura 13 ilustra las características histológicas de una biopsia de piel no inflamada (C), inflamada según el procedimiento de la invención (I), inflamada y tratada mediante inyección subcutánea de un anticuerpo anti-TNF-a en tratamiento profiláctico (I anti-TNF-a - P) o tratamiento terapéutico (I anti-TNF-a -T).

La figura 14 ilustra la síntesis proteica de IL-22 por una biopsia de piel no inflamada (C), inflamada según el procedimiento de la invención (I), inflamada según el procedimiento de la invención y tratada mediante inyección subcutánea de un anticuerpo anti-TNF-a en tratamiento profiláctico (I anti-TNF-a - P) o en tratamiento terapéutico (I anti-TNF-a -T). Los resultados se expresan en pg/ml.

Descripción detallada de la invención

El objetivo de la invención es proponer una nueva herramienta para evaluar la actividad de un compuesto en la reducción de la inflamación de la piel.

Un primer objeto de la invención se refiere a un procedimiento in vitro para conseguir un modelo ex vivo de piel inflamada que comprende las siguientes etapas:

a) inyectar en la dermis de una biopsia de piel sana previamente tomada de un mamífero una composición que comprende una cantidad eficaz para activar las células T residentes de la dermis de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente de IL-2,

b) incubar la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a) en presencia de una composición que comprende una cantidad eficaz, para obtener la polarización de las células T activadas en la etapa a) en LTh 1 y/o LTh17 y la síntesis de marcadores de inflamación, de al menos una mezcla de IL-1 b, IL-23 y TGF-p.

Por "modelo ex vivo de piel inflamada” se indica una biopsia de piel que presenta características inflamatorias. La identificación de estas características inflamatorias se basa en la detección de la expresión de marcadores de inflamación, a nivel de proteínas o genes. Los marcadores de inflamación incluyen, pero no se limitan a, citoquinas, proteínas antibacterianas, proteínas implicadas en la biosíntesis de lípidos o cualquier otra molécula cuyo nivel de expresión varíe entre un estado inflamado y no inflamado (véase en particular SERHAN y WARD, Molecular and Cellular Basis of Inflammation, Humana Press). Las interleucinas incluyen, pero no se limitan a IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31 e IL-33, así como los receptores de interleucinas que incluyen, pero no se limitan a IL-10RA, IL-10Rb , IL-1R1, IL-5RA (CD125) e IL-9R. Las quimioquinas también incluyen, pero no se limitan a C5, eotaxina, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MiP-1 B, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10, L8rB y CXCL3, así como receptores de quimioquinas que incluyen, pero no se limitan a CCL13 (MCP-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCR1 y CXCR2. Además, son posibles otras citoquinas, tales como, pero no obstante no limitadas a MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL e IFNA1, así como otros genes implicados en la inflamación, incluyendo, pero no limitados a c D4, CD40, TNFSF5, FASLG, JAK2, JNK1, NFkB, RAG1, STAT1, proteínas de la familia S100 y la beta defensina.

Preferiblemente, el modelo ex vivo de piel obtenida por el procedimiento de la invención se considera como un modelo ex vivo de piel inflamada cuando los niveles de expresión de al menos dos, preferiblemente de al menos tres, y de manera particularmente preferida de al menos cuatro marcadores de inflamación elegidos entre los mencionados anteriormente, son superiores a los observados en una biopsia de piel sana (no inflamada y/o que no ha pasado por las etapas del procedimiento según la invención).

Preferiblemente también, el modelo ex vivo de piel inflamada obtenida por el procedimiento de la invención es comparable a las lesiones psoriásicas observadas en un paciente que padece psoriasis cuando, además de los marcadores de inflamación, se detecta la sobreexpresión de al menos un gen o su producto entre los 50 enumerados en la tabla S1 del artículo de Yao et al., PloSOne, 2008, 3(7), e2737 y que se incorporan aquí por referencia.

De forma especialmente preferida, el modelo ex vivo de piel inflamada obtenida por el procedimiento de la invención tiene niveles de expresión de proteínas y/o genes de al menos tres, preferiblemente de al menos cuatro, preferiblemente de al menos cinco, y de forma particularmente preferida de al menos seis marcadores de inflamación elegidos entre IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFN^y, TNFa, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18 y CCL20 que son más altos que los observado en una biopsia de piel sana.

Además de la presencia de marcadores de inflamación o la sobreexpresión de otros marcadores mencionados anteriormente, también se pueden observar cambios fisiológicos en los modelos ex vivo de piel inflamada obtenida por el procedimiento de la invención. Entre estos se observan, pero no se limitan a, una espongiosis de la epidermis, un alargamiento de las crestas epidérmicas en la dermis, presencia de núcleos picnóticos y vacuolización de citoplasmas en las células de la epidermis, incluso desprendimientos que sugieren muerte celular causada por inflamación.

Por “biopsia de piel”, se indica un fragmento de piel que comprende al menos la epidermis, la dermis y los anexos epidérmicos. Este fragmento de piel o biopsia también podrá comprender una porción del tejido subcutáneo también llamado hipodermis. La hipodermis se encuentra inmediatamente debajo de la dermis y forma un cojín protector que separa la piel de las membranas fibrosas que rodean los órganos más profundos, músculos, tendones y huesos. La hipodermis está formada por adipocitos, nervios, una red de capilares sanguíneos y linfáticos, un número limitado de fibroblastos implicados en la síntesis de los componentes de la matriz extracelular y células inmunitarias tales como células dendríticas y macrófagos. La hipodermis se divide en lóbulos adiposos que contienen adipocitos y están separados por tabiques conjuntivos que permiten el paso de nervios y vasos. Las funciones de la hipodermis son aislar, proporcionar una reserva de energía a las células de la piel y absorber las tensiones físicas. Además, los estudios han demostrado el importante papel que juega el transporte linfático en la absorción de fármacos basados en péptidos.

Preferiblemente, la biopsia de piel tiene un espesor que varía de 1 milímetro (mm) a 1 centímetro (cm), más particularmente de 3 mm a 1 cm, aún más particularmente de 3 mm a 8 mm y aún más particularmente de 5 mm a 7 mm. Se obtiene un espesor que puede llegar hasta 1 cm para biopsias de piel que comprenden epidermis, dermis, anexos epidérmicos e hipodermis. En cualquier caso, el espesor de la biopsia de piel no es inferior a 1 mm.

Preferiblemente, dicha biopsia de piel se toma de un animal, en particular de un mamífero y, preferiblemente, de un ser humano. Como biopsias utilizables en el procedimiento de la invención se pueden citar las procedentes de residuos quirúrgicos o de mataderos. Por “residuos quirúrgicos”, se entiende muestras de piel obtenidas por un acto de cirugía estética, en particular después de blefaroplastia, rinoplastia, abdominoplastia o reducción de senos. Las técnicas de toma de biopsias de piel son bien conocidas por los expertos en la técnica.

Para asegurar su supervivencia in vitro, la toma debe haberse realizado en un plazo de 1 h y menos de 72 h, preferiblemente entre 1 h y menos de 48 h antes de la inyección de una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2.

Por “biopsia de piel sana”, se indica un fragmento de piel que no presenta ningún signo de inflamación perceptible a simple vista (es decir, grieta de la piel, enrojecimiento, hinchazón, calor o descamación excesiva, etc.) o no expresa ningún marcador de inflamación. Además, es imprescindible que la biopsia de piel sana utilizada en el método de la invención proceda de un individuo que no presente ninguna patología dermatológica, en particular inflamatoria.

Preferiblemente, la biopsia de piel es de forma cilíndrica.

Sin embargo, cualquier otra forma geométrica de biopsia de piel también es adecuada para el procedimiento según la invención, en particular una forma cuadrada, rectangular, ovalada, triangular, etc...

Preferiblemente, la forma cilíndrica tiene un diámetro que varía de 1 mm a 50 mm, más particularmente de 5 mm a 20 mm, aún más particularmente de 7 mm a 17 mm, y un espesor que varía de 1 mm a 20 mm, más particularmente de 2 mm a 15 mm, aún más particularmente de 2 mm a 10 mm, y aún más particularmente de 2 mm a 5 mm.

Por "dermis" se indica el tejido subyacente de la epidermis que contiene redes vasculares y nerviosas densas, así como anexos queratinizados que se extienden por la epidermis, este tejido también incluye los folículos pilosos, las glándulas sebáceas y las glándulas sudoríparas.

La dermis se subdivide en dos partes que difieren en la composición y organización de su respectiva matriz extracelular. La dermis papilar se encuentra directamente debajo de la epidermis. Es un tejido conjuntivo laxo formado por finas fibrillas de colágeno tipo I y III y fibras elásticas que se orientan perpendicularmente a la epidermis formando así estructuras en forma de vela. La dermis reticular, situada debajo de la dermis papilar, es también un tejido conjuntivo compuesto por un entrecruzamiento de haces de grandes fibras de colágeno y fibras elásticas que presentan una orientación preferiblemente paralela a la superficie de la piel. La dermis reticular contiene menos colágeno tipo III que la dermis papilar.

Por “inyectar en la dermis”, se entiende la inyección, introducción o inoculación de una composición directamente en la estructura de la dermis de una biopsia de piel sana. Esta inyección en la dermis se realiza con ayuda de un dispositivo de inyección, en particular una aguja hueca, biselada o no, desprovista de volumen muerto, o cualquier otro dispositivo mecánico equivalente conocido por el experto en la técnica.

Preferiblemente, la inyección se realiza en la dermis reticular con el fin de evitar cualquier traumatismo en la epidermis. En las biopsias de piel utilizadas en el procedimiento de la invención, la presencia bajo la dermis de los anexos epidérmicos y opcionalmente de la hipodermis, les confiere un espesor que limita el riesgo de desgarro durante una inyección.

Una inyección en la dermis de las biopsias del documento WO 2014/182655 A1 presentaría un mayor riesgo de desgarro en la medida en que estas biopsias desprovistas de hipodermis y cortadas con dermatomo tienen un espesor de 750 pm (SMITH et al., PLoS One. 2016 12 de febrero; 11(2):e0147979).

La principal ventaja de una inyección de una composición directamente en la estructura de la dermis de una biopsia de piel sana es permitir una difusión más homogénea y más rápida de esta composición en todos los tejidos de la biopsia y, en consecuencia, una mejor activación de las células T residentes de la dermis. Dichos resultados no podrían obtenerse por simple difusión pasiva de la composición tal como la que se usa en el documento WO 2014/182655 A1.

Preferiblemente de nuevo, la etapa de inyección se lleva a cabo a temperatura ambiente.

El volumen de la composición inyectada en la dermis varía en función del tamaño o la superficie de la biopsia de piel sana, en particular su diámetro si esta última tiene forma cilíndrica.

Preferiblemente, cuando el diámetro de la biopsia de piel sana es inferior o igual a 8 mm, el volumen de composición inyectado es inferior o igual a 10 pl.

Preferiblemente, cuando el diámetro de la biopsia de piel sana es inferior o igual a 15 mm, el volumen de composición inyectado es inferior o igual a 35 pl.

Preferiblemente, el volumen de la composición inyectada es de al menos 5 pl.

Es importante, durante la inyección, no dañar la epidermis. Un resultado así solo se puede obtener si la biopsia de piel tiene un espesor de al menos 1 mm, preferiblemente de al menos 2 mm, y más preferiblemente aún de al menos 3 mm.

Preferiblemente, la inyección de la composición se puede realizar manualmente o por infusión.

Según una realización particular, la inyección de la composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente de IL-2 en la dermis de la biopsia de piel sana se realiza manualmente.

La inyección de la composición que comprende un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2 en la dermis de la biopsia de piel sana permite la incorporación de los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, y opcionalmente de IL-2, en las células dérmicas.

Según otra realización particular, la inyección de la composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente de IL-2 en la dermis de la biopsia de piel sana se realiza por infusión, con una caudal que varía de 4 a 12 pl/hora. En esta realización particular, la inyección puede durar varias horas. Con el fin de asegurar un caudal constante, es posible el uso de una bomba osmótica o cualquier otro sistema de difusión de líquido controlado.

A diferencia de una inyección manual, la inyección por infusión permite una difusión más homogénea de la composición en la dermis de la biopsia de piel. Por "difusión más homogénea" se entiende una reducción del gradiente de concentración de los compuestos de la composición desde el punto de inyección hacia el borde (es decir, el diámetro externo) de la biopsia. Además, la inyección por infusión asegura una mejor reproducibilidad.

Por "anticuerpo anti-CD3" se entiende cualquier anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse específicamente al antígeno CD3. CD3 es un complejo de proteína de membrana presente en la superficie de las células T nai've y formado por una cadena y, una cadena 5 y dos cadenas £. Al asociarse con el receptor de células T (TCR) y con una cadena complementaria Z, CD3 permite la formación del complejo TCR capaz de transducir una señal intracelular. Existen formas comerciales del anticuerpo anti-CD3, por ejemplo el clon UCHT1 (THERMO FISHER 16-0038-81, MERCK MILLIPORE CBL150), o el clon APA1/1 (MERCK MILLIPORE 05-785, THERMO FISHER MA1-10182).

Preferiblemente, la concentración de anticuerpos anti-CD3 en la composición inyectada en la etapa a) varía de 10 ng/pl a 100 ng/pl, preferiblemente de 20 ng/pl a 80 ng/pl, y de forma particularmente preferida de 30 ng/pl a 70 ng/pl.

Según una realización particular, la concentración de anticuerpos anti-CD3 en la composición inyectada en la etapa a) es igual a 50 ng/pl.

Por “anticuerpo anti-CD28” se entiende cualquier anticuerpo o fragmento del mismo capaz de unirse específicamente al antígeno CD28. CD28 es una proteína coestimuladora presente en particular en la superficie de las células T e implicada en su supervivencia, su expansión clonal, su actividad metabólica, así como en la producción de IL-2. Existen formas comerciales del anticuerpo anti-CD28, por ejemplo el clon 15E8 (M iLTENYI BIOTEC 130-093-375) o el clon CD28.6 (THERMO FISHER 16-0288-81)

Preferiblemente, la concentración de anticuerpos anti-CD28 en la composición inyectada en la etapa a) varía de 10 ng/pl a 100 ng/pl, preferiblemente de 20 ng/pl a 80 ng/pl, y de forma particularmente preferida de 30 ng/pl a 70 ng/pl.

Según una realización particular, la concentración de anticuerpos anti-CD28 en la composición inyectada en la etapa a) es igual a 50 ng/pl.

Según una realización más particular, el anticuerpo anti-CD3 y el anticuerpo anti-CD28 se sustituyen por un único anticuerpo biespecífico que posee un primer fragmento ScFV dirigido específicamente contra CD3 y un segundo fragmento ScFV dirigido específicamente contra CD28. Este anticuerpo biespecífico tiene actividades de unión a los antígenos CD3 y CD28 y funciones de activación de células T residentes comparables a las de los anticuerpos monoespecíficos anti-CD3 y anti-CD28.

Por “IL-2” se indica interleucina 2, que es una citoquina que actúa sobre la mitosis y, en consecuencia, sobre la proliferación de células portadoras del receptor de IL-2, en particular las células T auxiliares.

Preferiblemente, la concentración de IL-2 en la composición inyectada en la etapa a) varía de 1 ng/ml a 20 ng/ml, preferiblemente de 2 ng/ml a 15 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 4 ng/ml a 12 ng/ml.

Según una realización particular, la concentración de IL-2 en la composición inyectada en la etapa a) es igual a 10 ng/ml.

En las horas siguientes a la inyección de la composición que comprende un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2, en la dermis de la biopsia de piel sana, las subpoblaciones de células T CD4+ y/o CD8+ nai've o de memoria residentes de la dermis se activan y potencialmente se amplifican. Dado que estas células están limitadas en número y distribuidas aleatoriamente en la dermis, es importante que la composición se difunda homogéneamente por toda la dermis y, opcionalmente, en la epidermis de la biopsia.

Por “cantidad eficaz”, se indica una cantidad suficiente para obtener el efecto esperado. Esta noción de cantidad eficaz es aplicable al anticuerpo anti-CD3, al anticuerpo anti-CD28 y también a la IL-2. En el sentido de la presente invención y en relación con la etapa a), “el efecto esperado” es la activación de las células T residentes de la dermis. Este efecto se mejora cuando la inyección de la composición se realiza por infusión.

La activación de las células T residentes de la dermis puede demostrarse directamente mediante el uso de marcadores de activación, tales como por ejemplo, pero no limitados a CD69.

Las cantidades eficaces de anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD28 e IL-2 varían en función del tamaño de la biopsia de piel.

Como ejemplo de cantidad eficaz, se puede mencionar el uso de volúmenes de inyección en relación con las concentraciones citadas anteriormente.

Según una realización particular, las cantidades eficaces de anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD28 y de IL-2 en la composición inyectada en la dermis de la biopsia de piel sana en la etapa a) del procedimiento de la invención son respectivamente 500 ng, 500 ng y 0,1 ng para una biopsia de diámetro igual a 8 mm.

Según otra realización particular, las cantidades eficaces de anticuerpos anti-CD3, anticuerpos anti-CD28 y de IL-2 en la composición inyectada en la dermis de la biopsia de piel sana en la etapa a) del procedimiento de la invención son respectivamente 1750 ng, 1750 ng y 0,35 ng para una biopsia de diámetro igual a 15 mm.

Según una realización particular, el procedimiento in vitro según la invención comprende, previa a la etapa b), una etapa a’) de depositar la biopsia de piel inyectada obtenida al final de la etapa a) sobre una matriz líquida adecuada para solidificar, estando dicha matriz a su vez contenida en un inserto para cultivo celular cuyo fondo está formado por una membrana porosa y estando dicho inserto dispuesto en un recipiente o pocillo, de manera que permite, una vez que la matriz ha solidificado, el mantenimiento de la integridad 3D de la biopsia de piel.

Por “matriz líquida adecuada para solidificar”, se indica cualquier solución líquida que comprende al menos un compuesto o una composición específica cuya concentración en dicha solución líquida es tal que, cuando se dan las condiciones adecuadas, en particular condiciones particulares de temperatura, la solución líquida toma una consistencia de tipo sólido o gelificado. Dicho compuesto o una composición específica puede ser de origen animal, vegetal o sintético, su naturaleza y su concentración se determinan en función de las características fisicoquímicas deseadas de la matriz cuando solidifica, en particular la flexibilidad y la resistencia de la matriz.

Según una realización del procedimiento según la invención, en la etapa a'), dicha matriz líquida adecuada para solidificar se elige entre cualquier solución líquida, preferiblemente nutritiva, capaz de solidificar o gelificar en unas condiciones particulares compatibles con la supervivencia y el cultivo de células de piel que componen dicha biopsia de piel, preferiblemente elegidas entre plasma sanguíneo o una solución derivada de plasma sanguíneo, en particular diluidas en tampón fisiológico hasta un máximo de 10%, preferiblemente hasta al menos 20%, al menos 30% y 40%, una solución de fibrinógeno, una solución de colágeno, gelatina, geles poliméricos sintéticos, naturales tales como geles de agarosa, en particular geles de agarosa o agar-agar de débil/bajo punto de fusión, geles de almidón o polisacáridos, o una de sus mezclas.

Las matrices adecuadas para solidificar y los métodos para poner las biopsias de piel en ellas se detallan en la solicitud de patente europea n.° EP 2882290 A1 y se incorporan aquí por referencia.

La matriz adecuada para solidificar tiene como finalidad poner en cultivo la biopsia de piel inyectada obtenida al final de la etapa a) del procedimiento de la invención y facilitar su manipulación. Por “poner en cultivo”, se indica el mantenimiento del estado fisiológico y morfológico de la biopsia de piel, es decir, de la totalidad de los tejidos y células que la componen.

La matriz adecuada para solidificar también tiene por objeto permitir la conservación y/o el transporte de la biopsia de piel en la que las células T residentes han sido activadas por el procedimiento según la invención.

La naturaleza de la matriz adecuada para solidificar debe permitir mantener con vida las células de la biopsia de piel, es decir, no tener ningún efecto citotóxico y tener una temperatura de solidificación/polimerización a temperatura ambiente (es decir, de 15°C a 25°C).

En una realización particular, la matriz adecuada para solidificar es una solución de fibrinógeno humano.

Según una realización particular, el procedimiento in vitro según la invención comprende, previa a la etapa a'), una etapa a") de fijación, a la superficie epidérmica de la biopsia de piel inyectada obtenida al final de la etapa a), de un anillo, o disco perforado en su centro, formado por un material hidrófobo, siendo el diámetro exterior de dicho anillo mayor que el diámetro de la superficie epidérmica de la biopsia de piel y siendo el diámetro interior de dicho anillo inferior al diámetro de la superficie epidérmica de la biopsia de piel.

Preferiblemente, el material hidrófobo del anillo es un material no tóxico para la piel, puede ser un polímero de parafina, del tipo Parafilm® (SIGMA), o un polímero de silicona. Según una realización particular, el anillo se prepara a partir de una película de material hidrofóbico, perforando esta película según las dimensiones deseadas.

El espesor del anillo es preferiblemente entre 0,1 mm y 2 mm, preferiblemente entre 0,1 y 1 mm, más preferiblemente entre 0,1 y 0,5 mm, y aún más preferiblemente entre 0,12 y 0,2 mm.

Dicho anillo puede estar formado por un material opaco o translúcido. Según una realización particular, el anillo está formado por un material opaco.

Según una realización más particular, dicho anillo se fija a la superficie epidérmica de la biopsia mediante pegamento, preferiblemente añadido a la superficie inferior del anillo. Dicho pegamento puede elegirse entre cualquier tipo de material que no sea tóxico para la piel y tenga el efecto de adherir el anillo a la piel, pudiendo ser este material silicona. Preferiblemente, dicho pegamento es hidrofóbico.

Los materiales, pegamentos y procedimientos de fijación de este anillo hidrofóbico se detallan en la solicitud de patente europea n.° EP 2882290 A1 y se incorporan aquí por referencia.

Por “incubar la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a)”, se indica la etapa que consiste en poner la biopsia de piel inyectada previamente a nivel de la dermis con la composición que comprende una cantidad eficaz de anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente de IL-2, en un medio de cultivo que contenga todos los elementos necesarios para su supervivencia. La etapa b) se realiza por tanto poniendo en contacto la biopsia de piel obtenida al final de la etapa a) con un medio de cultivo que contiene todos los elementos necesarios para su supervivencia.

Durante esta etapa b), las células T residentes de la dermis que han sido activadas al final de la etapa a) además se polarizan en células LTh1 y/o LTh17. Por "polarizar", se indica la diferenciación de las células T residentes activadas hacia los linajes de linfocitos T auxiliares LTh1 y/o LTh17.

Por “células Th1”, se indica la subpoblación de células T procedentes de la diferenciación de células T CD4+ nai've bajo el efecto de las citoquinas IL-12 e IFN-g y que presentan un perfil de síntesis de citoquinas específico para esta subpoblación, concretamente, IFN-^y, TNF-a e IL-2.

Por “células Th17”, se indica la subpoblación de células T resultante de la diferenciación de las células T CD4+ y/o CD8+ nai've o de memoria bajo el efecto de las citoquinas TGF-p, IL-6, IL-1 e IL-23 y que presentan un perfil de síntesis de citoquinas específico de esta subpoblación, concretamente IL-17 e IL-22.

La medición de la producción de citoquinas específicas de estas dos subpoblaciones de células Th1 y/o Th17 está directamente relacionada con el número de estas células.

Esta diferenciación se induce añadiendo al medio de cultivo de las biopsias de piel sana en las que se ha inyectado previamente tal como se define en la etapa a) del procedimiento de la invención, una composición que comprende una cantidad eficaz de al menos una mezcla de interleucina-1beta (IL-1 p), interleucina-23 (IL-23) y factor de crecimiento transformante beta (TGF-p).

Por “interleucina-1beta”, se indica una proteína de aproximadamente 30 KDa resultante de la proteólisis por caspasa 1 de un precursor secretado naturalmente por macrófagos y células dendríticas en respuesta a un ataque bacteriano. Esta citoquina es un importante mediador de la respuesta inflamatoria y está implicada en numerosas actividades celulares que incluyen proliferación, diferenciación y apoptosis.

Por “interleucina-23”, se indica una proteína heterodimérica de aproximadamente 60 KDa compuesta por una subunidad p19 específica de la IL-23 y una subunidad p40 común a IL12. Al unirse a un receptor heterodimérico IL12RB1 e IL23R presentes en la superficie de ciertas subpoblaciones de células T, esta citoquina permite la estimulación de células T de memoria que conducen a la síntesis de citoquinas proinflamatorias.

Por “TGF-p”, se indica una proteína dimérica de 25 KDa correspondiente a la forma madura de una citoquina sintetizada en forma de precursor. Esta citoquina es secretada por un gran número de células, incluidos los macrófagos, y ejerce efectos pleiotrópicos sobre las células que se extienden desde la proliferación hasta la apoptosis. El TGF-p también juega un papel muy importante en la regulación de la inflamación.

Por "cantidad eficaz", en el sentido de la presente invención y en relación con la etapa b), se entiende una cantidad eficaz de IL-1 p, IL-23 y TGF-p para obtener la polarización de las células T activadas en la etapa a) en LTh1 y/o LTh17 y la síntesis de marcadores de inflamación.

Preferiblemente, la concentración de IL-1 p en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención varía de 1 ng/ml a 50 ng/ml, preferiblemente de 5 ng/ml a 30 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 7 ng/ml a 15 ng/ml.

Según una realización particular, la concentración de IL-1 p en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención es de 10 ng/ml.

Preferiblemente, la concentración de IL-23 en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención varía de 10 ng/ml a 100 ng/ml, preferiblemente de 20 ng/ml a 80 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 30 ng/ml a 60 ng/ml.

Según una realización particular, la concentración de IL-23 en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención es de 50 ng/ml.

Preferiblemente, la concentración de TGF-p en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención varía de 1 ng/ml a 50 ng/ml, preferiblemente de 5 ng/ml a 30 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 7 ng/ml a 15 ng/ml.

Según una realización particular, la concentración de TGF-p en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención es de 10 ng/ml.

Según una realización más particular, las concentraciones de IL-1 p, IL-23 y TGF-p en la mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención son respectivamente de 10 ng/ml, 50 ng/ml y 10 ng/ml.

La etapa b) del procedimiento de la invención se lleva a cabo a 37°C en una incubadora de CO² durante un período de tiempo lo suficientemente largo como para permitir la polarización de las células TCD4+ activadas de la dermis en células Th1 y/o Th17.

Preferiblemente, la etapa b) de incubación de la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a) en presencia de una composición que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGFp se lleva a cabo durante un período de al menos 3 días, preferiblemente entre 3 y 10 días.

Preferiblemente, la duración de la incubación de la etapa b) del procedimiento de la invención no puede ser inferior a 5 días.

Según una realización particular, la duración de la etapa b) de incubación de la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a) en presencia de una composición que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p es de 7 días.

Preferiblemente, la composición que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención se renueva frecuentemente con el fin de mantener una concentración constante de los componentes de la mezcla, siendo su semivida en solución de algunos minutos a algunas horas.

Según una realización particular, la composición que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p utilizada en la etapa b) del procedimiento de la invención se renueva diariamente durante toda la duración de esta etapa.

Según otra realización particular, el procedimiento según la invención también tiene como objetivo evaluar la eficacia antiinflamatoria de un compuesto y comprende las siguientes etapas complementarias:

c) poner en contacto, con un compuesto candidato, el modelo de piel inflamada obtenida al final de la etapa b) que comprende células T polarizadas en LTh1 y/o LTh17;

d) medir el nivel de expresión de al menos dos marcadores de inflamación en el modelo de piel inflamada;

e) comparar el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación obtenidos en la etapa d) con su nivel de expresión de control;

f) identificar la eficacia antiinflamatoria de dicho compuesto candidato cuando el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación medidos en la etapa d) es inferior a su nivel de expresión de control.

Por "eficacia antiinflamatoria" se indica la capacidad de un compuesto para reducir la inflamación, como por ejemplo, pero no limitado a reducir la producción de citoquinas proinflamatorias, promover la síntesis de citoquinas antiinflamatorias, modular la proliferación de células del sistema inmunitario.

Por "compuesto candidato" se indica cualquier compuesto químico sintético o natural elegido por su uso potencial como modulador de la inflamación. Los compuestos candidatos pueden estar purificados o mezclados. Los compuestos candidatos incluyen moléculas pequeñas, macromoléculas y polímeros. En algunas realizaciones, un compuesto candidato puede ser una molécula producida por síntesis química o contenida en una biblioteca combinatoria. En algunas realizaciones, un compuesto candidato puede ser una molécula o macromolécula cuya estructura se diseña por ordenador o análisis tridimensional. El compuesto candidato también comprende extractos brutos o purificados de fuentes orgánicas (por ejemplo, extractos de animales, extractos vegetales y lisados microbianos). Los compuestos candidatos utilizados en la práctica del procedimiento de la invención se pueden combinar con un tampón inerte (por ejemplo, una solución salina) o un disolvente adecuado (por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO), alcoholes tales como metanol y etanol, soluciones acuosas o cualquier otro compuesto utilizado en composiciones cosméticas.

Por "marcador de inflamación" se indica un elemento expresable, o el elemento expresado por este último, que presenta un cambio en el nivel de expresión en una célula, un tejido o un órgano que está inflamado en relación con una célula, un tejido o un órgano que no está inflamado. Algunos marcadores de inflamación presentan diferencias estadísticamente significativas (p<0,10) en el nivel de expresión en las células, tejidos u órganos inflamados en relación con células, tejidos u órganos no inflamados. Por ejemplo, un "marcador de inflamación" puede ser un gen, un fragmento de gen o una región codificante expresado en un nivel diferente en células contenidas en un tejido inflamado en relación con células del mismo tipo contenidas en un tejido similar que no está inflamado. Un “marcador de inflamación” puede corresponder a una producción de ARN (por ejemplo, un ARNm) o a una producción de proteínas, medida por la presencia física de la proteína o por una actividad característica de esta proteína. Una lista de marcadores inflamatorios se proporciona más arriba en la descripción.

Dependiendo de la naturaleza del marcador de inflamación (ARNm o proteína), se aplicarán métodos de detección bien conocidos por los expertos en la técnica. Entre estos, pero sin limitarse a ellos, se pueden citar las transferencias western o ensayos tipo ELISA para la detección de proteínas. La expresión de ARNm de genes de interés se puede determinar utilizando técnicas de micromatrices, RNA-Seq o de secuenciación NextGen. También es posible medir los marcadores de inflamación directamente en el medio de cultivo del modelo de piel inflamada, en todo o parte del modelo de piel inflamada, o específicamente en la dermis o la epidermis o incluso en ciertos subtipos celulares de la dermis y/o de la epidermis.

La puesta en contacto del compuesto candidato con el modelo de piel inflamada durante la etapa c) puede realizarse por vía tópica o directamente en el medio de cultivo. En el caso de aplicación tópica, la superficie de la epidermis del modelo ex vivo de piel inflamada obtenida al final de las etapas a) y b) del procedimiento de la invención se seca (es decir, se eliminan los posibles restos de líquidos sobre la epidermis) antes de la aplicación del compuesto candidato.

También es posible que esta etapa de poner en contacto el compuesto candidato con el modelo de piel inflamada durante la etapa c) se lleve a cabo mediante inyección subcutánea. Tal realización está particularmente indicada para compuestos candidatos que tienen un alto peso molecular, son muy hidrófilos o se degradan fácilmente. A modo de ejemplo, tales compuestos pueden ser compuestos candidatos de naturaleza proteica, en particular anticuerpos.

Preferiblemente, la etapa c) de poner en contacto el compuesto candidato con el modelo de piel inflamada puede tener una duración que varía de unos minutos a unas horas, o incluso unos días. Dependiendo de la naturaleza, estabilidad, solubilidad o cualquier otra propiedad fisicoquímica del compuesto candidato, este contacto también puede renovarse diariamente durante un período total de 7 días.

Preferiblemente, durante la etapa d) del procedimiento de la invención, se procederá a medir el nivel de expresión de al menos tres, preferiblemente al menos cuatro, y de manera particularmente preferida de al menos cinco marcadores de inflamación.

Los marcadores de inflamación son como se definen anteriormente.

Según una realización particular, la etapa d) también comprende medir el nivel de expresión de al menos tres, preferiblemente de al menos cuatro, en particular de al menos cinco y, de manera particularmente preferida, de al menos seis marcadores de inflamación elegidos entre IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFN^y, TNFa, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18 y CCL20.

El nivel de expresión de control se puede medir en el modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención en la etapa b), y antes de la etapa c) de ponerlo en contacto con el compuesto candidato.

El nivel de expresión de control también se puede medir en una o más muestras de piel inflamada, en particular lesiones psoriásicas, tomadas de uno o más pacientes que padecen patologías inflamatorias de la piel, en particular psoriasis.

Preferiblemente, al final de la etapa f) del procedimiento de la invención, se seleccionarán los compuestos candidatos que están asociados a una disminución de los niveles de expresión proteica y/o génica de al menos dos marcadores de inflamación de al menos 10%, preferiblemente al menos 30%, preferiblemente al menos 50% y de forma particularmente preferida al menos 80%.

Tal procedimiento permite identificar los compuestos que tienen un efecto terapéutico en una inflamación ya existente.

Tal efecto no se puede medir según el modelo desarrollado en el documento WO 2014/182655 A1. De hecho, parece que este modelo solo puede analizarse en el mejor de los casos 48 h después de la activación de las células T residentes de la dermis.

También es posible ensayar la eficacia de un compuesto para prevenir la aparición de la inflamación.

Según todavía otra realización particular, las etapas b) y c) del procedimiento de la invención se realizan simultáneamente para evitar la aparición de inflamación en el caso de que el compuesto candidato ensayado tenga un efecto antiinflamatorio.

También es posible ensayar la eficacia profiláctica de un compuesto.

En este caso, se invierte el orden de las etapas a), b) y c) del procedimiento de la invención de manera que se evita la aparición de la inflamación. En esta realización, el contacto del compuesto candidato con el modelo de piel se produce antes de las etapas a) de activación y b) de polarización de las células T residentes de la dermis.

El procedimiento de la invención también se puede usar como complemento de otros ensayos de cribado de compuestos candidatos que modulan la inflamación de la piel, como, por ejemplo, pero no limitados a ensayos in vitro en subpoblaciones celulares de la piel, ensayos enzimáticos o incluso ensayos ex vivo realizados en biopsias de piel procedentes de pacientes con una patología inflamatoria de la piel (es decir, dermatitis, lesiones psoriásicas, etc.).

Otro objeto de la invención se refiere a un modelo ex vivo de piel inflamada que comprende una dermis, una epidermis, anexos epidérmicos, una hipodermis y células Th1 y/o Th17 y se caracteriza por la expresión a nivel de proteínas de al menos dos marcadores de inflamación y de al menos tres, en particular de al menos cuatro, preferiblemente de al menos cinco y, de forma particularmente preferida, de al menos seis marcadores de inflamación elegidos entre IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNy, TNFa, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18 y CCL20.

Con el fin de optimizar su mantenimiento en supervivencia ex vivo, su manipulación y transporte, dicho modelo ex vivo de piel inflamada puede colocarse en una matriz solidificada que mantiene la epidermis en contacto con el aire, estando contenida dicha matriz en un inserto para cultivo celular.

Otro objeto de la invención se refiere a un inserto para el cultivo celular (10), adecuado para estar contenido en un recipiente o en pocillos de la placa de cultivo, y cuyo fondo está formado por una membrana porosa (40), conteniendo dicho inserto el modelo ex vivo de piel inflamada (30) encerrado en una matriz solidificada (20), estando dicha matriz en contacto con el borde interno del inserto y la membrana porosa, estando la epidermis del modelo ex vivo de piel inflamada en contacto con la atmósfera y la dermis y estando los anexos epidérmicos del modelo ex vivo de piel inflamada sumergidos en la matriz solidificada.

Según una realización particular, dicho inserto para cultivo celular, cuyo fondo está constituido por una membrana porosa, es un inserto en forma de barquilla (es decir, de U), preferiblemente cuyo diámetro está comprendido entre 5 y 40 mm, de forma más preferida entre 9,5 y 30 mm.

Según otra realización particular, dicho inserto para cultivo celular (10), es adecuado para estar contenido en un recipiente o pocillo de una placa de cultivo, y cuyo fondo está constituido por una membrana porosa (40), conteniendo dicho inserto la biopsia de piel sana inyectada obtenida al final de la etapa a) del procedimiento de la invención (30) encerrada en una matriz solidificada (20), estando dicha matriz en contacto con el borde interno del inserto y la membrana porosa, estando la epidermis de la biopsia de piel en contacto con la atmósfera y la dermis y estando los anexos epidérmicos de la biopsia de piel sumergidos en la matriz solidificada. Opcionalmente, la matriz solidificada también contiene al menos la mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p.

Más preferiblemente, dicho inserto para cultivo celular es un inserto suspendido o sobre pilotes, preferiblemente suspendido gracias a la presencia de pestañas (60).

Según otra realización particular, se fija un anillo hidrófobo (50) a la superficie epidérmica del modelo ex vivo de piel inflamada.

Preferiblemente aún, dicha membrana porosa es una membrana con una porosidad que permite evitar que la matriz líquida fluya a través de la membrana antes de su solidificación, variando preferiblemente entre 0,4 y 8 pm, más preferiblemente entre 0,4 y 1,5 pm, siendo entre 0,8 pm y 1,2 pm la porosidad preferida.

Preferiblemente aún, dicha membrana porosa es una membrana elegida entre poli(tereftalato de etileno) (PET), nitrocelulosa o policarbonato.

Entre los insertos para cultivo celular, se pueden mencionar los suministrados en particular por la empresa NUNC (Roskilde, Dinamarca), BD Falcon (b Ec t On DICKINSON Francia SAS, 38801 Le Pont-De-Claix, Francia, Millicell® (EMD MILLIPORE CORPORATION, Billerica, MA, EE. UU.) o Costar® (Grosseron SAS, 44819 Saint-Herblain Francia), por ejemplo insertos con membrana de policarbonato, PET o nitrocelulosa preenvasados en placas de multipocillos de 6, 8, 12 y 24 pocillos y cuya porosidad de la membrana puede variar entre 0,4 y 8 pm, siendo las más preferidas las placas de 8 pocillos y/o con una porosidad de membrana de 0,8 pm a 1 pm y/o en PET.

Según una realización particular, dicho recipiente en el que se deposita dicho inserto para cultivo celular es un pocillo de una placa de cultivo celular de 6, 8, 12, 24 o 48 pocillos.

Entre estas placas de cultivo, se pueden citar las suministradas en particular por la empresa NUNC, BD FALCON, o bajo las referencias Millicell® o Costar®.

Preferiblemente, el fondo del inserto para cultivo celular está situado a una distancia comprendida entre 1 mm y 2,5 mm del fondo del recipiente que contiene dicho inserto, en particular del fondo del pocillo de la placa de cultivo (o del fondo de la placa de Petri según el nombre).

Una ventaja del modelo de piel inflamada de la invención es poder realizar el cribado de compuestos antiinflamatorios a gran escala, en particular utilizando varias tomas de muestras repetidas (es decir, biopsias) de piel sana procedentes del mismo donante o de diferentes donantes Se puede cribar una pluralidad de compuestos candidatos, desde varias decenas hasta varios cientos, incluso varios miles. El interés de obtener modelos de piel inflamada a partir de varios donantes es poder comparar la modulación interindividual de los niveles de marcadores de inflamación y así identificar los compuestos candidatos que son los más activos para reducir la inflamación de la piel.

Otro objeto más de la invención se refiere al uso del modelo ex vivo de piel inflamada que se puede obtener por el procedimiento descrito anteriormente para la identificación de compuestos que presentan un efecto antiinflamatorio. La estructura del modelo ex vivo de piel inflamada que puede obtenerse por el procedimiento descrito anteriormente permite una correcta difusión de los compuestos que presentan un efecto antiinflamatorio tras inyección subcutánea o aplicación tópica, influyendo de hecho en su biodisponibilidad.

Los compuestos identificados según este uso de la invención pueden servir como base para el desarrollo de tratamientos terapéuticos para un paciente que sufre inflamación aguda o crónica de la piel. Tal uso según la invención permite prever una terapia que puede personalizarse de un paciente a otro en función de la intensidad del efecto antiinflamatorio de los diferentes compuestos ensayados sobre los modelos de piel inflamada obtenidos por el procedimiento de la invención.

Entre las patologías inflamatorias de la piel, se hará mención, pero sin limitarse a, la dermatitis atópica, psoriasis, eccema, dermatosis, dermatitis alérgica de contacto, liquen, prurito, síndrome de Netherton, ictiosis vulgar, etc. Según una realización particular de la invención, el modelo ex vivo de piel inflamada que se puede obtener por el procedimiento descrito anteriormente permite la identificación de compuestos destinados a tratar la psoriasis.

Otro objeto de la invención se refiere a un kit para la puesta en práctica del procedimiento de la invención, comprendiendo dicho kit una biopsia de piel sana previamente tomada de un mamífero, una composición A que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y de un anticuerpo anti-CD28. anticuerpo, y opcionalmente de IL-2, de una composición B que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGFp, y opcionalmente un dispositivo de inyección, en especial por infusión.

Preferiblemente, la cantidad eficaz de anti-CD3 en la composición A varía de 10 ng/pl a 100 ng/pl, preferiblemente de 20 ng/pl a 80 ng/pl, y de forma particularmente preferida de 30 ng/pl a 70 ng/pl.

Preferiblemente, la cantidad eficaz de anti-CD28 en la composición A varía de 10 ng/pl a 100 ng/pl, preferiblemente de 20 ng/pl a 80 ng/pl, y de forma particularmente preferida de 30 ng/pl a 70 ng/pl.

Preferiblemente, la cantidad efectiva de IL-2 en la composición A varía de 1 ng/ml a 20 ng/ml, preferiblemente de 2 ng/ml a 15 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 4 ng/ml a 12 ng/ml.

Según una realización particular, las cantidades eficaces de anticuerpos anti-CD3, de anticuerpos anti-CD28 y de IL-2 en la composición A son respectivamente de 50 ng/pl, 50 ng/pl y 10 ng/ml.

Preferiblemente, la concentración de IL-1 p en la mezcla de la composición B varía de 1 ng/ml a 50 ng/ml, preferiblemente de 5 ng/ml a 30 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 7 ng/ml a 15 ng/ml.

Preferiblemente, la concentración de IL-23 en la mezcla de la composición B varía de 10 ng/ml a 100 ng/ml, preferiblemente de 20 ng/ml a 80 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 30 ng/ml a 60 ng/ml.

Preferiblemente, la concentración de TGF-p en la mezcla de la composición B varía de 1 ng/ml a 50 ng/ml, preferiblemente de 5 ng/ml a 30 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 7 ng/ml a 15 ng /ml.

Según una realización particular, las cantidades de IL-1 p, IL-23 y TGF-p en la mezcla de la composición B son respectivamente de 10 ng/ml, 50 ng/ml y 10 ng/ml.

En un kit según la invención, la biopsia de piel sana procede de un fragmento de piel que no presenta ningún signo de inflamación perceptible a simple vista (es decir, grieta de la piel, enrojecimiento, hinchazón, calor o descamación excesiva, etc.) o no expresa ningún marcador de inflamación. Además, dicha biopsia de piel sana comprende al menos la epidermis, la dermis y los anexos epidérmicos, y opcionalmente una parte del tejido subcutáneo también denominado hipodermis.

Preferiblemente, dicha biopsia de piel se toma de un animal, en particular de un mamífero, y preferiblemente de un ser humano. Como biopsias utilizables en el kit de la invención se pueden citar las procedentes de residuos quirúrgicos o de mataderos. Por "residuos quirúrgicos" se indican los explantes de piel obtenidos por un acto de cirugía estética, en particular después de blefaroplastia, rinoplastia, abdominoplastia o reducción mamaria. Las técnicas de tomas de biopsias de piel son bien conocidas por los expertos en la técnica.

En un kit según la invención, el dispositivo de inyección manual comprende una jeringa sin volumen muerto en la aguja de formato 26S o 22S.

En un kit según la invención, el dispositivo de inyección por infusión comprende una bomba osmótica unida a un catéter conectado a una aguja de formato 28G o 30G.

Otro objeto más de la invención se refiere a un kit que comprende:

- al menos un inserto para cultivo celular (10), adecuado para estar contenido en un recipiente o un pocillo de una placa de cultivo, y cuyo fondo consiste en una membrana porosa (40), conteniendo dicho inserto la biopsia de piel sana inyectada obtenida al final de la etapa a) del procedimiento de la invención (30) encerrada en una matriz solidificada (20), estando dicha matriz en contacto con el borde interno del inserto y la membrana porosa, estando la epidermis de la biopsia de piel en contacto con la atmósfera y la dermis y estando los anexos epidérmicos de la biopsia de piel sumergidos en la matriz solidificada,

- una composición B que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p.

Según otra realización particular, dicho kit de la invención comprende:

- al menos un inserto para cultivo celular (10), adecuado para estar contenido en un recipiente o un pocillo de una placa de cultivo, y cuyo fondo consiste en una membrana porosa (40), conteniendo dicho inserto la biopsia de piel sana inyectada obtenida al final de la etapa a) del procedimiento de la invención (30) encerrada en una matriz solidificada (20) que contiene al menos la mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p, estando dicha matriz en contacto con el borde interno del inserto y la membrana porosa, estando la epidermis de la biopsia de piel en contacto con la atmósfera y la dermis y estando los anexos epidérmicos de la biopsia de piel sumergidos en la matriz solidificada,

- una composición B que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p.

Los siguientes ejemplos se dan únicamente a título ilustrativo del objeto de la presente invención, de la que en ningún caso constituyen una limitación.

Ejemplos

1 - Preparación de biopsias de piel.

Las biopsias de piel se preparan a partir de una toma de muestra de piel completa, que comprende la epidermis, la dermis y la hipodermis. A partir de estas biopsias se pueden contemplar dos realizaciones en función de la naturaleza de los compuestos antiinflamatorios a ensayar.

En una primera realización, el tejido adiposo (es decir, la hipodermis) se recorta con unas tijeras curvas con el fin de separarlo de la dermis. Las biopsias (epidermis y dermis), cuyo espesor es de unos 3 mm, se recortan a continuación con una punzonadora metálica. Esta primera realización está destinada a ensayar compuestos antiinflamatorios por aplicación tópica.

En una segunda realización, se conserva la hipodermis. Las biopsias (epidermis, dermis e hipodermis), cuyo espesor es del orden de 1 cm, se recortan a continuación con una punzonadora metálica. Esta segunda realización está destinada a ensayar compuestos antiinflamatorios por inyección subcutánea.

Una vez preparadas, las biopsias se mantienen flotando en una solución salina tamponada hasta la etapa de activación de las células T residentes.

2 - Activación de células T residentes

Usando unas pinzas, la biopsia de piel se mantiene plana, con la dermis en la parte superior. Se introduce una aguja sin volumen muerto en la biopsia por el lado de la dermis utilizando una jeringa tipo Hamilton 701N o 705N (para biopsias de 8 mm o 15 mm de diámetro, respectivamente). Se inyectan 10 gl o 35 gl de la solución de activación (anticuerpo anti-CD350 ng/gl, anticuerpo anti-CD2850 ng/gl e IL-210 ng/ml), para biopsias de 8 o 15 mm de diámetro respectivamente, por el lado de la biopsia para no dañar la epidermis.

Cuando la inyección se realiza por infusión, se cargan 200 gl de la solución de activación en la bomba osmótica (para el modelo de bomba 2001D probado). La concentración de la solución se ajustó según el tamaño de las biopsias (anticuerpo anti-CD32,5 ng/gl, anticuerpo anti-CD282,5 ng/gl, IL-20,5 ng/ml para las biopsias de 8 mm de diámetro; anticuerpo anti-CD38,75 ng/gl, anticuerpo anti-CD288,75 ng/gl, IL-21,75 ng/ml para biopsias de 15 mm de diámetro. Luego, la bomba se conecta a un catéter usando un regulador de flujo. A continuación, se ceba la bomba: se coloca en una solución salina tamponada y se incuba a 37°C durante 3 horas.

Al final de esta incubación, el extremo del catéter libre (no conectado a la bomba) se conecta a una aguja. La implantación de la aguja en la dermis de la biopsia se realiza manualmente de la misma manera que la descrita anteriormente: la piel se mantiene plana con unas pinzas, la dermis en la parte superior. La aguja se inserta en la dermis por el lado de la biopsia para no dañar la epidermis.

A continuación, las biopsias implantadas se depositan en un soporte de cultivo flotante sobre el medio de cultivo adecuado. Las bombas se mantienen sumergidas en una solución salina tamponada. El conjunto se incuba durante 24 horas en un incubador a 37°C, 5% de CO2 y al máximo nivel de humedad.

Al final de la infusión de 24 horas, se retira la aguja de la biopsia y, así se desconecta la bomba.

3 - Cultivo ex vivo

La biopsia de piel cuyas células T residentes se han activado se monta en una matriz líquida vertida en un inserto de cultivo según el mismo procedimiento que el utilizado para el modelo NativeSkin®, basado en el uso de una matriz natural que sirve como soporte físico y capa alimentadora para explantes de piel o epidermis humana cultivada in vitro. A continuación, el explante se cultiva en placa (cultivo en incubadora, renovación diaria del medio de cultivo).

4 - Diferenciación de las células T en Th1/Th17

En el medio de cultivo sintético WILLIAM'S E se añaden los siguientes complementos: IL-1 p 10 ng/ml, IL-2350 ng/ml y TGFbeta 10 ng/ml. El cultivo se lleva a cabo durante 7 días en una incubadora de CO² a 37°C. El medio de cultivo que contiene los complementos se cambia diariamente.

Al final de las etapas de activación y diferenciación de las células T residentes de la dermis, las biopsias de piel llevan el nombre comercial de InflammaSkin® cuando comprenden la epidermis y la dermis, o Hypo-InflammaSkin® cuando comprenden la epidermis, la dermis y la hipodermis.

5 - Análisis por histología

5.1 - Corte en microtomo

El análisis se puede realizar en muestras incluidas en un bloque de parafina mediante secciones de microtomo en serie.

La biopsia de piel tratada según las etapas a) y b) del procedimiento de la invención se deshidrata mediante un baño de alcohol y luego paso por un baño de xileno. Un primer baño en la parafina permite sustituir el agua previamente contenida en el explante de piel por parafina.

Las muestras impregnadas de parafina se extraen de su baño y se transfieren a un recipiente cuyo fondo está forrado con papel absorbente, con el fin de acercarlas a la estación de inclusión.

Las muestras, encerradas en casetes de histología, se sumergen en la parafina líquida a 56°C para hacer que se vuelva a fundir la parafina que las impregna.

Para cada muestra: se abre el casete de histología, opcionalmente se corte la muestra en dos. Se llena un molde de inclusión con parafina líquida y la muestra (o los 2 trozos de muestra) se coloca en el molde y se orienta en la dirección deseada para el corte. El molde se transfiere al mismo tiempo a un soporte refrigerado con el fin de solidificar la parafina del fondo del molde y mantener allí la muestra. La tapa del casete de histología en la que aparece la referencia de la muestra se coloca por encima de manera que la parafina la atraviese (posibilidad de añadir parafina si es necesario), luego se coloca todo en frío (nevera, congelador, cámara frigorífica, etc.) varios minutos (5-6), con el fin de solidificar la parafina en un bloque, atrapando la muestra en la orientación correcta y la tapa del casete de histología que se convertirá en el soporte del bloque.

Una vez que el bloque es bien sólido, se desmolda. El exceso de parafina opcionalmente se raspa, mediante una espátula, de los lados de la tapa del casete de inclusión.

A continuación, se realizan secciones seriadas de espesor que varía de 4 a 5 pm en toda la longitud del bloque de parafina que contiene la muestra.

La figura 2 ilustra los resultados de dicha tinción realizada en una biopsia de piel tratada según el procedimiento de la invención después de 5 o 7 días de cultivo en el medio de polarización de células T residentes activadas en células Th1 y/o Th17. El análisis del modelo por histología (p. ej., tinción con hematoxilina y eosina) permite certificar la aparición de espongiosis (S) en la epidermis, así como la formación de alargamiento de las crestas epidérmicas (E) después de 7 días de cultivo de las biopsias activadas en medio de polarización.

Se realizaron análisis de histología mediante inmunomarcado anti-CD207, anti-CD3, anti-HLA-DR y antitriptasa con el fin de identificar determinadas subpoblaciones celulares contenidas en las biopsias de piel sana. Se realizó una contratinción nuclear con DAPI. Los resultados de la figura 3 muestran claramente que las biopsias de piel sana contienen células de Langerhans (CD207), células T residentes (CD3), células dendríticas (HLA-DR) y mastocitos (triptasa) en T0 y después de 7 días de cultivo (T7).

5.2 - Criosección

El análisis también se puede hacer en una sección congelada con el fin de no alterar la fluorescencia de las células/del o de los esferoides al deshidratarse.

El cultivo de la biopsia de piel tratada según las etapas a) y b) del procedimiento de la invención se detiene fijando la muestra durante 24 h en 10 veces su volumen de formalina al 10%. A continuación, el explante se enjuaga en 10 veces su volumen de PBS, se seca sobre papel absorbente y se transfiere a un tubo EPPENDORF. El tubo EPPENDORF se sumerge en nitrógeno líquido hasta que se congela el explante.

En el interior del criostato, el explante congelado se incluye en OCT y luego se realizan cortes de espesor constante de 3 a 15 gm de la parte del explante que contiene el(los) esferoide(s) implantado(s). Los cortes se colocan en portaobjetos que se secan durante al menos unas horas.

Se realiza tinción clásica con hematoxilina y eosina.

6 - Validación del modelo de piel inflamada

6.1 - Marcadores de inflamación

Las citoquinas IL-17A, IL-22 e IFNy producidas por el modelo se analizaron en los medios de cultivo mediante análisis ELISA utilizando un kit de detección específico procedente de Meso Scale Discovery (U-PLEX TH17 Combo 2 Human Referencia K15076K) y utilizando una plataforma de análisis multiplex (MESO QuickPlex SQ 120).

La figura 4 ilustra los resultados obtenidos durante el análisis de citoquinas en diferentes modelos. Los modelos NativeSkin® son biopsias de piel que comprenden la epidermis y la dermis, y están desprovistas de hipodermis. A diferencia de los modelos NativeSkin® estándar (1) o NativeSkin® cultivadas en presencia del cóctel de polarización pro Th17/Th1(2), las citoquinas IL-17A (Figura 4A) e IL-22 (Figura 4B) son producidas únicamente por el modelo InflammaSkin® (3) obtenido por el procedimiento de la invención.

6.2 - Activación de queratinocitos

Al final de la etapa b) del procedimiento de la invención, los modelos ex vivo de piel inflamada presentan signos característicos comparables a los observados en lesiones psoriásicas de pacientes que padecen psoriasis. La siguiente tabla ilustra la apariencia de algunos de estos marcadores.

A partir de los 5 días de incubación de la biopsia de piel en presencia de la mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p, se observa la aparición de los marcadores S100A7 (psoriasina) y queratina 16 (KRT16), característicos de una hiperproliferación de queratinocitos. Los niveles de estos marcadores aumentan todavía 7 días después del inicio de la polarización de las células T CD4+ activadas en Th1/Th17.

Además, se observa la aparición de apoptosis dentro de los queratinocitos de la epidermis del modelo ex vivo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención.

7- Cribado de compuestos antiinflamatorios

Con el fin de probar la relevancia del modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención, se ensayaron compuestos conocidos por su efecto antiinflamatorio. Estos son el dipropionato de betametasona y el inhibidor de la PDE4. Se realizaron aplicaciones tópicas de estos productos (volumen constante de 10 gl en biopsias de 8 mm de diámetro) inmediatamente después de la activación y producción del modelo InflammaSkin® (tratamiento profiláctico) o tras 3 días de cultivo sin tratamiento (tratamiento terapéutico), y repetido diariamente hasta el 7° día de cultivo.

El análisis por histología (figura 5) muestra que la integridad y la estructura de la piel y más particularmente de la epidermis, y la viabilidad de las células de la epidermis se conservan durante el tratamiento con el dipropionato de betametasona y el inhibidor de la PDE4 en tratamiento profiláctico en comparación con sus respectivos controles con placebo.

El análisis de la secreción de las citoquinas proinflamatorias IL-17A), IL-22, IFN^y y TNFa (figuras 6 a 9) muestra que:

- La secreción de IL-17A (figura 6) es fuertemente inhibida por el dipropionato de betametasona (3) y el inhibidor de PDE4 (5) en tratamiento profiláctico en comparación con sus respectivos controles con placebo (figura 6A), mientras que solo el dipropionato de betametasona (3) inhibe la secreción de IL-17A en tratamiento terapéutico (figura 6B),

- La secreción de IL-22 (figura 7) es fuertemente inhibida por el dipropionato de betametasona (3) e incluso más fuertemente por el inhibidor de PDE4 (5) en tratamiento profiláctico en comparación con sus respectivos controles con placebo (figura 7A), mientras que solo el dipropionato de betametasona (3) inhibe la secreción de IL-22 en tratamiento terapéutico (figura 7B),

- La secreción de IFNy (figura 8) es fuertemente inhibida por el dipropionato de betametasona (3) y el inhibidor de la PDE4 (5) en tratamiento profiláctico en comparación con sus respectivos controles con placebo (figura 8A), mientras que solo el dipropionato de betametasona (3) inhibe la secreción de IFNy en tratamiento terapéutico (figura 8B),

- La secreción de TNFa (figura 9) es fuertemente inhibida por el dipropionato de betametasona (3) y el inhibidor de PDE4 (5) no solo en tratamiento profiláctico en comparación con sus respectivos controles con placebo (figura 9A), sino también en tratamiento terapéutico (figura 9B).

8 - Incorporación del anticuerpo anti-CD3 en células dérmicas

Se realizó un ensayo comparativo relativo a la incorporación de un anticuerpo anti-CD3 en biopsias de piel humana.

40 ng/gl de anticuerpo anti-CD3e acoplado al fluorocromo Alexa Fluor 647 (ThermoFisher, ref. A51001) se han inyectado directamente en la dermis de una biopsia de piel humana de 4 mm de espesor y 8 mm de diámetro, o se han añadido al medio de cultivo en el que se mantiene flotando la biopsia de piel. Después de 24 horas de cultivo, las biopsias de piel se fijan en una solución de formalina al 10% y se incluyen en bloques de parafina. Se realizan secciones seriadas de espesor constante de 5 gm de las biopsias. Los núcleos celulares se marcan con DAPI. Para el análisis se utiliza un microscopio de fluorescencia Leica DM5000.

La incorporación del anticuerpo anti-CD3e en las células de la dermis se señaliza mediante flechas en dos biopsias distintas (repeticiones 1 y 2) que han recibido una inyección de este anticuerpo directamente en la dermis (figura 11, paneles de la izquierda - II). Con un gran aumento (figura 12), se puede observar que la incorporación del anticuerpo anti-CD3e se produce en el citoplasma de algunas de las células dérmicas.

Por el contrario, para una sola de las dos biopsias que han sido incubadas en un medio de cultivo que contiene el anticuerpo anti-CD3e, la detección de este anticuerpo es visible, y señalizado por una estrella, solo en la superficie de la epidermis (figura 11 panel de la derecha - AMC/R1). Ninguna célula dérmica pudo incorporar el anticuerpo anti-CD3e por difusión pasiva.

Estos resultados muestran claramente que el anticuerpo anti-CD3 alcanza las células de la dermis sólo si se inyecta directamente en este tejido.

Se pueden obtener resultados similares con el anticuerpo anti-CD28.

9 - Cribado de compuestos antiinflamatorios

Con el fin de probar la pertinencia del modelo de piel inflamada obtenido por el procedimiento de la invención (Hypo-InflammaSkin®), se probó un anticuerpo conocido por su efecto antiinflamatorio. Este es el anticuerpo anti-TNFa adalimumab. Se obtuvieron biopsias de piel inflamada (Hypo-InflammaSkin® - I) con un espesor de 1 cm por el procedimiento de la invención. Se realizó una inyección subcutánea (es decir, en la dermis) de adalimumab 50 nM en T0 (tratamiento profiláctico, Hypo-InflammaSkin® - I anti-TNFa - P) o tras 3 días de cultivo ex vivo de la biopsia inflamada (tratamiento terapéutico, Hypo-InflammaSkin® -I anti-TNFa-T). Después de 7 días de cultivo ex vivo, se extraen los medios de cultivo y las biopsias de piel se fijan en una solución de formalina al 10% y luego se incluyen en bloques de parafina. Se realizan secciones seriadas de espesor constante de 5 gm de las biopsias. El aspecto morfológico de las biopsias de piel se estudia mediante microscopía óptica mediante tinción con hematoxilina y eosina. La presencia de psoriasina (S110A7) se pone de manifiesto mediante microscopía de fluorescencia (microscopio Leica DM 5000) utilizando un anticuerpo anti-S100A7 acoplado a un fluorocromo. Los núcleos celulares se marcan con DAPI. Biopsias de piel no inflamada (HypoSkin® - biopsias que comprenden la epidermis, la dermis y la hipodermis) sirven como controles.

El análisis por histología (figura 13) muestra que la integridad y estructura de la piel y más particularmente de la epidermis, y la viabilidad de las células de la epidermis se conservan durante el tratamiento con el anticuerpo anti-TNFa adalimumab en tratamiento profiláctico (Hypo-InflammaSkin® - I anti-TNFa - P) y en tratamiento terapéutico (Hypo-InflammaSkin® - I anti-TNFa - T) en comparación con una biopsia de piel inflamada no tratada con este anticuerpo (Hypo-InflammaSkin® -I).

Además, la psoriasina se vuelve casi indetectable en muestras de biopsia inflamada tratadas con anti-TNF-a, lo que prueba la resolución de la inflamación.

El análisis de la secreción de la citoquina proinflamatoria IL-22 muestra que la secreción de IL-22 (figura 14) es fuertemente inhibida por el anticuerpo anti-TNFa en tratamiento profiláctico (Hypo-InflammaSkin® - I anti-TNFa - P) y en tratamiento terapéutico (Hypo-InflammaSkin® - I anti-TNFa - T) en comparación con una biopsia de piel inflamada no tratada con este anticuerpo Hypo-InflammaSkin® -I).

Estos resultados muestran que el modelo ex vivo de piel inflamada obtenida por el procedimiento de la invención permite el cribado de compuestos antiinflamatorios, y en particular compuestos antipsoriásicos, cuya vía de administración es una inyección subcutánea.

Claims (15)

REIVINDICACIONES

1. Un procedimiento in vitro para obtener un modelo ex vivo de piel inflamada que comprende las siguientes etapas:

a) inyectar, en la dermis de una biopsia de piel sana previamente tomada de un mamífero, una composición que comprende una cantidad eficaz para activar las células T residentes dérmicas de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28,

b) incubar la biopsia de piel inyectada obtenida en la etapa a) en presencia de una composición que comprende una cantidad eficaz, para obtener la polarización de las células T activadas en la etapa a) en LTh1 y/o LTh17 y la síntesis de marcadores de inflamación, de al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la composición inyectada en la etapa a) del procedimiento comprende también una cantidad eficaz de IL-2.

3. El procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que la etapa a) se lleva a cabo manualmente.

4. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa de incubación b) dura al menos 5 días.

5. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, el cual comprende entre las etapas a) y b) una etapa complementaria a') de depositar la biopsia de piel inyectada obtenida al final de la etapa a) sobre una matriz líquida adecuada para solidificar, estando dicha matriz ella misma contenida en un inserto para cultivo celular cuyo fondo está formado por una membrana porosa y estando dispuesto dicho inserto en un recipiente o pocillo, de manera que permita, una vez que la matriz ha solidificado, mantener la integridad 3D de la biopsia de piel.

6. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las concentraciones en la composición inyectada en la etapa a) del procedimiento están comprendidas entre:

- entre 10 ng/gl y 100 ng/gl, preferiblemente entre 20 ng/gl y 80 ng/gl, y de forma particularmente preferida entre 30 ng/gl y 70 ng/gl para los anticuerpos anti-CD3 y anti-CD28, y opcionalmente,

- entre 1 ng/ml y 20 ng/ml, preferiblemente de 2 ng/ml a 15 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 4 ng/ml a 12 ng/ml para IL-2.

7. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que las concentraciones en la al menos una mezcla de la composición utilizada en la etapa b) del procedimiento están comprendidas entre:

- entre 1 ng/ml y 50 ng/ml, preferiblemente entre 5 ng/ml y 30 ng/ml, y de forma particularmente preferida entre 7 ng/ml y 15 ng/ml para la IL-1 p y TGFp, y

- entre 10 ng/ml y 100 ng/ml, preferiblemente de 20 ng/ml a 80 ng/ml, y de forma particularmente preferida de 30 ng/ml a 60 ng/ml para la IL-23.

8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que además tiene como objetivo evaluar la eficacia antiinflamatoria de un compuesto y comprende las siguientes etapas complementarias:

c) poner en contacto el modelo de piel inflamada obtenido al final de la etapa b) que comprende células T polarizadas en LTh1 y/o LTh17 con un compuesto candidato y;

d) medir el nivel de expresión de al menos dos marcadores de inflamación en el modelo de piel inflamada; e) comparar el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación obtenidos en la etapa d) con su nivel de expresión de control;

f) identificar la eficacia antiinflamatoria de dicho compuesto candidato cuando el nivel de expresión de dichos al menos dos marcadores de inflamación medidos en la etapa d) es inferior a su nivel de expresión de control.

9. Procedimiento según la reivindicación 8, que comprende también en la etapa d) medir el nivel de expresión de al menos tres, preferiblemente de al menos cinco marcadores de inflamación seleccionados de IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNy, TNFa, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18 y CCL20.

10. Modelo ex vivo de piel inflamada que comprende una dermis, una epidermis, anexos epidérmicos, una hipodermis y células Th1 y/o Th17, que puede obtenerse mediante un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y se caracteriza por la expresión a nivel de proteínas de al menos dos marcadores de inflamación, preferiblemente al menos cinco marcadores de inflamación seleccionados de IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFN^y, TNFa, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3 , SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18 y CCL20.

11. Inserto para el cultivo celular (10), adecuado para estar contenido en un recipiente o un pocilio de placa de cultivo, y cuyo fondo está formado por una membrana porosa (40), conteniendo dicho inserto el modelo ex vivo de piel inflamada (30) según la reivindicación 10 insertado en una matriz solidificada (20), estando dicha matriz en contacto con el borde interior del inserto y la membrana porosa, estando la epidermis del modelo ex vivo de piel inflamada en contacto con la atmósfera y la dermis y estando los anexos epidérmicos del modelo ex vivo de piel inflamada sumergidos en la matriz solidificada.

12. Uso del modelo ex vivo de piel inflamada según la reivindicación 10 o del inserto para cultivo celular según la reivindicación 11, para identificar compuestos antiinflamatorios, en particular compuestos antipsoriásicos.

13. Kit para implementar el procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que comprende una biopsia de piel sana previamente tomada de un mamífero, una composición A que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo anti-CD3 y un anticuerpo anti-CD28, y opcionalmente IL-2, una composición B que comprende al menos una mezcla de IL-1 p, IL-23 y TGF-p,

14. Kit según la reivindicación 12, que comprende además un dispositivo de inyección

15. Procedimiento según la reivindicación 1 a 7, en el que la biopsia de piel sana utilizada en la etapa a) comprende una dermis, una epidermis, anexos epidérmicos y, opcionalmente, una hipodermis.