KR102665807B1 - 염증이 생긴 사람 피부의 생체외 모델 및 소염 화합물을 스크리닝하기 위한 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 염증이 생긴 피부의 생체외 모델, 이를 수득하기 위한 생체외 방법 및 소염성 화합물을 스크리닝하기 위한 이의 용도에 관한 것이다.

Description

염증이 생긴 사람 피부의 생체외 모델 및 소염 화합물을 스크리닝하기 위한 이의 용도
본 특허출원은 2017년 9월 26일자로 출원된 프랑스 특허원 제17/71020호의 우선권을 주장하며, 이는 본원에 참고로 포함된다.
발명의 분야
본 발명은 염증이 생긴 피부의 생체외(ex vivo) 모델을 수득하는 방법, 이러한 방법을 실행하기 위한 키트(kit) 뿐만 아니라 소염 효과를 갖는 화합물을 확인하기 위한, 특히 건선 치료를 위한 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델의 용도에 관한 것이다.
선행 기술
건선은 표피 각질형성세포의 비정상적인 분화 및 증식으로 흔히 자극성 적색 플라크(plaque)의 형성 및 죽은 세포(인편; scale)의 축적을 야기함을 특징으로 하는, 유럽 인구의 약 2%에 영향을 미치는 만성 염증성 자가면역 질환이며, 이는 전신에 걸쳐 모든 부위(가장 흔하게는 팔, 몸통, 무릎, 발, 손발톱, 얼굴, 및 두피)에 위치할 수 있다.
이러한 건선 플라크의 조직학적 분석은 표피의 두께에 있어서의 증가, 각질형성세포의 불완전한 분화 및 진피-표피 연결부의 스캘럽 외형(scalloped appearance), 표피내 다핵 호중구의 축적 및 단핵 세포, 특히 대식세포 및 T 림프구(TL)에 의한 진피의 침윤 뿐만 아니라 유의적인 혈관형성을 나타낸다.
면역조직학적 연구는 진피가 기억 CD4+T 림프구, 대식구, 및 수지 세포(DC)로 주로 구성된 침윤물의 부위인 반면, CD8+T 림프구는 정상(염증이 생기지 않은) 표피내에서 우세함을 입증한다.
건선 염증은 표피 세포(각질세포), 수지 세포, 및 T 세포 사이의 상호작용의 결과이다. 분자 수준에서, 이러한 상호작용은 질환을 개시하여 상호간의 세포 활성화의 악성 주기를 유지함으로써, 피부 병변 및 이들의 만성화를 영속시키는 사이토킨의 복잡한 네트워크에 의해 매개된다(JF NICOLAS, Bull. Acad. Natle. Med, 2014, 198(1), pp. 17-30). 염증성 수지 세포에 의해 건선 피부내에서 생산된 주요 사이토킨은 IL-12 및 IL-23이며, 이는 T 림프구의 Th1(LTh1) 또는 Th17(LTh2) 계통으로의 분화 또는 확장에 있어서 중요한 역활을 담당한다(PECK and MELLINS, Immunology, 2009, 129, pp. 147-153). LTh1은 IFNγ, TNFα 및 IL-2를 생산하는 반면, LTh17은 IL-17A, IL-17F, IL-21, IL-22, 및 보다 적은 정도의 TNFα의 합성에 관여한다. 사이토킨의 이러한 증가된 생산은 각질형성세포의 활성화에 관여하며, 이는 궁극적으로 항미생물성 펩타이드, 전-염증성 매개인자(IL-1β, IL-6, IL-17C, TNFα, CXCL8, CXCL9, CXCL10, CXCL11, 및 CCL20) 및 프소리아신(psoriasin)(S100A7)의 방출을 초래한다. 2014년에 수행된 연구는 IL-22를 생산하는 CD4+ T 세포, 및 IL-17을 생산하는 CD8+ 세포가 효과적인 건선 치료요법을 사용하여 처리된 이미 손상된 건선 피부 속에 잔존함을 나타내었다. 이러한 결과는 건선이 있는 환자로부터의 정상적으로 보이고, 병변이 없는 피부 이식체가 면역결핍성 마우스내에서 건선성 병변의 발달을 초래함을 나타내는 것과 유사하다. 모든 이러한 연구는 피부 속에 내재하는 T 세포가 임상적으로 분해된 건선성 병변을 지속하여 질환의 주요 병리학을 유발하는 것으로 알려진 사이토킨을 생산함을 입증하고 있다(Rachael A. CLARCK, Sci Transl Med., 2015, 7(269):269rv1).
건선의 치료는 주로 코르티코스테로이드, 포스포디에스테라제 억제제, 면역억제제(사이클로스포린, 타크롤리무스), 또는 UV 광치료요법의 사용을 기반으로 한다. 보다 최근에, TNFα에 대한 항체(인플릭시맙, 아달리무맙, 에타네르셉트, 골리무맙), IL-17-A(세쿠키누맙, 익세키주맙), IL-12/IL-23(우스테키누맙, 구셀쿠맙, 틸드라키주맙)은 중간 내지 중증 형태의 건선을 제어하기 위해 개발되었거나 임상 시험 중에 있다(GOODERHAM et al., Skin Therapy Letter, 2015, 20(1), pp.1-5). 이러한 항체 중 일부는 건선의 중증도에 따라서 수주 동안 또는 심지어 수년 동안 피하에 투여된다. 치료가 어느 정도 효과적인 것으로 밝혀졌지만, 이들은 유의적인 부작용을 가지고 있으며 여전히 건선을 치유할 수 없다. 이러한 단점을 극복할 수 있는 신규한 화합물을 확인할 실질적인 필요성이 존재한다. 이러한 목적을 위해, 염증이 생긴 피부, 특히 건선 피부의 모델을 갖는 것이 필수적이다.
건선의 마우스 모델은 자발적인 돌연변이(Scd1ab/Scd1ab, Sharpincpdm/Sharpincpdm, Ttc7fsn/Ttc7fsn) 또는 상이한 신호전달 경로에 포함되거나, 사이토킨 또는 성장 인자를 암호화하는 유전자의 발현의 인공적인 조절을 기반으로 한다(MP SCHON, Experimental Dermatology, 2008, 17, pp. 703-712). 그러나, 이러한 모델은 사람에서 건전의 모든 표현형적 및 조직학적 특성을 가지지 않거나 신규 화합물을 스크리닝(screening)하기 위한 이러한 동물 모델의 용도를 제한하는 추가의 특성을 갖는다. 더욱이, 사람과 동물 사이의 생리학적 차이는 사람에서 면역 반응을 확실하게 예측하도록 하지 않으므로, 임상 시험 상에서 많은 후보 화합물의 포기를 야기한다.
이러한 곤란성을 극복하기 위하여, 건선 사람 피부의 이종이식이 누드(nude) 또는 SCID 마우스에서 수행되었으며 건선의 급성 형태의 모델을 생성시키도록 하였다. 그러나, 수용체 마우스의 면역계는 불완전하므로, 다시 이러한 동물 모델로부터 사람까지 수득된 결과를 추론하는 것은 어렵다.
또한, 신규한 조절 요건과 조합된 동물 복지의 고려는 사람 생리학에 보다 근접한 모델의 발달을 유도한다. 따라서, 인공 피부 또는 표피의 시험관내(in vitro) 모델이 불활성 폴리카보네이트 매트릭스(SkinEthic™ RHE, EpiSkin™, EPISKIN, 프랑스)에서 각질형성세포 및/또는 섬유아세포 배양물로부터 개발되었다. 그러나, 이러한 모델은 표피 부속물 또는 면역계의 구성성분을 함유하지 않으므로, 잠재적으로 자극성인 화합물을 스크리닝하기 위한 이들의 용도를 제한한다.
이러한 단점을 극복하기 위하여, 사람 피부의 제1 생체외 모델이 진피 및 표피 샘플을 취함으로써, 사람 진피 샘플로부터 제조되었다. 그러나, 이러한 모델의 수명은 7일을 넘지 않는다. 이러한 수명은 진피 및 표피 외에, 표피 부속물 및 모공을 취함으로써 증가시킬 수 있다(EP 2 019 316 B1). 그러나, 이러한 모델은 염증성 피부 상태와 일치하지 않는다.
건선 사람 피부 등가물은 건강한 진피 섬유아세포를 자극시키거나 건선을 지닌 환자로부터 섬유아세포를 사용함으로써 수득되었다(TJABRINGA et al., Am. J. Pathol. 2008, 173, pp. 815-823). 이러한 3D 모델은 표피의 비후화(thickening) 및 병리학의 특징인 염증성 사이토킨(TNFα, IL-1α, IL-6, IL-8, 및 IL-22)의 생산을 나타내지만, 면역 성분은 여전히 부재한다.
보다 최근에, 수일 동안 배양 배지내로 IL-1β의 첨가는 사람 피부 외식편(explant)에서 급성 염증을 유도하도록 하지 않는다(EP 2 885 637 B1). 그러나, 이러한 모델은 건선에서 관찰된 만성 염증을 고려하지 않는다.
말초 혈액으로부터 T 세포의 첨가, 및 트자브린가(Tjabringa) 등에 의해 개발된 모델의 진피 아래의 Th1 또는 Th17 소집단으로의 활성화 및 분화는 각질형성세포에서 이러한 T 세포에 의해 생산된 사이토킨에 의해 발휘된 영향 및 염증의 발달을 입증하는 것이 가능하다(VAN DEN BOGAARD et al., J. Invest. Dermatol. 2014,134, pp. 719-727). 그러나, Ki67 마커의 발현, 각질형성세포 고증식, 및 표피종의 발현과 같은, 건선의 특정 특징은 이러한 모델에서 여전히 부재한다. 또한, 말초 혈액으로부터 유래된 T 세포는 피부내 내재하는 T 세포, 및 특히 진피 및 표피내에서 기억 내재성 T(TRM) 세포와는 구별된다(MUELLER and MACKAY, Nat Rev Immunol., 2016, 16(2), pp. 79-89). 더욱이, TRM 세포는 전사 인자 및 말초 혈액에서 다른 기억 T 세포로부터 이들을 구별하는 표면 마커를 갖는다. 따라서, S1PR1(스핑고신-1-포스페이트 수용체 1) 유전자의 발현-저하(under-expression)와 조합된 TRMs의 표면에서 CD69의 존재는 이들이 스킨(skin)과 같은 말초 조직 내에 수개월 동안 잔존하도록 함으로써 이들이 혈류내로 재순환하는 것을 방지한다. CD8+ TRM 및 CD4+ TRM 집단의 존재는 건강한 사람 피부의 표피 및 진피 내에서 광범위하게 관찰되었고; CD8+CD49a+ TRM 소집단은 퍼포린 및 IFNγ의 합성에 관여되어 있는 반면, CD8+CD49a- TRM 세포는 주로 IL-17을 생산한다(HAIJING et al., Autoimmun Rev., 2018, pp. 906-911).
사람 피부 생검에서 내재하는 T 세포의 활성화를 기반으로 하는 다른 접근법은 제WO 2014/182655 A1호 하에 발표된 국제 출원에 기술되었다. 그러나, 이러한 모델에서 확인될 수 있는 건선의 특징적인 단백질 마커는 존재하지 않는다. 또한, 피하 지방세포 조직의 제거는 300 μm 이하의 두께의 피부 생검을 수득한다. 이러한 미세함(fineness)은 이들의 취급을 매우 세밀하게 하며 피하 주사를 허용하지 않는다.
따라서, 특히 염증이 생긴 사람 피부의 생체외 모델에서, 새로운 도구를 개발할 실제적인 필요성이 존재한다. 이러한 필요성은 특히 생체외 피부 샘플 하에서, 염증 모델화에서 사용하기에 적합한 배양 조건의 확인을 포함하며, 생체내에서 직면한 조건으로부터 이러한 샘플의 거동의 유의적인 편차를 유도하지 않는 충분히 긴 시간 동안 유지시킬 수 있다.
놀랍게도, 본 발명자들은 이러한 모든 단점을 극복하는 시험관내 방법을 개발하였다.
발명의 요약
본 발명은 생리병리학적 맥락에서 생체내에서 관찰될 수 있는 바와 같이 염증이 생긴 피부의 환경을 보다 정밀하게 및 재생적으로 반영하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델을 제공함으로써 상술한 단점에 대해 보상하도록 한다.
따라서, 본 발명의 제1 목적은 다음의 단계를 포함하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델을 수득하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 포유동물로부터 미리 채취한 건강한 피부 생검의 진피 내로, 진피 내재성(dermal resident) T 세포를 활성화하기 위한 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물을 주사하는 단계,
b) LTh1 및/또는 LTh17로 단계 a)에서 활성화된 T 세포의 분극화 및/또는 염증 마커의 합성을 수득하기 위한, IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물의 유효량을 포함하는 조성물의 존재하에서 단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리하는 단계.
본 발명의 제2 목적은 진피, 표피 및 표피 부속물(appendage)을 포함하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델에 관한 것이며, 여기서 LTh1 및/또는 LTh17로 분극화되고(polarized) 활성화된 T 세포는 표피 각질형성세포의 촉진된 염증을 갖는다.
피부 염증을 조절하는 화합물을 확인하기 위한 방법에서 본 발명의 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 사용은 염증이 생긴 피부의 생체내 환경을 보다 정밀하게 반영함으로써, 거짓 양성 및/또는 거짓 음성 형태로 화합물에 대한 스크리닝 시험에서 오류를 감소시킬 수 있는, 용이하게 생성된 모델에 의존하는 이점을 제공한다.
따라서, 본 발명에 따른 방법은 화합물의 소염 효능을 평가하는 것을 목표로 하며 다음의 추가의 단계를 포함한다:
c) 단계 b)의 말기에 수득되고 LTh-1- 및/또는 LTh17-분극화된 T 세포를 포함하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델을 후보물 화합물과 접촉시키는 단계;
d) 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
e) 단계 d)에서 수득된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 이들의 대조군 발현 수준과 비교하는 단계;
f) 단계 d)에서 측정된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준이 이들의 대조군 발현 수준보다 낮은 경우 상기 후보물 화합물의 소염 효능을 확인하는 단계.
본 발명의 방법을 사용하여, 피부 염증, 및 특히 건선을 치료하기에 효과적인 소염 약물에 대한 연구를 용이하게 할 것이다.
본 발명의 여전히 다른 목적은 소염 후보 화합물, 특히 건선을 치료하는 경향이 있는 후보물 화합물을 스크리닝하는 목적을 위한, 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 용도에 관한 것이다.
최종적으로, 본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법을 시행하기 위한 키트에 관한 것이며, 상기 키트는 포유동물로부터 이미 취한 건강한 피부 생검, 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물 A, IL-1β, IL-23, 및 TGFβ의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물 B, 및 임의로 주입 주사용 장치를 포함한다.
도면 설명
도 1은 수동 주사 또는 주입에 의해 수득된 염색 강도(staining intensity)의 구배를 비교함에 의한 피부 생검 내로 염색된 용액의 수동(M) 또는 주입(P) 피내 주사 및 이의 확산을 나타낸다.
도 2는 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에 따라 처리된 또는 비처리된(C) 건강한 피부 생검(Th17/Th1)의 조직학적 특성을 비교한다. 관찰은 분극화 용액 속에서 본 발명의 방법의 단계 a)로부터 주사된 건강한 피부 생검의 항온처리를 시작한 후 5일(T5) 또는 7일(T7) 째에 관찰하였다. IL-1β, IL-23, 및 TGFβ의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물의 존재하에서 7일의 배양 후, 표피내 해면화(S) 및 표피 융기(E)의 신장이 관찰되었다.
도 3은 비처리되고(T0) 7일 동안 배양물 속에 유지시킨(T7) 건강한 피부 생검 속에서 랑케르한스 세포(CD207), 내재하는 T 세포(CD3), 수지 세포(HLA-DR), 및 비만 세포(트립타제)의 존재의 조직학적 분석을 나타낸다.
도 4는 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에 따라 처리된 모델(Th17/Th1)에서 LTh17 및 LTh1의 존재를 나타내는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델에 의한 전-염증성 사이토킨 IL-17A 및 IL-22의 분비를 나타낸다. 처리되지 않은 건강한 피부 생검(1-NativeSkin®), 본 발명의 방법의 단계 b)의 분극화 칵테일의 존재하에서 배양된 건강한 피부 생검(2-NativeSkin® + 전(pro) Th17/Th1), 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에 따라 처리된 건강한 피부 생검(3-InflammaSkin®)을 비교한다. 결과는 pg/ml로 나타낸다.
도 5는 비처리(C) 또는 본 발명의 단계 b)에 따라 (IL-1β+IL-23+TGFβ) 만으로 처리하거나 또는 단계 a) 및 b)(항-CD3+항-CD28+IL-2+IL-1β+IL-23+TGFβ)에 따라 처리하고, 배양 7일 후인 건강한 피부 생검의 조직학적 특성을 나타낸다. 이러한 생검은 처리되지 않거나(1), 위약 겔로 처리하거나(2), 위약 크림으로 처리하거나(4), 또는 2개의 염증 억제제 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 및 포스포디에스테라제 제4형 억제제(5)로 처리하였다. 염증 억제제(3 및 5)를 사용한 처리 만이 표피내 조직학적 비정상의 전체적인 부재를 야기하며 이는 전-염증성 사이토킨 분비의 억제, 및 따라서 LTh17/LTh1 세포 분화의 억제를 시사한다.
도 6은 예방학적(A) 또는 치료학적(B) 처리로서 IL-17A 단백질 합성의 억제를 나타낸다. 비처리(1), 또는 위약 겔로 처리한(2), 베타메타손 디-프로피오네이트를 포함하는 겔로 처리한(3), 위약 크림 처리한(4), 또는 PDE4 억제제를 포함하는 크림으로 처리한(5) 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델을 비교한다. 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델과 관련하여 %로서 나타내며 좌측은 비처리(1)를 나타낸다.
도 7은 예방학적(A) 또는 치료학적(B) 처리로서 IL-22 단백질 합성의 억제를 나타낸다. 비처리(1), 또는 위약 겔로 처리된(2), 베타메타손 디-프로피오네이트를 포함하는 겔로 처리된(3), 위약 크림 처리된(4), 또는 PDE4 억제제를 포함하는 크림으로 처리된(5) 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델을 비교한다. 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델과 관련하여 %로 나타내며 좌측은 비처리(1)를 나타낸다.
도 8은 예방학적(A) 또는 치료학적(B) 처리로서 IFNγ 단백질 합성의 억제를 나타낸다. 비처리된(1), 또는 위약 겔(2), 베타메타손 디-프로피오네이트를 포함하는 겔(3), 위약 크림(4), 또는 PDE4 억제제(5)를 포함하는 겔로 처리된 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델을 비교한다. 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델과 관련하여 %로 나타내며 좌측은 비처리(1)를 나타낸다.
도 9는 예방학적(A) 또는 치료학적(B) 처리로서 TNFα 단백질 합성의 억제를 나타낸다. 비처리된(1), 또는 위약 겔(2), 베타메타손 디-프로피오네이트를 포함하는 겔(3), 위약 크림(4), 또는 PDE4 억제제(5)를 포함하는 겔로 처리된 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델을 비교한다. 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델과 관련하여 %로 나타내며 좌측은 비처리(1)를 나타낸다.
도 10은 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 개략적 표시이다. 이의 하단이 다공성 막(40)으로 이루어진, 세포 배양 삽입체(10)는 고화된 매트릭스(20) 속에 포매된(embedded) 염증이 생긴 피부(30)의 생체외 모델을 함유한다. 특수한 구현예에서, 세포 배양물 삽입체는 상기 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피 표면에 부착된 소수성 물질(50)로 이루어진 러그(lug)(60) 및 환(ring)을 갖는다.
도 11은 사람 피부 생검의 진피 세포를 포함하는 항-CD3 항체의 능력을 나타낸다. 생검의 진피 내로 항-CD3e 항체의 직접적인 주사(진피내 주사(II) - 좌측 패널), 및 피부 생검이 부유하는 세포 배지 속에 위치한 항-CD3e 항체의 확산(배양 배지에 가함(AMC)-우측 패널)을 비교한다. 2개의 별개의 생검을 시험하였다(반복체(R) 1 및 2). 백색 화살표는 항-CD3 항체를 포함한 진피 세포를 확인한다. 백색 별은 피부 생검 중 하나의 표피 표면 상의 항-CD3 항체의 존재를 나타낸다(상단 우측 패널).
도 12는 사람 피부 생검의 진피 세포내 항-CD3 항체의 세포하부 국재화(subcellular location)를 나타낸다. 항-CD3e 항체는 생검의 진피내로 직접 주사되었다.
도 13은 염증이 없는(C), 본 발명의 방법에 따라 염증이 생긴(I), 염증이 생기고 예방학적 처리(I + 항-TNF-α-P)로서, 또는 치료학적 처리(I + 항-TNF-α- T)로서 항-TNF-α 항체의 피하 주사로 처리한 피부 생검의 조직학적 특성을 나타낸다.
도 14는 염증이 없는(C), 본 발명의 방법에 따라 염증이 생긴(I), 본 발명의 방법에 따라 염증이 생기고 예방학적 처리(I + 항-TNF-α-P)로서, 또는 치료학적 처리(I + 항-TNF-α- T)로서, 항-TNF-α 항체의 피하 주사로 처리한 피부 생검에 의한 IL-22의 단백질 합성을 나타낸다. 결과는 pg/ml로 나타낸다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 피부 염증의 감소에 있어서 화합물의 활성을 평가하기 위한 신규한 도구를 제공하기 위한 것이다.
본 발명의 제1의 목적은 다음의 단계를 포함하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델을 수득하기 위한 시험관내 방법에 관한 것이다:
a) 포유동물로부터 취한 건강한 피부 생검의 진피내로 진피 내재성 T 세포를 활성화하기 위한 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물을 주사하는 단계,
b) LTh1 및/또는 LTh17 내로 단계 a)에서 활성화된 T 세포의 분극화 및/또는 염증 마커의 합성을 수득하기 위한, IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물의 유효량을 포함하는 조성물의 존재하에서 단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리하는 단계.
"염증이 생긴 피부의 생체외 모델"은 염증 특성을 지닌 피부의 생검을 의미한다. 이러한 염증성 특성의 확인은 단백질 또는 유전자 수준에서 염증 마커의 발현의 검출을 기반으로 한다. 염증 마커는 사이토킨, 항세균성 단백질, 지질 생합성에 관여된 단백질, 또는 이의 발현 수준이 염증이 생긴 상태과 염증이 없는 상태 사이에서 변하는 임의의 다른 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다(참고: 특히 SERHAN & WARD, Molecular and Cellular Basis of Inflammation, Humana Press). 인터루킨은 IL-1A, IL-1B, IL-5, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-12, IL-17A, IL-17C, IL-17F, IL-19, IL-21, IL-22, IL-23, IL-27, IL-31, 및 IL-33 뿐만 아니라, IL-10RA, IL-10RB, IL-1R1, IL-5RA(CD125), 및 IL-9R을 포함하나, 이에 한정되지 않는 인터루킨 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 케모킨은 또한 C5, 에오탁신, MCP-4, TARC, MCP-1, MIP-3A, CCL22, CCL23, MIP-1B, RANTES, MCP-3, MCP-2, CX3CL1, IL8RA, INP10, L8RB, 및 CXCL3 뿐만 아니라 CCL13(MCP-4), CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR8, CX3CR1, CXCR1, 및 CXCR2를 포함하나, 이에 한정되지 않는 케모킨 수용체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, MCP-1, GM-CSF, TNFSF5, MCSF, GCSF, TNFSF6, IFNA2, IFNG, TNFA, TNFB, MIF, NAMPT, TRAIL, 및 IFNA1과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는 다른 사이토킨 뿐만 아니라, CD4, CD40, TNFSF5, FASLG, JAK2, JNK1, NFkB, RAG1, STAT1, S100 계열 단백질, 및 베타 데펜신을 포함하나, 이에 한정되지 않는 염증에 관여된 다른 유전자도 가능하다.
바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 수득된 피부의 생체외 모델은 상기 언급된 것들로부터 선택된 적어도 2개, 바람직하게는 적어도 3개, 및 특히 바람직하게는 적어도 4개의 염증 마커의 발현율이 건강한 피부 생검(염증이 생기지 않고/않거나 본 발명에 따른 방법의 단계를 겪지 않은)에서 관찰된 것보다 더 높은 경우 염증이생긴 피부의 생체외 모델인 것으로 고려된다.
여전히 바람직하게는, 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 염증 마커 외에, 적어도 하나의 유전자 또는 이의 생성물의 과발현이 문헌(Yao et al., PloSOne, 2008, 3(7), e2737, 본원에 참고로 포함됨]의 표 S1에 나열된 50개 중에서 검출된 경우 건선 환자에거 관찰된 건선 병변과 비교가능하다.
특히 바람직한 방식으로, 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 건강한 피부 생검에서 관찰된 것보다 더 높은 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로부터 선택된 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개, 특히 바람직하게는 적어도 6개의 염증 마커의 단백질 및/또는 유전자 발현율을 갖는다.
염증 마커의 존재 또는 다른 전술한 마커의 과발현 외에, 생리학적 변화는 또한 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델에서 관찰될 수 있다. 이들은 표피의 해면화, 표피내 표피 융기의 신장, 표피 세포내 농축 핵(pyknotic nucleus) 및 세포질성 공포형성(vacuolation)의 존재, 및 심지어 염증에 의해 유발된 세포 사멸을 시사하는 탈착을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.
"피부 생검"은 적어도 표피, 진피, 및 표피 부속물을 포함하는 피부 단편을 의미한다. 이러한 피부 단편 또는 생검은 또한 피하조직(hypodermis)으로 불리는 피하 조직의 부위를 포함할 수 있다. 피하조직은 진피의 바로 아래에 위치하며 보다 깊은 기관, 근육, 힘줄, 및 골 주변의 섬유성 막으로부터 피부를 분리하는 보호성 쿠션(cushion)을 형성한다. 피하조직은 지방세포, 신경, 혈액과 림프 모세관의 네트워크, 세포외 매트릭스 구성성분의 합성에 관여된 소수의 섬유아세포, 및 수지 세포 및 대식구와 같은 면역 세포로 이루어져 있다. 피하조직은 지방세포를 함유하고 신경과 혈관을 통과하도록 하는 연결 벽으로 분리된 지방 소엽으로 분할된다. 피하조직의 기능은 에너지의 저장물을 단리하여 피부 세포에 제공하고, 물리적 스트레스를 흡수하는 것이다. 또한, 연구는 펩타이드-기반 약물의 흡수시 림프성 수송에 의해 수행되는 중요한 역활을 나타내었다.
바람직하게는, 피부 생검은 두께가 1 밀리미터(mm) 내지 1 센티미터(cm), 보다 특히 3 mm 내지 1 cm, 심지어 보다 특히 3 mm 내지 8 mm, 및 심지어 보다 특히 5 mm 내지 7 mm의 범위를 갖는다. 1 cm 이하의 두께는 표피, 진피, 표피 부속물, 및 피하조직을 포함하는 피부 생검을 위해 수득된다. 모든 경우에, 피부 생검의 두께는 1 mm 이상이다.
바람직하게는 상기 피부 생검은 동물, 특히 포유동물, 및 바람직하게는 사람으로부터 취한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 생검은 수술 폐기물 또는 도축장으로부터 수득된 것을 언급할 수 있다. "수술 폐기물"은 후두엽 성형술(post-blepharoplasty), 코성형술, 복벽성형술, 또는 유방 축소를 포함하는, 성형 수술로부터 수득된 피부 샘플을 의미한다. 피부 생검 샘플채취 기술은 당해 분야의 기술자에에 잘 알려져 있다.
이의 시험관내 생존을 보장하기 위하여, 샘플채취는 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물을 주입하기 전에 1h 내지 72h 미만 이내, 바람직하게는 1h 내지 48h 미만내에 수행되어야만 한다.
"건강한 피부 생검"은 눈에 대해 감지할 수 있는 염증의 임의의 신호(즉, 피부 파손, 발적, 팽윤, 열, 또는 과도한 각화…)를 나타내지 않거나, 임의의 염증 마커를 발현하는 피부 단편을 의미한다. 또한, 본 발명의 방법에서 사용된 건강한 피부 생검은 피부학적 병리학, 특히 염증이 없는 개인으로부터 취해야 함이 필수적이다.
바람직하게는, 피부 생검은 원통형을 갖는다.
그러나, 피부 생검의 임의의 다른 기하학적 형태, 특히 사각형, 직사각형, 계란형, 삼각형 등은 또한 본 발명에 따른 방법에 적합하다.
바람직하게는, 원통형은 1 mm 내지 50 mm, 보다 특히 5 mm 내지 20 mm, 심지어 보다 특히 7 mm 내지 17 mm의 범위의 직경을 가지며, 두께는 1 mm 내지 20 mm, 보다 특히 2 mm 내지 15 mm, 심지어 보다 특히 2 mm 내지 10 mm, 및 심지어 보다 특히 2 mm 내지 5 mm에서 변한다.
"진피"는 조밀한 혈관 및 신경 네트워크를 함유하는 표피의 기저 조직 뿐만 아니라, 표피를 연장하는 각질형성된 부속물을 의미하며, 상기 기저 조직은 또한 모낭, 피지샘, 및 땀샘을 포함한다.
표피는 이들 각각의 세포외 매트릭스의 구성 및 조직화에 있어서 상이한 2개의 부분으로 아분된다. 유두 진피는 표피 바로 아래에 놓여있다. 이는 제I형 및 제III형 콜라겐의 미세한 원섬유, 및 표피에 대해 수직으로 배향됨으로써 양초형 구조를 형성하는 탄성 섬유로 이루어진 느슨한 연결 조직이다. 유두 진피 아래에 위치한 망상 진피는 또한 피부 표면에 대해 우선적으로 평행하게 배향된 큰 콜라겐 섬유와 탄성 섬유의 인터위빙 다발(interweaving bundle)로 구성된 연결 조직이다. 망상 진피는 유두 진피에 비해 제III형 콜라겐을 거의 함유하지 않는다.
"진피내로 주사"는 건강한 피부 생검의 진피 구조내로 직접 조성물의 주사, 도입 또는 접종을 의미한다. 진피내로 이러한 주사는 주사 장치, 특히 비스듬하거나 비스듬하지 않은 무용 부피(dead volume)가 없는, 속이 빈 바늘, 또는 당해 분야의 기술자에게 공지된 임의의 다른 등가의 기계적 장치를 사용하여 수행한다.
바람직하게는, 주사는 표피에 대한 어떠한 외상도 피하기 위하여 망상 진피내에서 수행된다. 본 발명의 방법에 사용된 피부 생검에서, 표피 부속물 및 임의로 피하조직의 진피 하에서의 존재는 이들에게 주사 동안 찢어질 위험을 제한하는 두께를 제공한다.
문서 WO 2014/182655 A1으로부터 생검의 진피내로 주사는 피하조직이 없는 이러한 피부채취된 생검이 두께가 750 μm이므로 증가된 인열(tearing)의 위험이 존재할 수 있다.(SMITH et al., PLoS One. 2016 Feb 12; 11(2):e0147979).
조성물을 건강한 피부 생검의 진피 구조내로 직접 주사하는 것의 주요 장점은 생검의 모든 조직내로 이러한 조성물의 보다 균질하고 보다 신속한 확산, 및 결과적으로 진피의 내재하는 T 세포의 보다 우수한 활성화를 허용하는 것이다. 이러한 성능은 문서 WO 2014/182655 A1에 사용된 바와 같은 조성물의 단순한 수동 확산에 의해 달성될 수 없다.
여전히 바람직하게는, 주사 단계는 실온에서 수행된다.
진피내로 주사된 조성물의 용적은 건강한 피부 생검의 크기 또는 표면적, 특히 후자가 원통형을 갖는 경우 이의 직경에 따라 변한다.
바람직하게는, 건강한 피부 생검의 직경은 8 mm 이하이며, 주사된 조성물의 용적은 10 μl 이하이다.
바람직하게는, 건강한 피부 생검의 면적이 15 mm 이하인 경우, 주사된 조성물의 용적은 35 μl 이하이다.
바람직하게는, 주사된 조성물의 용적은 적어도 5 μl이다.
주사하는 경우, 표피를 손상시키지 않는 것이 중요하다. 이러한 결과는 피부 생검이 적어도 1 mm, 바람직하게는 적어도 2 mm, 및 보다 바람직하게는 적어도 3 mm의 두께를 갖는 경우에만 수득될 수 있다.
바람직하게는, 조성물의 주사는 수동으로 또는 주입에 의해 수행될 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물의 건강한 피부 생검의 진피내로 주사는 수동으로 수행된다.
항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물의 건강한 피부 생검의 진피내로 주사는 항-CD3 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2의 진피 세포내로의 혼입을 허용한다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물의 건강한 피부 생검의 진피내로 주사는 4 내지 12 μL/시간의 범위의 유동 속도에서 주입에 의해 수행된다. 이러한 특수한 구현예에서, 주사는 수시간 지속될 수 있다. 일정한 유동 속도를 보장하기 위하여, 삼투 펌프 또는 임의의 다른 조절된 액체 확산 시스템의 사용이 가능하다.
수동 주사와는 대조적으로, 관류에 의한 주사는 피부 생검의 진피내에서 조성물의 보다 균질한 확산을 허용한다. "보다 균질한 확산"은 주사 부위로부터 생검의 가장자리(즉, 바깥쪽 직경)까지 조성물 속의 화합물의 농도 구배에 있어서의 감소를 의미한다. 또한, 주입에 의한 주사는 보다 우수한 재생능을 보장한다.
"항-CD3 항체"는 CD3 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체 또는 이의 단편을 의미한다. CD3는 나이브(naive) T 세포의 표면에 존재하는 막 단백질 복합체이며 하나의 γ 쇄, 하나의 δ 쇄, 및 2개의 ε 쇄로 이루어진다. T 세포 수용체(TCR) 및 상보성 쇄 ζ와 연합시킴으로써, CD3는 세포내 신호를 형질도입시킬 수 있는 TCR 복합체의 형성을 허용한다. 항-CD3 항체의 시판되는 형태, 예컨대, 클론 UCHT1(Thermo Fisher 16-0038-81, Merck Millipore CBL150), 또는 클론 APA1/1(Merck Millipore 05-785, Thermo Fisher MA1-10182)가 존재한다.
바람직하게는, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 항-CD3 항체의 농도는 10 ng/μl 내지 100 ng/μl, 바람직하게는 20 ng/μl 내지 80 ng/μl, 및 특히 바람직하게는 30 ng/μl 내지 70 ng/μl의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 항-CD3 항체의 농도는 50 ng/μl이다.
"항-CD28 항체"는 CD28 항원에 특이적으로 결합할 수 있는 임의의 항체 또는 이의 단편을 의미한다. CD28은 특히 T 세포의 표면에 존재하고 이들의 생존, 이들의 클론 확장, 이들의 물질대사 활성 뿐만 아니라, IL-2 생산에 관여하는 공-자극 단백질이다. 시판되는 형태의 항-CD28 항체, 예컨대, 클론 15E8(Miltenyi Biotec 130-093-375) 또는 클론 CD28.6(Thermo Fisher 16-0288-81)이 존재한다.
바람직하게는, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 항-CD28 항체의 농도는 10 ng/μl 내지 100 ng/μl, 바람직하게는 20 ng/μl 내지 80 ng/μl, 및 특히 바람직하게는 30 ng/μl 내지 70 ng/μl의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 항-CD28 항체의 농도는 50 ng/μl이다.
보다 특수한 구현예에 따라서, 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체는 CD3에 대해 특이적으로 지시된 제1의 ScFV 단편 및 CD28에 대해 특이적으로 지시된 제2의 ScFV 단편을 가진 단일의 이특이적인 항체에 의해 대체된다. 이러한 이특이적 항체는 CD3 및 CD28 항원 둘 다에 대해 결합 특이성을 가지며 내재하는 T 세포 활성화는 항-CD3 및 항-CD28 일특이적인 항체의 것과 비교가능하게 작용한다.
"IL-2"는 인터루킨-2를 의미하며, 이는 유사분열에서 및 따라서 IL-2 수용체, 특히 T 헬퍼 세포를 수반하는 세포의 증식에 작용하는 사이토킨이다.
바람직하게는, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 IL-2의 농도는 1 ng/ml 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 2 ng/ml 내지 15 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 4 ng/ml 내지 12 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 IL-2 농도는 10 ng/ml와 동일하다.
항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물의 건강한 피부 생검내로의 주사 후 수 시간 내에, 진피 속의 내재하는 기억 또는 나이브 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 아집단이 활성화되고, 잠재적으로 증폭된다. 이러한 세포는 작은 수이고 진피 속에 무작위로 존재하므로, 조성물이 진피 전체에, 및 임의로 생검의 표피내로 균일하게 확산하는 것이 중요하다.
"유효량"은 예측된 효과를 달성하기에 충분한 양을 의미한다. 유효량의 이러한 개념은 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 또한 IL-2에 적용될 수 있다. 본 발명의 의미내에서 및 단계 a)와 관련하여, "예측된 효과"는 진피내에서 진피 내재성 T 세포의 활성화이다. 이러한 효과는 조성물의 주사가 주입을 통해 이루어진 경우 향상된다.
진피내에 내재하는 T 세포의 활성화는 CD69와 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 활성화 마커를 사용하여 직접 강조할 수 있다.
항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL-2의 유효량은 피부 생검의 크기에 따라 변한다.
유효량의 예로서 상기 나열된 농도와 관련하여 주사 용적의 사용을 언급할 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 건강한 피부 생검의 진피내로 주사된 조성물 속의 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL-2의 유효량은 직경이 8 mm인 생검의 경우 각각 500 ng, 500 ng, 및 0.1 ng이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 a)에서 건강한 피부 생검의 진피내로 주사된 조성물 속의 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL-2의 유효량은 직경이 15 mm인 생검의 경우 각각 1750 ng, 1750 ng, 및 0.35 ng이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 시험관내 방법은 단계 b) 전에 고화시킬 수 있는 액체 매트릭스 상에 단계 a)의 말기에 수득된 주사된 피부 생검을 침착시키는 단계 a')를 포함하며, 상기 매트릭스는 자체적으로 이의 바닥이 다공성 막으로 이루어진 세포 배양 삽입물 속에 함유되며, 상기 삽입물은 용기 또는 웰(well) 속에 배열됨으로써, 일단 매트릭스가 고화되면 피부 생검의 3D 통합성(integrity)이 유지되도록 한다.
"고화할 수 있는 액체 매트릭스"는 적어도 하나의 특이적인 화합물을 포함하는 임의의 액체 용액 또는 상기 액체 용액 속의 이의 농도가 적합한 조건, 특히 특수한 온도 조건을 시행하는 경우, 액체 용액이 고체 또는 겔-유사 조도(consistency)를 갖도록 하는 조성물을 의미한다. 이러한 구체적인 화합물 또는 조성물은 동물성, 식물성 또는 합성 기원일 수 있으며, 이의 특성 및 이의 농도는 고화되는 경우 매트릭스의 바람직한 생리-화학적 특성, 특히 매트릭스의 가요성 및 강도에 따라 측정된다.
본 발명의 방법의 구현예에 따라서, 단계 a')에서, 고화할 수 있는 상기 액체 매트릭스는 임의의 액체 용액, 바람직하게는 생존과 상용성인 특수한 조건 하에서 고화 또는 겔화될 수 있는 영양소 및 바람직하게는 생리학적 완충액으로서 최대 10%, 바람직하게는 적어도 20%, 적어도 30% 및 40%까지 희석된 혈액 혈장 또는 혈액 혈장으로부터 유래된 용액으로부터 선택된, 상기 피부 생검을 구성하는 피부 세포의 배양물, 피브리노겐 용액, 콜라겐 용액, 젤라틴, 합성 중합체 겔, 천연 겔, 예컨대, 아가로즈 겔, 특히 저 융점을 지닌 아가로즈 또는 아가-아가 겔(agar-agar gell), 전분 또는 다당류 겔, 또는 이의 혼합물 중에서 선택된다.
피부 생검을 고화시킬 수 있는 매트릭스 및 내부에 이를 둘 수 있는 방법은 유럽 특허원 EP 2 882 290 A1에 상세히 기술되어 있으며 이는 본원에 참고로 포함된다.
고화시킬 수 있는 매트릭스의 목적은 본 발명의 방법의 단계 a)의 말기에 수득된 피부 생검이 배양되도록 하고, 이의 보다 용이한 취급이 가능하도록 하는 것이다. "배양된"은 피부 생검, 다시 말해서 생검을 구성하는 조직 및 세포 모두의 생리학적 및 형태학적 상태의 유지를 의미한다.
고화시킬 수 있는 매트릭스의 목적은 또한 본 발명에 따른 방법에 의해 활성화된 내재하는 T 세포가 활성화된 피부 생검이 보존되고/되거나 수송되도록 하는 것이다.
고화시킬 수 있는 매트릭스의 특징은 피부 생검 세포가 살아있도록 하는 것인데, 다시 말해서 어떠한 세포독성 효과도 가지지 않고 실온(즉, 15℃ 내지 25℃)에서 고화/중합 온도를 갖는 것이다.
하나의 특수한 구현예에서, 고화시킬 수 있는 매트릭스는 사람 피브리노겐의 용액이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 시험관내 방법은 단계 a') 전에, 단계 a)의 말기에 수득된 주사된 피부 생검의 표피 표면에, 소수성 매트릭스로 이루어진, 이의 중심에 구멍이 뚫린 환 또는 디스크(disc)를 부착시키는 단계 a")를 포함하며, 상기 환의 외부 직경은 피부 생검의 표피 표면의 직경보다 더 크고 상기 환의 내부 직경은 피부 생검의 표피 표면의 직경 미만이다.
바람직하게는, 환의 소수성 물질은 피부에 대해 독성이 아닌 물질이며, 이는 파라핀 중합체, 예컨대, Parafilm®(Sigma), 또는 규소 중합체일 수 있다. 특수한 방식에 따라서, 환은 상기 필름을 목적한 치수에 따라 구멍을 뚫어서, 소수성 물질의 필름으로부터 제조한다. 환의 두께는 바람직하게는 0.1 mm 내지 2 mm, 바람직하게는 0.1 내지 1 mm, 보다 바람직하게는 0.1 내지 0.5 mm, 및 심지어 보다 바람직하게는 0.12 내지 0.2 mm이다.
상기 환은 불투명하거나 반투명한 물질로 제조될 수 있다. 특수한 구현예에 따라서, 환은 불투명한 물질로 제조된다.
보다 특수한 구현예에 따라서, 상기 환은 바람직하게는 환의 보다 낮은 표면에 첨가된 풀(glue)을 사용하여 생검의 표피 표면에 부착된다. 상기 풀은 피부에 대해 독성이 아니며 피부에 환을 부착시키는 효과를 갖는 임의의 유형의 물질로부터 선택될 수 있으며, 여기서 이러한 물질은 규소일 수 있다. 바람직하게는, 상기 풀은 소수성이다.
이러한 소수성 환의 물질, 풀 및 부착 방법은 유럽 특허원 EP 2 882 290 A1에 상세히 기술되어 있으며 이는 본원에 참고로 포함된다.
"단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리한다"는 진피에 이미 주사된 피부 생검을 이의 생존에 필수적인 모든 성분을 함유하는 배양 배지 속에서 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물과 함께 위치시키는 단계를 의미한다. 따라서, 단계 b)는 단계 a)의 말기에 수득된 피부 생검을 이의 생존에 필수적인 성분 모두를 함유하는 배양 배지 속에서 접촉시킴으로써 수행된다.
이러한 단계 b)에서, 단계 a)의 말기에 활성화된 진피내 내재하는 T 세포는 LTh1 및/또는 LTh17 세포로 추가로 분극화된다. "분극화되다"는 활성화되어 내재하는 T 세포의 LTh1 및/또는 LTh17 T 헬퍼 세포 계통으로의 분화를 의미한다.
"Th1 세포"는 사이토킨 IL-12 및 IFN-γ의 효과하에서 나이브 CD4+ T 세포의 분화로부터 유래된 T 세포의 소집단을 의미하며 이는 이러한 소집단, 즉, IFN-γ, TNF-α, 및 IL-2에 대해 특이적인 사이토킨 합성 프로파일을 지닌다.
"Th17 세포"는 사이토킨 TGF-β, IL-6, IL-1, 및 IL-23의 효과 하에서 기억 또는 나이브 CD4+ 및/또는 CD8+ T 세포의 분화로부터 유래되고 이러한 소집단, 즉, IL-17, 및 IL-22에 대해 특이적인 사이토킨 합성 프로파일을 갖는 T 세포의 소집단을 의미한다.
이러한 2개의 세포 소집단 Th1 및/또는 Th17에 대해 특이적인 사이토킨의 생산의 측정은 이러한 세포의 수와 직접 관련된다.
이러한 분화는 본 발명의 방법의 단계 a)에서 정의된 바와 같이 이미 주사된 건강한 피부 생검을 배양 배지에 가함으로써 유도되며, 조성물은 인터루킨-1베타(IL-1β), 인터루킨-23(IL-23), 및 형질전환 성장 인자 베타(TGF-β)의 적어도 하나의 혼합물의 유효량을 포함한다.
"인터루킨-1베타"는 세균 공격에 대한 반응시 대식구 및 수지 세포에 의해 천연적으로 분비된 전구체의 카스파제1 단백질분해로부터 유래된 대략 30 kDa의 단백질을 의미한다. 이러한 사이토킨은 염증성 반응의 중요한 매개인자이며 증식, 분화, 및 세포자멸사를 포함하는 많은 세포 활성에 연루되어 있다.
"인터루킨-23"은 IL-23에 대해 특이적인 p19 소단위, 및 IL-12에 대해 일반적인 p40 소단위로 구성된 약 60 kDa의 이종이량체성 단백질을 의미한다. T 세포의 일부 소집단의 표면에 존재하는 이종이량체성 수용체 IL12RB1 및 IL23R에 결합함으로써, 이러한 사이토킨은 기억 T 세포를 자극시켜 전-염증성 사이토킨의 합성을 야기시킬 수 있다.
"TGF-β"는 전구체로서 합성된 사이토킨의 성숙한 형태에 상응하는 25 kDa 이량체성 단백질을 의미한다. 이러한 사이토킨은 다수의 세포, 예를 들면, 대식구에 의해 분비되며, 증식으로부터 세포자멸사까지의 범위로 세포에서 다면발현형 효과를 발휘한다. TGF-β는 또한 염증 조절에 있어서 매우 중요한 역활을 담당한다.
본 발명의 의미내에서 및 단계 b)와 관련하여 "유효량"은 단계 a)에서 활성화된 T 세포의 LTh1 및/또는 lTh17로의 분극화, 및 염증 마커의 합성을 수득하기 위한 유효량의 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β를 의미한다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 IL-1β의 농도는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 30 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 7 ng/ml 내지 15 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 IL-1β의 농도는 10 ng/ml이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 IL-23의 농도는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 30 ng/ml 내지 60 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 IL-23의 농도는 50 ng/ml이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 TGF-β 농도는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 30 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 7 ng/ml 내지 15 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 TGF-β의 농도는 10 ng/ml이다.
보다 특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물의 혼합물 중 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 농도는 각각 10 ng/ml, 50 ng/ml, 및 10 ng/ml이다.
본 발명의 방법의 단계 b)는 진피의 활성화된 TCD4+ 세포의 Th1 및/또는 Th17 세포로의 분극화를 허용하기에 충분히 긴 기간 동안 CO2 항온처리기 속에서 37℃에서 수행된다.
바람직하게는, IL-1β, IL-23, 및 TGFβ의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물의 존재하에서 단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리하는 단계 b)는 적어도 3일의 기간, 바람직하게는 3 내지 10일 동안 수행된다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)의 항온처리 기간은 5일 이상일 수 있다.
특수한 구현예에 따라서, IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물의 존재하에서 단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리하는 단계 b)의 기간은 7일이다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 b)에서 사용된 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물은 혼합물의 구성성분의 일정한 농도, 수분 내지 수시간인 용액 속의 이들의 반감기를 유지시키기 위하여 흔히 재생된다.
특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b)에 사용된 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물은 이러한 단계의 지속 전반에 걸쳐서 매일 재생된다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 본 발명에 따른 방법은 또한 화합물의 소염 효능을 평가하는 것을 목표로 하며 다음의 추가의 단계를 포함한다:
c) 후보물 화합물과 LTh1- 및/또는 LTh17-분극화된 T 세포를 포함하는 단계 b)의 말기에 수득된 염증이 생긴 피부의 모델을 접촉시키는 단계;
d) 염증이 생긴 피부의 모델의 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
e) 단계 d)에서 수득된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 이들의 대조군 발현 수준과 비교하는 단계;
f) 단계 d)에서 측정된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준이 이들의 대조군 발현 수준보다 더 낮은 경우 상기 후보물 화합물의 소염 효능을 확인하는 단계.
"소염 효능"은 전-염증성 사이토킨의 생산을 감소시키고, 소염성 사이토킨의 합성을 촉진하며, 면역계 세포의 증식을 조절하는 것과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 염증을 감소시키는 화합물의 능력을 의미한다.
"후보물 화합물"은 염증 조절인자로서 이의 잠재적인 용도에 대해 선택된 임의의 합성 또는 천연 화학물질을 의미한다. 후보물 화합물은 정제되거나 혼합될 수 있다. 후보물 화합물은 소 분자. 거대분자, 및 중합체를 포함한다. 일부 구현예에서, 후보물 화합물은 화학적 합성에 의해 생산되거나 조합 라이브러리에 함유된 분자일 수 있다. 일부 구현예에서, 후보물 화합물은 이의 구조가 컴퓨터 또는 3-차원 분석으로 설계된 분자 또는 거대분자일 수 있다. 후보물 화합물은 또한 유기 공급원(예컨대, 동물 추출물, 식물 추출물, 및 미생물 용해물)로부터의 조 또는 정제된 추출물을 포함한다. 본 발명의 시행시 사용된 후보물 화합물은 불활성 완충제(예컨대, 염 용액) 또는 적절한 용매(예컨대, 디메틸설폭사이드(DMSO), 알코올, 예컨대, 메탄올 및 에탄올, 화장용 조성물에 사용된 수용액 또는 임의의 다른 화합물과 조합될 수 있다.
"염증 마커"는 염증이 생기지 않은 세포, 조직 또는 기관과 비교하여 염증이 있는 세포, 조직 또는 기관에서 발현 수준에 있어서의 변화를 나타내는, 발현가능한 성분, 또는 이에 의해 발현된 성분을 의미한다. 일부 염증 마커는 염증이 생기지 않은 세포, 조직 또는 기관과 비교하여 염증이 생긴 세포, 조직 또는 기관내 발현 수준에 있어서 통계적으로 유의적인 차이(p≤0.10)를 나타낸다. 예를 들면, "염증 마커"는 염증이 생기지 않은 유사한 조직 속에 함유된 동일한 유형의 세포와 비교하여 염증이 생긴 조직내에 함유된 세포내에서 상이한 비율에서 발현된 유전자, 유전자 단편, 또는 암호화 영역일 수 있다. "염증 마커"는 단백질의 물리적 존재 또는 단백질의 활성 특성에 의해 측정된, RNA(예컨대, mRNA) 생산 또는 단백질 생산에 상응할 수 있다. 염증 마커의 목록은 상기 설명 부분에서 이미 제공되어 있다.
염증 마커(mRNA 또는 단백질)의 특성에 따라서, 당해 분야의 기술자에게 잘 공지된 검출 마커를 적용할 것이다. 이것은 단백질의 검출을 위한 웨스턴 블롯(western blot) 또는 ELISA-형 시험을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 목적한 유전자의 mRNA 발현은 미세배열, RNA-Seq 또는 NextGen 서열분석 기술을 사용하여 측정할 수 있다. 염증이 생긴 피부의 모델, 염증이 생긴 피부의 모델 전부 또는 일부, 또는 구체적으로 진피 또는 표피내, 또는 진피 및/또는 표피의 특정 세포 아형의 모델의 배양 배지 속에서 염증 마커를 직접 측정하는 것이 또한 가능하다.
단계 c)에서 후보물 화합물을 염증이 생긴 피부의 모델과 접촉시키는 것은 국소적으로 또는 배양 배지 속에서 직접 수행할 수 있다. 국소 적용의 경우, 본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)로부터 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피 표면은 후보물 화합물의 적용 전에 건조된다(즉, 표피로부터 가능성이 있는 미량의 액체가 제거된다).
단계 c)에서 후보물 화합물과 염증이 생긴 피부의 모델을 접촉시키는 이러한 단계는 피하 주사에 의해 수행되는 것이 또한 가능하다. 이러한 구현예는 고 분자량을 가지거나, 고 친수성이거나 용이하게 분해되는 후보물 화합물의 경우 특히 적절하다. 예로써, 이러한 화합물은 단백질성 특성, 특히 항체의 후보물 화합물일 수 있다.
바람직하게는, 후보물 화합물과 염증이 생긴 피부의 모델을 접촉시키는 단계 c)는 수분 내지 수시간, 또는 심지어 수일 지속될 수 있다. 후보물 화합물의 특성, 안전성, 용해도, 또는 임의의 다른 생리화학적 특징에 따라서, 이러한 접촉은 또한 총 7일의 지속 동안 매일 재생될 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 d)에서, 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 및 특히 바람직하게는 적어도 5개의 염증 마커의 발현 수준이 측정될 것이다.
염증 마커는 앞서 정의된 바와 같다.
특수한 구현예에 따라서, 단계 d)는 또한 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 3개, 바람직하게는 적어도 4개, 특히 적어도 5개 및, 특히 바람직하게는 적어도 6개의 염증 마커의 발현 수준을 측정함을 포함한다.
대조군 발현 수준은 단계 b)에서, 및 이를 후보물 화합물과 접촉시키는 단계 c) 전에 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델에서 측정될 수 있다.
대조군 발현 수준은 또한 염증성 피부 상태, 특히 건선을 지닌 한명 이상의 환자로부터 취한, 특히 건선 병변을 지닌, 염증이 생긴 피부의 하나 이상의 샘플내에서 측정할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 방법의 단계 f)의 말기에, 적어도 2개의 염증 마커의 단백질 및/또는 유전자 발현이 수준에 있어서 적어도 10%, 바람직하게는 적어도 30%, 바람직하게는 적어도 50%, 및 특히 바람직하게는 적어도 80%까지의 감소와 연관된 후보물 화합물이 선택될 것이다.
이러한 방법은 존재하는 염증에서 치료 효과를 갖는 화합물을 확인하는 것을 가능하도록 한다.
이러한 효과는 문서 WO 2014/182655 A1에서 개발된 모델로 측정할 수 없다. 실제로, 이러한 모델은 진피의 내재하는 T 세포의 활성화 후 최대 48시간에서만 분석될 수 있는 것으로 여겨진다.
발생으로부터 염증을 방지하는데 있어서 화합물의 유효성을 시험하는 것이 또한 가능하다.
여전히 다른 특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 방법의 단계 b) 및 c)를 동시에 수행하여 시험 하에서의 후보물 화합물이 소염 효과를 갖는 경우에 염증의 발생을 방지한다.
화합물의 예방학적 효능을 시험하는 것도 가능하다.
이러한 경우에, 본 발명의 방법의 단계 a), b) 및 c)의 순서는 염증의 발생을 방지하기 위하여 역전된다. 이러한 구현예에서, 후보물 화합물을 피부 모델과 접촉시키는 것은 진피내 내재하는 T 세포를 활성화하는 단계 a) 및 분극화하는 단계 b) 이전에 일어난다.
본 발명의 방법은 또한 피부 세포 소집단에서 시험관내 시험, 효소적 시험, 또는 심지어 염증성 피부 질환(즉, 피부염, 건선 병변…)을 지닌 환자로부터의 피부 생검에서 수행된 생체외 시험과 같은, 그러나 이에 한정되지 않는, 피부 염증을 조절하는 후보물 화합물에 대한 다른 스크리닝 시험외에 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 목적은 진피, 표피, 표피 부속물, 및 임의로 피하조직을 포함하는, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델에 관한 것이며, 여기서 LTh1 및/또는 LTh17로 분극화된 활성화된 T 세포는 표피 각질형성세포의 염증을 촉진시켰다.
바람직하게는, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 진피, 표피, 표피 부속물, 및 Th1 및/또는 Th17 세포이며 적어도 2개의 염증 마커의 발현 및, 임의로 각질형성세포 고증식에 의해 특징화된다.
여전히 바람직하게는, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 진피, 표피, 표피 부속물, 피하조직, 및 Th1 및/또는 Th17 세포를 포함하며 적어도 2개의 염증 마커의 발현 및, 임의로 각질형성세포 증식에 의해 특징화된다.
적어도 2개의 염증 마커의 발현의 측정은 단백질 및/또는 유전자 수준에서 수행될 수 있다.
바람직한 구현예에 따라서, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 진피, 표피, 표피 부속물, 및 Th1 및/또는 Th17 세포를 포함하며 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 염증 마커 및 적어도 3개, 특히 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개, 및 특히 바람직하게는 적어도 6개의 염증 마커의 단백질 및/또는 유전자 수준에서의 발현에 의해 특징화된다.
다른 바람직한 구현예에 따라서, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 진피, 표피, 표피 부속물, 피하조직, 및 Th1 및/또는 Th17 세포를 포함하며 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 염증 마커 및 적어도 3개, 특히 적어도 4개, 바람직하게는 적어도 5개, 및 특히 바람직하게는 적어도 6개의 염증 마커의 단백질 및/또는 유전자 수준에서의 발현에 의해 특징화된다.
이의 생체외 생존 유지, 이의 취급 및 이의 수송을 최적화하기 위하여, 염증이 생긴 피부의 상기 생체외 모델을 공기와 접촉하는 표피를 유지시키는 고화된 매트릭스내에 위치시킬 수 있으며, 상기 매트릭스는 세포 배양 삽입물 속에 함유된다.
본 발명의 다른 목적은 용기 또는 배양 박스 웰 속에 함유시키기에 적합하고, 이의 바닥이 다공성 막(40)으로 이루어진, 세포 배양 삽입체(10)에 관한 것이며, 상기 삽입체는 고화된 매트릭스(20)에 포매된 염증이 생긴 피부(30)의 생체외 모델을 함유하며, 상기 매트릭스는 삽입체의 내부 가장자리 및 다공성 막과 접촉되며, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피는 대기와 접촉되며 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 진피 및 표피 부속물은 고화된 매트릭스 속에 침지된다.
특별한 구현예에 따라서, 이의 바닥이 다공성 막으로 이루어진 상기 세포 배양 삽입체는 나셀(nacelle)의 형태(즉, U)이고, 바람직하게는 이의 직경이 5 내지 40 mm, 보다 바람직하게는 9.5 내지 30 mm의 범위인 삽입체이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 용기 속 또는 배양 박스 웰내에 함유시키기에 적합하고, 이의 바닥이 다공성 막(40)으로 이루어진 상기 세포 배양 삽입체(10)는 고화된 매트릭스(20) 속에 포매된 본 발명의 방법의 단계 a)의 말기에 수득된 주사된 건강한 피부 생검(30)을 함유하며, 상기 매트릭스는 삽입체의 내부 가장자리 및 다공성 막과 접촉되고, 피부 생검의 표피는 대기와 접촉되며 피부 생검의 진피 및 표피 부속물은 고화된 매트릭스 속에 침지된다. 임의로, 고화된 매트릭스는 또한 적어도 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 혼합물을 함유한다.
여전히 바람직하게는, 상기 세포 배양 삽입체는 현탁되거나 적층물(piles) 위에 있는, 바람직하게는 러그(lug)(60)의 수단에 의해 현탁된 삽입체이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 소수성 환(50)은 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피 표면에 부착된다.
여전히 바람직하게는, 상기 다공성 막은 바람직한 다공성인, 바람직하게는 0.4 내지 8 μm, 보다 바람직하게는 0.4 내지 1.5 μm, 0.8 μm 내지 1.2 μm 범위인 액체 매트릭스를 이의 고화 전에 막을 통해 유동하는 것을 방지하기 위한 가공성을 지닌 막이다.
여전히 바람직하게는, 상기 다공성 막은 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 니트로셀룰로즈, 또는 폴리카보네이트로부터 선택된 막이다.
세포 배양물 중에서 특히 NUNC 캄파니(덴마크 로스킬데 소재), BD Falcon(BECTON DICKINSON France SAS, 프랑스 르 퐁-드-클라익 38 801 소재), Millicell®(EMD MILLIPORE CORPORATION, 미국 매사츄세츠주 빌레리카 소재), 또는 Costar®(Grosseron SAS, 프랑스 세인트-헤르블라이 44819 소재)에 의해 공급된 것, 예를 들면, 6, 8, 12, 및 24 웰을 지닌 다중-웰 플레이트 속에 예비-패키지된 폴리카보네이트, PET 또는 니트로셀룰로즈로 제조된 막을 지니고, 이의 막 다공성이 0.4 내지 8 μm에서 변할 수 있는 삽입체가 언급될 수 있으며, 여기서 막 다공성이 0.8 μm 내지 1 μm인 8-웰 박스 및/또는 박스들 및/또는 PET가 가장 바람직하다.
특수한 구현예에 따라서, 상기 세포 배양 삽입체가 놓여있는 상기 용기는 6, 8, 12, 24, 또는 48개 웰을 지닌 세포 배양 플레이트의 웰이다.
이러한 배양 플레이트 중에서 특히 NUNC, BD FALCON에 의해, 또는 참고물 Millicell® 또는 Costar® 하에 공급된 것이 언급될 수 있다.
바람직하게는, 세포 배양물 삽입체의 바닥은 상기 삽입체를 함유하는 용기의 바닥으로부터, 특히 배양 플레이트의 벽의 바닥(또는 명칭에 따라 페트리 디쉬의 바닥)으로부터 1 mm 내지 2.5 mm 사이의 거리에 위치한다.
본 발명의 염증이 생긴 피부의 모델의 장점은 특히 동일한 공여자 또는 별도의 공여자로부터 건강한 피부의 샘플(즉, 생검)을 반복적으로 사용함으로써, 소염 화합물에 대한 스크리닝을 대규모로 수행하는 것이 가능하다는 것이다. 다수의 후보물 화합물을 수십 내지 수백개 또는 심지어 수천개 스크리닝할 수 있다. 몇명의 공여자로부터의 염증이 생긴 피부의 모델을 수득하는 한가지 장점은 염증 마커의 비율의 개인간 조절을 비교함으로써 피부 염증을 감소시키는데 있어서 가장 활성인 후보물 화합물을 확인할 수 있다는 것이다.
본 발명의 여전히 다른 목적은 소염 효과를 지닌 화합물을 확인하기 위한 상술한 방법에 의해 수득가능한 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 용도에 관한 것이다.
상술한 방법에 의해 수득가능한 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 구조는 사실상 이들의 생이용능에 영향을 미치는, 피하 주사 또는 국소 적용후 소염 효과를 지닌 화합물의 적절한 확산을 허용한다.
본 발명의 이러한 사용에 따라 확인된 화합물은 급성 또는 만성 피부 염증을 지닌 환자에 대한 치료학적 처리의 개발을 위한 기반으로서 제공할 수 있다. 본 발명에 따른 이러한 사용은 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델에서 시험된 다양한 화합물의 소염 효과의 강도에 따라 환자들 간에 맞춰질 수 있는 치료요법을 구상하는 것이 가능하다.
염증성 피부 질환 중에서, 아토피성 피부염, 건선, 습진, 피부병증, 알레르기성 접촉 피부염, 태선, 소양증, 네써톤 증후군(Netherton's syndrome), 심상 어린선…이 언급될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 특수한 구현예에 따라서, 상술된 방법에 의해 수득가능한 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 건선을 치료하기 위한 화합물이 확인되도록 한다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명의 방법을 시행하기 위한 키트에 관한 것이며, 이러한 키트는 포유동물로부터 이미 취한 건강한 피부 생검, 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물 A, IL-1β, IL-23, 및 TGFβ의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물 B, 및 임의로 특히 주입에 의한 주사 장치를 포함한다.
바람직하게는, 조성물 A 속의 항-CD3의 유효량은 10 ng/μl 내지 100 ng/μl, 바람직하게는 20 ng/μl 내지 80 ng/μl, 및 특히 바람직하게는 30 ng/μl 내지 70 ng/μl의 범위이다.
바람직하게는, 조성물 A 속의 항-CD28의 유효량은 10 ng/μl 내지 100 ng/μl, 바람직하게는 20 ng/μl 내지 80 ng/μl, 및 특히 바람직하게는 30 ng/μl 내지 70 ng/μl의 범위이다.
바람직하게는, 조성물 A 속의 IL-2의 유효량은 1 ng/ml 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 2 ng/ml 내지 15 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 4 ng/ml 내지 12 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 조성물 A 속의 항-CD3 항체, 항-CD28 항체, 및 IL-2의 유효량은 각각 50 ng/μl, 50 ng/μl, 및 10 ng/ml이다.
바람직하게는, 조성물 B의 혼합물 속의 IL-1β의 농도는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 30 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 7 ng/ml 내지 15 ng/ml의 범위이다.
바람직하게는, 조성물 B의 혼합물 속의 IL-23 농도는 10 ng/ml 내지 100 ng/ml, 바람직하게는 20 ng/ml 내지 80 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 30 ng/ml 내지 60 ng/ml의 범위이다.
바람직하게는, 조성물 B의 혼합물 속의 TGF-β 농도는 1 ng/ml 내지 50 ng/ml, 바람직하게는 5 ng/ml 내지 30 ng/ml, 및 특히 바람직하게는 7 ng/ml 내지 15 ng/ml의 범위이다.
특수한 구현예에 따라서, 조성물 B의 혼합물 속의 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 양은 각각 10 ng/ml, 50 ng/ml, 및 10 ng/ml이다.
본 발명에 따른 키트에서, 건강한 피부 생검은 눈에 의해 감지할 수 있는 염증의 어떠한 신호(즉, 피부내 파열, 홍조, 팽윤, 열, 또는 과도한 스케일링…)를 나타내지 않거나 임의의 염증 마커를 발현하지 않는 피부 단편으로부터 취해진다. 또한, 상기 건강한 피부 생검은 적어도 표피, 진피, 및 표피 부속물, 및 임의로 피하 조직으로서 또한 지칭된 피하 조직의 일부를 포함한다.
바람직하게는, 상기 피부 생검은 동물, 특히 포유동물로부터, 바람직하게는 사람으로부터 취해진다. 본 발명의 키트에서 사용될 수 있는 생검으로서 수술 폐기물 또는 도축장으로부터 수득된 것이 언급될 수 있다. "수술 폐기물"은 안검성형술 후(post-blepharoplasty), 코성형술, 복강성형술, 또는 유방 축소를 포함하는 성형 수술로부터 수득된 피부 이식체를 의미한다. 피부 생검 샘플채취 기술은 당해 분야의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명에 따른 키트에서, 수동 주사 장치는 26S 또는 22S 형식을 지닌 침 속에 무용 부피가 없는 주사기를 포함한다.
본 발명에 따른 키트에서, 주입 주사 장치는 28G- 또는 30G-형식 침에 연결된 카테터(catheter)에 연결된 삼투압 펌프를 포함한다.
본 발명의 여전히 다른 목적은:
- 용기 또는 배양 박스 웰 속에 함유되기에 적합하고, 이의 바닥이 다공성 막(40)으로 이루어진 적어도 하나의 세포 배양 삽입체(10)로서, 상기 삽입체는 고화된 매트릭스(20) 속에 포매된 본 발명의 방법의 단계 a)의 단계 말기에 수득된 주사된 건강한 피부 생검(30)을 함유하며, 상기 매트릭스는 삽입체의 내부 가장자리 및 다공성 막과 접촉되며, 피부 생검의 표피는 대기와 접촉되고 피부 생검의 진피 및 표피 부속물은 고화된 매트릭스 속에 침지되는 적어도 하나의 세포 배양 삽입체,
- IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물 B를 포함하는 키트에 관한 것이다.
다른 특수한 구현예에 따라서, 본 발명의 상기 키트는:
- 용기 또는 배양 박스 웰 속에 함유시키기에 적합하고, 이의 바닥이 다공성 막(40)으로 이루어진 적어도 하나의 세포 배양 삽입체(10)로서, 상기 삽입체는 적어도 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 혼합물을 함유하는 고화된 매트릭스(20) 속에 포매된 본 발명의 방법의 단계 a)에서 수득된 주사된 건강한 피부 생검(30)을 함유하고, 상기 매트릭스는 삽입체의 내부 가장자리 및 다공성 막과 접촉되며, 피부 생검의 표피는 대기와 접촉되고 피부 생검의 진피 및 표피 부속물은 고화된 매트릭스 속에 침지된 삽입체,
- IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물 B를 포함한다.
다음의 실시예는 본 발명의 주제를 설명하는 방식으로만 제공되며, 어떠한 방식으로도 이를 제한하지 않는다.
실시예
1-피부 생검의 제조
피부 생검은 표피, 진피, 및 피하조직을 포함하는 완전한 피부 샘플로부터 제조한다. 이러한 생검을 기반으로 하여, 2개의 상이한 구현예가 시험될 소염 화합물의 특성에 따라 가능하다.
제1 구현예에서, 지방 조직(즉, 피하조직)을 커브 가위(curved scissor)로 절단하여 이를 진피로부터 분리한다. 이의 두께가 약 3 mm인 생검(표피 및 진피)을 금속 펀치를 사용하여 절단한다. 이러한 제1 구현예는 국소 적용에 의해 소염성 화합물을 시험하기 위한 것이다.
제2 구현예에서, 피하조직은 보존된다. 이의 두께가 약 1 cm인 생검(표피, 진피, 및 피하조직)을 이후 금속 펀치를 사용하여 절단한다. 이러한 제2의 구현예는 피하 주사에 의해 소염성 화합물을 시험하기 위한 것이다.
일단 제조되면, 생검을 내재하는 T 세포 활성화 단계까지 완충된 염수 속에 부유하도록 유지시킨다.
2-내재하는 T 세포의 활성화
클램프(clamp)를 사용하여, 피부 생검을 상단에 진피와 함께 편평하게 유지시킨다. 무용 부피가 없는 침을 701N 또는 705N 해밀톤 주사기(Hamilton syringe)(각각 8 mm 또는 15 mm 직경의 생검)를 사용하여 진피의 측면으로부터 생검내로 삽입시킨다. 각각 8 또는 15 mm 직경의 생검에 대해 10 μL 또는 35 μL의 활성화 용액(50 ng/μl 항-CD3 항체, 50 ng/μl 항-CD28 항체, 및 10 ng/mL IL-2)을 생검의 측면으로부터 주사하여 표피에 대한 손상을 피한다.
주사를 주입에 의해 수행하는 경우, 200 μL의 활성화 용액을 삼투압 펌프(시험된 2001D 펌프 모델의 경우)내로 로딩(loading)한다. 용액의 농도는 생검의 크기에 따라서 조절하였다: 8 mm 직경의 생검의 경우 2.5 ng/μl 항-CD3 항체, 2.5 ng/μl 항-CD28 항체, 0.5 ng/mL IL-2; 15 mm 직경의 생검의 경우 8.75 ng/μL 항-CD3 항체, 8.75 ng/μl 항-CD28 항체, 1.75 ng/mL IL-2.
펌프를 이후에 유동 조절인자를 사용하여 카테터에 연결시킨다. 이후에 펌프를 프라이밍(priming)한다: 이를 완충된 염수 속에 두고 37℃에서 3시간 동안 항온처리한다.
이러한 항온처리 말기에, 카테터(펌프에 연결되지 않음)의 유리 말단을 침에 연결시킨다. 생검의 진피내로의 침의 이식을 상술한 바와 동일한 방식으로 수동으로 수행한다: 피부를 상단 위의 진피를 사용하여, 클램프로 편평하게 유지시킨다. 침을 생검의 측면으로부터 진피내로 삽입시켜 표피가 손상되지 않도록 한다.
이식된 생검을 이후에 적절한 배양 배지 상에서 부유하도록 둔다. 펌프를 완충된 염수 용액 속에 침지시켜 유지시킨다. 이중 모두를 24시간 동안 37℃, 5% CO2, 및 최대 습도에서 항온처리한다.
24시간의 주입 말기에, 침을 생검으로부터 제거함으로써 펌프를 끊는다.
3 - 생체외 배양
이의 내재하는 T 세포가 활성화된 피부 생검을 시험관내 배양된 사람 피부 또는 표피 외식편에 대해 물리적 지지체 및 영양 층으로서 천연 매트릭스의 사용을 기반으로 하여, NativeSkin® 모델에 대해 사용된 것과 동일한 방법을 사용하여 배양 삽입체내로 부어진 액체 매트릭스 위에 올려놓는다. 이후에, 외식편을 플레이트(항온처리기 배양물, 배양 배지를 매일 재생시킴) 속에서 배양한다.
4 - Th1/Th17 내로의 T 세포의 분화
윌리암 E 합성 배양 배지(WILLIAM'S E synthetic culture medium) 속에, 다음의 보충물을 가한다: 10 ng/mL IL-1β, 50 ng/mL IL-23, 및 10 ng/mL TGF베타. 배양물을 7일 동안 37℃에서 CO2 항온처리기 속에서 수행한다. 보충물을 함유하는 배양 배지를 매일 교환한다.
진피 속의 내재하는 T 세포의 활성화 및 분화 단계 후, 피부 생검은 표피 및 진피를 포함하는 경우 상표명 InflammaSkin®를 가지거나 또는 표피, 진피, 및 피하조직을 포함하는 경우 상표명 Hypo-InflammaSkin®을 갖는다.
5 - 조직학적 분석
5.1 마이크로톰 절단(microtome cutting)
분석을 마이크로톰을 사용한 일련의 절개(section)에 의해 파라핀 블록내에 포함된 샘플에서 수행할 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에 따라 처리된 피부 생검을 알코올 욕(bath)으로 탈수시킨 다음, 크실렌 욕을 통과시켰다. 파라핀 속의 제1 욕은 피부 외식편 속에 이미 함유된 물이 파라핀으로 교체되도록 한다.
파라핀-함침된 샘플을 이들의 욕에서 꺼내어 용기에 이전시키며, 이의 바닥은 흡수성 종이가 줄지어 놓여 있어, 포매된 상태의 부근에 끌려가게 된다.
조직학 카세트 속에 동봉된 샘플을 56℃에서 액체 파라핀 속에 침지시켜 이들을 함침시키는 파라핀을 재용해시킨다.
각각의 샘플의 경우: 조직학 카세트를 열고, 샘플을 가능하게는 이의 1/2로 절단한다. 포매된 주형을 액체 파라핀으로 채우고, 샘플(또는 2개의 샘플 조각)을 주형 속에 두고 절단을 위해 목적한 방향으로 배향시킨다. 동시에, 주형을 냉동된 랙(rack) 위로 이동시켜 주형의 바닥에서 파라핀을 고화시키고 여기에 샘플을 유지시킨다. 샘플 참고물이 들어있는 조직학 카세트의 뚜껑을 그 위에 두어서, 파라핀이 이를 통해 통과하도록 한 다음(파라핀은 필요할 경우 가할 수 있다), 조립체를 냉 저장기(냉장고, 냉동기, 냉 실내…) 속에 수분(5 내지 6) 동안 두어서, 파라핀을 블록으로 고화시켜, 샘플을 우측 배향으로 및 블록의 지지체가 될 조직학 카세트의 뚜껑 속에 가둔다.
일단 블랙이 고체가 되면, 이를 주형으로부터 방출시킨다. 과량의 파라핀을 포매되는 카세트의 뚜껑의 측면에서 스패튤라(spatula)로 가능하게는 긁어서 제거한다.
이후에, 두께가 4 내지 5 μm로 변하는 일련의 부분(section)을 샘플을 함유하는 파라핀 블록의 전체 길이를 따라 제조한다.
도 2는 Th1 및/또는 Th17 세포로 활성화된 내재하는 T 세포의 분극화 배지 속에서 5 또는 7일의 배양 후 본 발명의 방법에 따라 처리한 피부 생검에서 수행한 이러한 염색의 결과를 나타낸다. 조직학(예컨대, 헤마톡실린 및 에오신 염색)에 의한 모델의 분석은 분극화 배지 속에서 활성화된 생검의 7일 배양 후 표피에서 해면화(S)의 외관 뿐만 아니라 표피 융기 신장(E)의 형성을 입증하도록 한다.
분석을 조직학에서 항-CD207, 항-CD3, 항-HLA-DR, 및 항-트립타제 면역염색을 사용하여 수행함으로써 건강한 피부 생검 속에 함유된 일부 세포 소집단을 확인하였다. 핵 역염색을 DAPI를 사용하여 수행하였다. 도 3에서의 결과는 건강한 피부 생검이 T0 내지 배양 7일 후에 랑게르한스 세포(CD207), 내재하는 T 세포(CD3), 수지 세포(HLA-DR), 및 비만 세포(트립타제)를 함유함을 나타낸다.
5.2 - 크리오섹션(cryosection)
분석을 또한 동결된 부분에서 수행하여 탈수시 세포/구체(들)을 변경시키지 않을 수 있다.
본 발명의 방법의 단계 a) 및 b)에 따라 처리된 피부 생검의 배양은 샘플을 24시간 동안 10% 포르말린의 이의 용적의 10배에서 고정시킴으로써 중단시킨다. 이후에, 외식편을 PBS의 이의 용적의 10배로 세정하고, 압지(absorbent paper) 위에 블롯팅하고, 에펜도르프 튜브로 이전시켰다. 에펜도르프 튜브를 외식편이 동결될 때까지 액체 질소 속에 침지시켰다.
저온유지장치 인클로저(cryostat enclosure) 속에서, 동결된 외식편을 OCT에 가둔 다음, 이식된 구체(들)을 함유하는 외식편의 일부의 3 내지 15μm의 일정 두께의 슬라이스를 제조한다. 슬라이스를 슬라이드 위에 두고 이를 적어도 수 시간 동안 건조시킨다.
해마톡실린 및 에오신을 사용한 전통적인 염색을 수행한다.
6 - 염증이 생긴 피부의 모델의 확인
6.1 - 염증 마커
모델에 의해 생산된 사이토킨 IL-17A, IL-22, 및 IFNγ를 배양 배지 속에서 ELISA 검정에 의해 메소 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)(U-PLEX TH17 Combo 2 Human Reference K15076K)로부터의 특수 검출 키트 및 멀티플렉스 검정 플랫폼(MESO QuickPlex SQ 120)을 사용하여 분석하였다.
도 4는 상이한 모델에서 사이토킨 검정으로 수득된 결과를 나타낸다. NativeSkin® 모델은 표피 및 진피를 포함하는 피부 생검이며, 피하조직을 포함하지 않는다. 전 Th17/Th1 분극화 칵테일(2)의 존재하에서 배양된 표준 NativeSkin®(1) 또는 NativeSkin® 모델과는 대조적으로, 사이토킨 IL-17A(도 4a) 및 IL-22(도 4b)를 본 발명의 방법으로 수득된 InflammaSkin® 모델(3)에 의해 단독으로 생산한다.
6.2 - 각질형성세포 활성화
본 발명의 방법의 단계 b)의 말기에, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은 건선 환자의 건선 병변에서 관찰된 것과 비교가능한 특징적인 신호를 나타낸다. 하기 표는 이러한 마커 중 일부의 외관을 나타낸다.
IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 혼합물의 존재하에서 피부 생검의 5일 항온처리 후, 각질형성세포 과증식의 특징인, 마커 S100A7(건선) 및 케라틴 16(KRT16)의 외관이 관찰된다. 이러한 마커의 비율은 Th1/Th17로 활성화된 CD4+ T 세포의 분극화가 시작된 지 7일 후에도 여전히 증가한다.
또한, 세포자멸사는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피의 각질형성세포 내에서 관찰된다.
7 - 소염성 화합물에 대한 스크리닝
본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델의 관련성을 시험하기 위하여, 이들의 소염성 효과에 대해 공지된 화합물을 시험하였다. 이들은 베타메타손 디-프로피오네이트 및 PDE4 억제제이다. 이러한 생성물(8 mm 직경의 생검에서 10 μL의 고정 용적)의 국소 적용을 InflammaSkin® 모델의 활성화 및 생산 직후 수행하거나(예방학적 처리) 처리하지 않고 3일 배양 후(치료학적 처리) 수행하고 7일의 배양까지 매일 반복하였다.
조직학적 분석(도 5)은 피부, 특히 표피의 통합성 및 구조, 및 표피 세포의 생존능이 이들의 각각의 위약 대조군과 비교하여 예방학적 처리로서 베타메타손 디-프로피오네이트 및 PDE4 억제제를 사용한 처리 동안에 보존됨을 나타낸다.
소염성 사이토킨 IL-17A, IL-22, IFNγ, 및 TNFα의 분비의 분석(도 6 내지 9)은:
- IL-17A 분비(도 6)가 이들의 각각의 위약 대조군(도 6a)과 비교하여 예방학적 처리로서 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 및 PDE4 억제제(5)에 의해 강력하게 억제되는 반면, 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 단독이 치료학적 처리로서 IL-17A 분비를 억제(도 6b)하고,
- IL-22 분비(도 7)가 이들 각각의 위약 대조군(도 7a)과 비교하여 예방학적 처리로서 베타메타손 디-프로피오네이트(3)에 의해 강력하게 억제되고 PDE4 억제제(5)에 의해 심지어 더 강력하게 억제되는 반면, 베타메타손 디-프로티오네이트(3) 단독은 치료학적 처리로서 IL-22 분비를 억제하고(도 7b),
- IFNγ 분비(도 8)는 이들 각각의 위약 대조군(도 8a)과 비교하여 예방학적 처리로서 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 및 PDE4 억제제(5)에 의해 강력히 억제되는 반면, 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 단독은 치료학적 처리(도 8b)로서 IFNγ 분비를 억제하고,
- TNFα 분비(도 9)는 이들 각각의 위약 대조군(도 9a)로서 뿐만 아니라, 치료학적 처리(도 9b)로서 베타메타손 디-프로피오네이트(3) 및 PDE4 억제제(5)에 의해 강력하게 억제됨을 나타낸다.
8 - 항-CD3 항체의 피부 세포내로 혼입
항-CD3 항체의 혼입과 관련된 비교 시험을 사람 피부 생검에서 수행하였다. 플루오로크롬 알렉사 플루오르(Alexa Fluor) 647(ThermoFisher, 참고번호 A51001)와 커플링된 항-CD3e 항체 40 ng/μl를 두께가 4 mm이고 직경이 8 mm인 사람 피부 생검의 진피에 직접 주사하거나 피부 생검이 부유하여 유지되는 배양 배지에 가하였다. 24 시간의 배양 후, 피부 생검을 10% 포르말린 용액 속에 고정시키고 파라핀 블록 속에 포매시켰다. 5 μm의 일정 두께의 생검의 일련의 부분을 제조한다. 세포 핵을 DAPI로 표지한다. Leica DM5000 형광 현미경을 분석을 위해 사용한다.
항-CD3e 항체의 피부 세포 내로 혼입은 진피로 이러한 항체의 직접적인 주사를 겪은 2개의 별개의 생검(복제물 1 및 2)에서 화살표로 구체화한다(도 11, 좌측 패널 - II). 고 배율에서(도 12), 항-CD3e 항체는 일부 피부 세포의 세포질내에 혼입됨을 알 수 있다.
역으로, 항-CD3e 항체를 포함하는 배양 배지 속에서 배양된 2개의 생검 중 단지 하나의 경우, 이러한 항체의 검출은 가시적이며, 표피의 표면에서만 별 표시로 구체화된다(도 11 우측 패널 - AMC/R1). 수동적 확산에 의해 항-CD3e 항체를 혼입할 수 있는 피부 세포는 없었다.
이러한 결과는 항-CD3 항체가 이러한 조직내로 직접 주사되는 경우에만 피부 세포에 도달함을 나타낸다.
유사한 결과를 항-CD28 항체를 사용하여 수득할 수 있다.
9 - 소염 화합물의 스크리닝
본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 모델의 관련성을 시험하기 위하여(Hypo-InflammaSkin®), 이의 소염 효과에 대해 공지된 항체를 시험하였다. 이는 아달리무맙 항-TNFα 항체이다. 두께가 1 cm인 염증이 생긴 피부의 생검(Hypo-InflammaSkin® - I)을 본 발명의 방법으로 수득하였다. 50 nM 아달리무맙의 피하 주사(즉, 진피내로)를 T0(예방학적 처리, Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - P)에서 또는 염증이 생긴 생검의 3일의 생체외 배양 후(치료학적 처리, Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - T) 수행하였다. 7일의 생체외 배양 후, 배양 배지를 취하고, 피부 생검을 10% 포르말린 용액 속에 고정시킨 다음 파라핀 블록 속에 포매시켰다. 5 μm의 일정 두께의 생검의 일련의 부분을 제조한다. 피부 생검의 형태학적 외관을 광학 현미경 하에서 헤마톡실린 및 에오신 염색을 사용하여 연구한다. 건선(S110A7)의 존재는 형광 현미경(Leica DM 5000 현미경)으로 플루오로크롬에 커플링된 항-S100A7 항체를 사용하여 확인한다. 세포 핵을 DAPI로 표시한다. 염증이 생기지 않은 피부의 생검(HypoSkin® - 표피, 진피, 및 피하조직을 포함하는 생검)을 대조군에 대해 사용한다.
조직학 분석(도 13)은 피부, 및 보다 특히 표피의 통합성 및 구조, 및 표피 세포 생존능이 이러한 항체(Hypo-InflammaSkin® - I)로 처리하지 않은 염증이 생긴 피부의 생검과 비교하여 예방학적 처리(Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - P)로서 및 치료학적 처리(Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - T)로서 항-TNFα 항체 아달리무맙으로 처리한 경우 보존됨을 나타낸다.
또한, 건선은 항-TNF-α로 처리한 염증이 생긴 생검으로부터의 샘플 속에서 거의 검출될 수 없게 되므로, 염증의 해결을 입증한다.
IL-22 전-염증성 사이토킨 분비의 분석은 이러한 항체(Hypo-InflammaSkin® - I)로 처리되지 않은 염증이 생긴 피부의 생검과 비교하여 IL-22 분비(도 14)가 예방학적 처리(Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - P)로서 및 치료학적 처리(Hypo-InflammaSkin® - I + 항-TNFα - T)로서 항-TNFα 항체에 의해 강력히 억제됨을 나타낸다.
이러한 결과는 본 발명의 방법에 의해 수득된 염증이 생긴 피부의 생체외 모델이 소염성 화합물, 및 특히 항-건선 화합물에 대한 스크리닝을 허용하며, 이의 투여 경로가 피하 주사임을 나타낸다.

Claims (15)

  1. 다음의 단계를 포함하는 염증이 생긴 피부의 생체외 모델을 수득하기 위한 시험관내 방법:
    a) 포유동물로부터 미리 채취한 3 mm 내지 1 cm 의 두께를 갖는 건강한 피부 생검의 진피 내로, 진피 내재성(dermal resident) T 세포를 활성화하기 위한 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체를 포함하는 조성물을 주사하는 단계로 상기 생검이 표피, 진피, 표피 부속물, 및 피하조직을 포함하는, 단계,
    a') 고화시킬 수 있는 액체 매트릭스 상에 단계 a)의 말기에 수득된 주사된 피부 생검을 침착시키는 단계로, 상기 매트릭스는 자체적으로 이의 바닥이 다공성 막으로 이루어진 세포 배양 삽입물 속에 함유되며, 상기 삽입물은 용기 또는 웰(well) 속에 배열됨으로써, 일단 매트릭스가 고화되면 피부 생검의 3D 통합성(integrity)이 유지되도록 하는 단계, 및
    b) 단계 a)에서 활성화된 T 세포의 LTh1로의, 또는 LTh17로의, 또는 LTh1과 LTh17 둘 다로의 분극화 및 염증 마커의 합성을 수득하기 위한, 적어도 IL-1β, IL-23, 및 TGF-β의 유효량을 포함하는 조성물의 존재하에서 단계 a)에서 수득된 주사된 피부 생검을 항온처리하는 단계.
  2. 제1항에 있어서, 주사되는 조성물이 유효량의 IL-2를 더 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 단계 a)가 수동으로 수행되는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 항온처리 단계 b)가 적어도 5일 동안 지속되는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    방법의 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 농도가 항-CD3 및 항-CD28 항체의 경우 10 ng/μl 내지 100 ng/μl인, 방법.
  6. 제2항에 있어서,
    방법의 단계 a)에서 주사된 조성물 속의 농도가 IL-2의 경우 1 ng/ml 내지 20 ng/ml인, 방법.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 방법의 단계 b)에서 사용된 조성물 속의 농도가:
    - IL-1β 및 TGFβ의 경우 1 ng/ml 내지 50 ng/ml이고, 및
    - IL-23의 경우 10 ng/ml 내지 100 ng/ml인, 방법.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물의 소염 효능을 평가하는 것을 추가의 목표로 하며 다음의 추가의 단계를 포함하는 방법:
    c) 단계 b)의 말기에 수득되고 LTh-1-분극화된 또는 LTh17-분극화된 또는 LTh-1-및 LTh17- 분극화된 T 세포를 포함하는 염증이 생긴 피부의 모델을 후보물 화합물과 접촉시키는 단계;
    d) 염증이 생긴 피부의 모델의 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 측정하는 단계;
    e) 단계 d)에서 수득된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준을 이들의 대조군 발현 수준과 비교하는 단계;
    f) 단계 d)에서 측정된 상기 적어도 2개의 염증 마커의 발현 수준이 이들의 대조군 발현 수준보다 낮은 경우 상기 후보물 화합물의 소염 효능을 확인하는 단계.
  9. 제8항에 있어서, 단계 d)에서 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 3개의 염증 마커의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 방법.
  10. 용기 또는 배양 박스 웰 속에 함유시키기에 적합하고, 이의 바닥이 다공성 막(40)으로 이루어진, 세포 배양 삽입체(10)로서,
    상기 삽입체가 고화된 매트릭스(20)에 포매된 진피, 표피, 표피 부속물, 피하조직, 및 Th1 또는 Th17 세포를 포함하는 염증이 생긴 피부(30)의 생체외 모델을 함유하며, 상기 매트릭스는 삽입체의 내부 가장자리 및 다공성 막과 접촉되며, 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 표피는 대기와 접촉되며 염증이 생긴 피부의 생체외 모델의 진피 및 표피 부속물은 고화된 매트릭스 속에 침지되며, 상기 염증이 생긴 피부의 생체외 모델은, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있고 IL-8, IL-17A, IL-22, IL-23, IFNγ, TNFα, S100A7, S100A8, S100A9, S100A12, SERPINB3, SERPINB4, SERPINB13, DEFB4, KRT6A, KRT16, KRT17, CXCL9, CXCL10, CCL18, 및 CCL20으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 적어도 2개의 염증 마커의 단백질 수준에서의 발현에 의해 특징화되는, 세포 배양 삽입체(10).
  11. 포유동물로부터 이미 채취한 건강한 피부 생검, 유효량의 항-CD3 항체 및 항-CD28 항체, 및 임의로 IL-2를 포함하는 조성물 A, IL-1β, IL-23, 및 TGFβ의 적어도 하나의 혼합물을 포함하는 조성물 B를 포함하는, 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 따른 방법을 시행하기 위한 키트.
  12. 제11항에 있어서, 주입 장치를 더 포함하는 키트.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
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