CN110055213A - 一种侏儒蛤卵膜的分离方法 - Google Patents

一种侏儒蛤卵膜的分离方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110055213A
CN110055213A CN201910328727.5A CN201910328727A CN110055213A CN 110055213 A CN110055213 A CN 110055213A CN 201910328727 A CN201910328727 A CN 201910328727A CN 110055213 A CN110055213 A CN 110055213A
Authority
CN
China
Prior art keywords
egg membrane
egg
dwarf
clam
membrane
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201910328727.5A
Other languages
English (en)
Inventor
黄晓婷
杨祖晶
李茉莉
秦贞奎
曾启繁
陆维
包振民
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Ocean University of China
Original Assignee
Ocean University of China
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ocean University of China filed Critical Ocean University of China
Priority to CN201910328727.5A priority Critical patent/CN110055213A/zh
Publication of CN110055213A publication Critical patent/CN110055213A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0608—Germ cells
    • C12N5/0609—Oocytes, oogonia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Separation Using Semi-Permeable Membranes (AREA)

Abstract

本发明公开了一种侏儒蛤卵膜的分离方法，其特征是用低盐的灭菌过滤海水进行低渗5min，用移液枪反复抽打10～20次，直至破碎，接着将破碎的卵子置于离心机中4000r/min，常温离心20～30min，吸取上清置于新的500目筛绢上用灭菌海水冲洗除去卵黄物质，即可获得较为纯净的卵膜。本发明能快速地实现侏儒蛤卵膜的分离和提取，并且由于本发明采用低渗和物理破碎相结合的方法，条件比较温和，不会对卵膜的化学结构造成破坏，这对侏儒蛤卵膜结构和组分、受精过程的精卵识别和转基因研究具有重要意义。

Description

一种侏儒蛤卵膜的分离方法
技术领域
本发明属于海洋生物膜研究领域，具体涉及一种侏儒蛤卵膜的分离方法。
背景技术
卵膜是包裹动物卵细胞的非细胞性被膜的总称，不同动物的卵膜，其形态结构及组成也大不相同，卵膜在卵细胞的保护和精卵识别过程发挥重要的作用。软体动物作为仅次于节肢动物的最大无脊椎动物类群，其卵膜结构呈现多样化的结构，总体来看其卵膜较厚，不易分离。
侏儒蛤(Mulinia lateralis)，属于软体动物门，帘蛤目，蛤蜊科，是一种小型的双壳埋栖贝类。它具有发育繁殖周期短(2个月左右，斑马鱼约为3个月)、体型小、产卵量大、早期发育贝壳透明等特点，其作为模式贝类的潜力为国际上所公认。
侏儒蛤的卵细胞直径在40～50微米之间，卵细胞较小，并且卵膜和细胞质膜紧密贴合，分离和溶解也卵膜比较困难，这对侏儒蛤卵细胞结构、受精过程及侏儒蛤卵细胞的转基因研究带来诸多不便。因此，就需要首先分离出侏儒蛤的卵膜，但目前已有的卵膜分离方法对侏儒蛤的卵细胞分离效果都不好。
发明内容
本发明的目的是提供一种侏儒蛤卵膜的分离方法，可以快速分离出侏儒蛤的卵膜，从而弥补现有技术的不足。
本发明所提供的侏儒蛤卵膜的分离方法，包括如下的步骤：
1)低渗处理：用25～26‰盐度的海水浸泡卵细胞，在22～23℃混匀静置5min，使卵细胞吸水膨胀；
2)破碎离心：用移液枪对步骤1)处理的卵细胞溶液进行反复吹吸抽打，直至出现浑浊状态，然后置于离心机中常温4000r/min离心20～30min；收集上层溶液；
3)卵膜收集：吸取离心结束的上层溶液，置于20um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水(所用的灭菌海水盐度为30‰，温度为22～23℃)反复冲洗2～3次，除去卵黄物质，然后将卵膜从细胞筛上吸取到离心管中4℃保存。
本发明提供的侏儒蛤卵膜分离方法较为温和，由于侏儒蛤卵子较小，传统的研磨、超声波等物理方法容易造成卵膜大规模碎片化，同时使用生物化学试剂，比如蛋白酶等会造成侏儒蛤卵膜的溶解，破坏其结构特征和理化性质，这为后续卵膜研究带来困扰，而本发明提供的方法可以获取结构比较完整的卵膜，这对卵子较小生物的卵膜分离具有重要参考意义
附图说明
图1：分离出完整卵膜的形态图；
图2：分离出不规则卵膜的形态图。
具体实施方式
以下通过实施具体操作对本发明的技术方案进一步的说明
挑选5只性腺发育良好的雌性侏儒蛤，通过阴干升温法进行催产，具体为将侏儒蛤置于干燥阴凉的环境阴干1.5h，然后放入26～27℃的高温水中(比正常养殖温度高5～6℃)，大约1h左右即可产卵。
用500目无菌筛绢收集侏儒蛤排放的卵细胞，使用灭菌的过滤海水缓慢冲洗2～3次，将卵细胞转移到50ml无菌管中(可以存储在4℃冰箱中)；将收集的卵细胞分装到灭菌的2ml离心管中，每管放置至少104个卵细胞。在其他生物的卵膜分离研究中，一般采用研磨，超声破碎等物理方法来实现卵细胞的大量破裂，而侏儒蛤卵细胞较小，使用上述方法容易造成卵膜的严重碎片化，无法分离出完整的卵膜。因此本发明通过侏儒蛤特定的卵膜组成，采用特定的方法来进行卵细胞的破裂和卵膜的分离；具体步骤如下：
1)首先向离心管中加入1.5ml 25～26‰盐度的海水，将卵细胞与海水混匀，卵细胞浸泡静置5min，期间尽量避免搅动；经过低渗处理，卵细胞处于吸水膨胀状态，此时的卵细胞较为脆弱。
2)紧接着用移液枪对卵细胞溶液进行快速吹吸抽打，直到管中呈现浑浊状态。然后将离心管置于离心机中，转速调至4000rpm/min，常温22～23℃离心20～30min；吸取管中上清液置于新的无菌20um细胞筛上，切勿吸取沉淀，因为沉淀中含有未成功破碎的卵细胞。
3)用灭菌的过滤海水反复冲洗，除去破碎卵细胞释放的卵黄物质，其中所用的灭菌海水盐度为30‰，温度为22～23℃。用移液枪小心地将洗净的卵膜转移到新的2ml离心管中，可以进行4℃保存。吸取少量卵膜置于载玻片上，在显微镜下检测卵膜的完整度。
如图1所示，在20倍镜视野下观察到的形态较为完整的卵膜，卵膜整体大小与卵细胞接近；而采用已有的卵膜分离方法，在20倍镜视野下观察到的形态出现不规则的卵膜如图2所示；其大小大于正常的卵细胞。
本发明分离出的相对比较完整卵膜已可以满足实验需求，对推动侏儒蛤基于卵膜相关的研究具有积极重要的意义。

Claims (4)

1.一种侏儒蛤卵膜的分离方法，其特征在于，所述的方法包括如下的步骤：
1)低渗处理：用海水浸泡卵细胞，在22～23℃混匀静置5min，使卵细胞吸水膨胀；
2)破碎离心：用移液枪对步骤1)处理的卵细胞溶液进行反复吹吸抽打，直至出现浑浊状态，然后离心收集上层溶液；
3)卵膜收集：吸取离心结束的上层溶液，置于20um孔径的细胞筛上，用灭菌的过滤海水反复冲洗2～3次，除去卵黄物质，然后将卵膜从细胞筛上吸取到离心管中4℃保存。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的1)中海水的盐度为25～26‰。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的2)中离心条件是常温下，4000r/min离心20～30min。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的3)中所用的灭菌海水的盐度为30‰，温度为22～23℃。
CN201910328727.5A 2019-04-23 2019-04-23 一种侏儒蛤卵膜的分离方法 Pending CN110055213A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910328727.5A CN110055213A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 一种侏儒蛤卵膜的分离方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910328727.5A CN110055213A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 一种侏儒蛤卵膜的分离方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110055213A true CN110055213A (zh) 2019-07-26

Family

ID=67320226

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910328727.5A Pending CN110055213A (zh) 2019-04-23 2019-04-23 一种侏儒蛤卵膜的分离方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110055213A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110720411A (zh) * 2019-11-27 2020-01-24 海南晨海水产有限公司 一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法
CN114752624A (zh) * 2022-04-08 2022-07-15 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵子的电穿孔方法
CN115521904A (zh) * 2022-09-29 2022-12-27 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵膜的溶解方法

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1766092A (zh) * 2005-09-05 2006-05-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼类胚胎细胞分离与培养方法
CN103004653A (zh) * 2012-11-22 2013-04-03 中山大学 一种三倍体石斑鱼的制备方法
CN104255586A (zh) * 2014-08-15 2015-01-07 中国科学院南海海洋研究所 一种生产香港牡蛎全三倍体的时间点定量处理方法
CN104381158A (zh) * 2014-09-28 2015-03-04 中国科学院南海海洋研究所 一种采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法
CN105746446A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 辽宁石油化工大学 一种卤虫卵的去壳方法
CN106577408A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 汪逸凡 一种用于提高孵化率的脱壳卤虫卵的制备方法
CN107523539A (zh) * 2017-09-13 2017-12-29 内蒙古大学 哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系
CN107969362A (zh) * 2017-12-14 2018-05-01 日照市海洋与渔业研究所(日照市海域使用动态监视监测中心、日照市水生动物救护站) 紫彩血蛤苗种规模化繁育方法
CN108004197A (zh) * 2017-12-14 2018-05-08 浙江海洋大学 一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂
CN110050736A (zh) * 2019-04-23 2019-07-26 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵膜的溶解方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1766092A (zh) * 2005-09-05 2006-05-03 中国水产科学研究院黄海水产研究所 鱼类胚胎细胞分离与培养方法
CN103004653A (zh) * 2012-11-22 2013-04-03 中山大学 一种三倍体石斑鱼的制备方法
CN104255586A (zh) * 2014-08-15 2015-01-07 中国科学院南海海洋研究所 一种生产香港牡蛎全三倍体的时间点定量处理方法
CN104381158A (zh) * 2014-09-28 2015-03-04 中国科学院南海海洋研究所 一种采用卵生型手段繁育幼生型牡蛎的方法
CN105746446A (zh) * 2016-05-13 2016-07-13 辽宁石油化工大学 一种卤虫卵的去壳方法
CN106577408A (zh) * 2016-11-22 2017-04-26 汪逸凡 一种用于提高孵化率的脱壳卤虫卵的制备方法
CN107523539A (zh) * 2017-09-13 2017-12-29 内蒙古大学 哺乳动物孤雌类上胚层干细胞的诱导及培养建系方法和得到的孤雌类上胚层干细胞系
CN107969362A (zh) * 2017-12-14 2018-05-01 日照市海洋与渔业研究所(日照市海域使用动态监视监测中心、日照市水生动物救护站) 紫彩血蛤苗种规模化繁育方法
CN108004197A (zh) * 2017-12-14 2018-05-08 浙江海洋大学 一种乌贼胚胎细胞的原代培养方法及专有试剂
CN110050736A (zh) * 2019-04-23 2019-07-26 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵膜的溶解方法

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
MERKLE CJ等: "Hyperosmolality inhibits exocytosis in sea urchin eggs by formation of a granule-free zone and arrest of pore widening", 《J MEMBR BIOL》 *
丁晨晖等: "短时受精后提早剥离颗粒细胞对体外受精的影响", 《中山大学学报(医学科学版)》 *
吕众等: "两种分离斑马鱼卵母细胞方法的比较", 《生物技术通报》 *
张天荫: "两栖类卵胶膜的生理学", 《山东大学学报(理学版)》 *
王建英等: "小鼠受精卵染色体制备和研究的概况", 《畜牧与兽医》 *
邓海姣: "栉江珧解剖配子的体外促熟研究", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)农业科技辑》 *
陈丽: "玉米精细胞质膜糖蛋白的分离纯化及其细胞学免疫定位", 《中国学位论文全文数据库》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110720411A (zh) * 2019-11-27 2020-01-24 海南晨海水产有限公司 一种石斑鱼孵化过程中去除卵膜的方法
CN114752624A (zh) * 2022-04-08 2022-07-15 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵子的电穿孔方法
CN115521904A (zh) * 2022-09-29 2022-12-27 中国海洋大学 一种侏儒蛤卵膜的溶解方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110055213A (zh) 一种侏儒蛤卵膜的分离方法
US4868121A (en) Islet isolation process
CN106363835B (zh) 微塑料分离方法及装置
Busch [51] Isolation and purification of nuclei
CN102242115B (zh) 磁珠法提取细菌质粒dna的试剂盒及其提取方法
CN104642300B (zh) 一种脱落细胞液基保存液、其用于制片的方法和试剂盒
EP0236049B1 (en) Separation of islets of langerhans
CN104483178B (zh) 赤点石斑鱼成鱼染色体的制备方法
CN108129547B (zh) 一种提取菌胶团胞外聚合物的方法
CN111624080B (zh) 一种从禽畜粪便中提取微塑料的方法及其应用
CN101413018A (zh) 一种基因组dna的提取方法
CN106929468B (zh) 一种鱼类单细胞悬液的制备方法
CN102161988B (zh) 一种提取单个鱼卵仔鱼微量总dna的简便快速方法
CN109053587A (zh) 一种从嗜盐微生物发酵液中分离提取四氢嘧啶的方法
CN109207473B (zh) 一种宫颈细胞裂解试剂盒及裂解方法
JP2001178492A (ja) 水生物の有用物質の抽出方法
CN107827996B (zh) 一种从新鲜绿藻中提取绿藻蛋白多糖的生产线及其工艺
CN109486237A (zh) 一种海洋源黑色素的制备方法
AU593556B2 (en) High purity hyaluronic acid from synovial fluid
GB2605051A (en) Method for producing 3,5-dihydroxy-4-methoxybenzyl alcohol from planktons
CN110241164A (zh) 一种血红裸藻多肽的提取方法
CN110283819A (zh) 一种海桑属植物的叶绿体dna提取方法
CN107964529B (zh) 夏至草原生质体制备方法
CN109443866A (zh) 多糖多酚植物组织双向电泳及高通量质谱分析的蛋白提取方法
CN103952399A (zh) 一种使用含有指示剂的酚胍盐裂解液提取核糖核酸的方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20190726

RJ01 Rejection of invention patent application after publication