CN104642300A - 一种脱落细胞液基保存液、其用于制片的方法和试剂盒 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种脱落细胞液基保存液、其用于制片的方法和试剂盒，脱落细胞液基保存液包括多聚甲醛3.8～4.2％、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.8～1.5％、冰醋酸0.8～1.5％、乙酰半胱氨酸0.1～0.2％、氯化钠0.75～0.85％、氯化钾0.01～0.03％、磷酸氢二钠0.12～0.15％和磷酸二氢钾0.025～0.03％，余量为水，调节pH至7.2～7.8，所述百分比为质量体积百分比。所述脱落细胞液基保存液对脱落细胞收缩小，适于长期保存；把样品中被粘液包裹的细胞成功分离出来，避免了阳性细胞堆积与丢失，提高有效细胞数量；并且能够观察是否存在隐血症状。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体涉及一种脱落细胞液基保存液、其用于制片的方法和试剂盒。
背景技术
结直肠癌是危害人类生命的常见恶性肿瘤，其发病率位居全球恶性肿瘤第三位。在我国其发病率与死亡率呈逐年上升趋势。患者出现症状就诊时往往已是晚期，疗效差。如果能够在早期发现并进行治疗，则效果较好。目前应用于临床的大肠癌检测技术主要有：(1)粪便隐血检测；(2)内窥镜检查；(3)粪便脱落细胞学检测。其中，粪便脱落细胞学检测由于其简单易行、安全性强；对设备要求不高、费用低；对患者造成的痛苦少等特点，目前已经广泛应用于临床。
早在上世纪五十年代，就有粪便脱落细胞的检测。由于粪便脱落细胞检测方法费时费力，所以在很长一段时间内，都没有建立起真正的检测方法。薄层液基保存法已在宫颈刷片、痰、浆膜腔积液等标本的肿瘤细胞学诊断中得到了广泛的应用，为临床明确诊断提供了可靠的细胞系依据。但将液基薄层细胞系技术应用到提取粪便脱落细胞还比较少见。因为该方法需要首先用MEM复合营养液基提取细胞，再用硼酸对粪便中的粘液进行分解，然后用乙醇固定粪便中的脱落细胞。这样繁琐的步骤，不仅会影响检测的最佳时机，还会导致检测结果产生差异、准确性降低。此外由+于粪便中血红细胞数量较少，采用原有的液基保存法，会导致粪便隐血的假阴性误判。现在医院临床检测中所用到的脱落细胞学检测液基保存液，各个生产商品种繁多，该类商品主要功能有：(1)固定白细胞，上皮细胞和组织细胞；(2)溶解粘液蛋白防止包裹阳性细胞；(3)裂解红细胞减少背景细胞。虽然这类产品能在普通脱落细胞学检测中取得较好的效果，但是由于粪便中成分复杂，且含有较大量的食物残渣和细菌及大量肠道粘液，所以普通的液基保存液不能很好地分离脱落细胞。同时普通的液基保存液，需要通过多个步骤对粪便脱落细胞进行处理，加大了粪便脱落细胞收集的难度。此外，粪便隐血是国际通用的结直肠癌筛查方法，是消化道恶性肿瘤早期诊断的重要筛查指标，但是目前还没有结合粪便隐血和粪便脱落细胞检测直肠癌的检测方法。
发明内容
本发明克服了现有脱落细胞检测液基保存液不能与粪便隐血结合检测、多个步骤对粪便脱落细胞进行处理操作繁琐、损伤血红蛋白的缺陷，提供一种脱落细胞液基保存液，所述脱落细胞液基保存液可以固定脱落细胞，去除粘液蛋白，并且能够保留血红细胞以便观察是否存在隐血症状。所述脱落细胞液基保存液结合了粪便隐血检测和粪便脱落细胞检测，可以应用于直肠癌的检测中，并且所述脱落细胞液基保存液配制方便，操作简便。
本发明提供一种脱落细胞液基保存液，所述脱落细胞液基保存液由以下成分组成：多聚甲醛3.8～4.2％、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.8～1.5％、冰醋酸0.8～1.5％、乙酰半胱氨酸0.1～0.2％、氯化钠0.75～0.85％、氯化钾0.01～0.03％、磷酸氢二钠0.12～0.15％和磷酸二氢钾0.025～0.03％，余量为水，使用pH调节剂调节pH至7.2～7.8，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述多聚甲醛为本领域常规的多聚甲醛；较佳地，为Sigma158127。所述多聚甲醛为3.8～4.2％；较佳的为4.0～4.1％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐为0.8～1.5％；较佳的为1.0～1.2％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述乙酰半胱氨酸为0.1～0.2％；较佳的为0.12～0.15％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述氯化钠为0.75～0.85％；较佳的为0.80～0.82％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述氯化钾为0.01～0.03％；较佳的为0.015～0.02％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述磷酸氢二钠为0.12～0.15％；较佳的为0.142～0.145％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明中，所述磷酸二氢钾为0.025～0.03％；较佳的为0.27～0.28％，所述百分比为质量体积百分比。
本发明所述pH调节剂为本领域常规的pH调节剂；较佳地为氢氧化钠。
较佳地，所述调节pH为调节pH至7.5。
本发明所述的水为本领域常规的水，较佳地为蒸馏水；更佳地为双蒸水。
本发明所述的质量体积百分比表示组分在组合物中的浓度，是指每100毫升组合物中所含组分的克数。
本发明所述脱落细胞液基保存液的制备方法是，将一定质量的所述多聚甲醛、所述N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐、所述冰醋酸、所述乙酰半胱氨酸、所述氯化钠、所述氯化钾、所述磷酸氢二钠和所述磷酸二氢钾溶解于所述水中，使用所述pH调节剂调节pH至7.2～7.8，然后加所述水定容至一定体积，即可。
本发明提供一种利用所述的脱落细胞液基保存液的液基薄层细胞学制片的方法，其包括以下的步骤：
1)将样品放置于所述的脱落细胞液基保存液中3～8分钟，得到混合液；
2)将步骤1)获得的所述混合液依次通过筛目数为40目～200目且筛目数从小到大的筛网，除去杂质后得到滤液；
3)将步骤2)获得的所述滤液5000～7000 rpm离心0.5～2分钟，弃去上清，再加入所述脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液；
4)将步骤3)获得的所述混匀的混合液，使用液基薄层细胞涂片机进行制片。
本发明步骤1)为：将样品放置于所述的脱落细胞液基保存液中3～8分钟，得到混合液。其中，所述的方法的样品的来源为本领域常规的来源；较佳地为粪便、宫颈刷片、痰液、尿液、浆膜腔积液；更佳地为粪便。步骤1)所述脱落细胞液基保存液的体积为本领域常规的体积；较佳地为8～15mL；更佳地为10mL。所述放置于所述脱落细胞液基保存液的时间为本领域常规的时间，较佳地为5分钟。
本发明步骤2)为：将步骤1)获得的所述混合液依次通过筛目数为40目～200目且筛目数从小到大的筛网，除去杂质后得到滤液。其中，较佳地，步骤2)所述混合液依次通过40目、80目、100目和200目的筛网。
本发明步骤3)为：将步骤2)获得的所述滤液5000～7000rpm离心0.5～2分钟，弃去上清，再加入所述脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液。其中，较佳地，步骤3)所述的离心的速度为6000rpm。较佳地，所述的离心的时间为1分钟。所述脱落细胞液基保存液的体积为本领域常规的体积，较佳地为与步骤1)所述的脱落细胞液基保存液的体积相同的体积。
本发明步骤4)为：将步骤3)获得的所述混匀的混合液，使用液基薄层细胞涂片机进行制片。其中，步骤4)所述混匀的混合液放置在本领域常规的容器中；较佳地，放置在液基保存瓶中；更佳地，所述的液基保存瓶购自湖南省丽拓生物科技有限公司。较佳地，所述的液基薄层细胞涂片机购自湖南省丽拓生物科技有限公司。所述的制片为本领域常规的制片，较佳地为TCT制片。
TCT是新柏氏液基细胞学检测的简称。TCT采用液基薄层细胞检测系统检测宫颈细胞等多种组织细胞并进行细胞学分类诊断，它是目前国际上较先进的一种细胞学癌症检查技术。
本发明提供一种含有所述脱落细胞液基保存液的TCT法检测脱落细胞的试剂盒。
较佳地，所述的试剂盒含有所述脱落细胞液基保存液。较佳的，所述的试剂盒还包括取样杆、细胞分离膜杯和防脱载玻片。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
本发明的积极进步效果在于：(1)本发明采用多聚甲醛进行细胞固定。相对于醇类固定液，多聚甲醛对脱落细胞收缩小，较为温和，适于较长期保存。(2)加入独特的粘液分解剂，能把样品中被粘液包裹的细胞成功分离出来，避免了阳性细胞堆积与丢失，从而能成功分离到脱落细胞。(3)能够保留红细胞，以便于观察是否存在隐血症状(4)配制简便，操作方便。
附图说明
图1为粪便脱落细胞保存液进行的正常人的粪便脱落细胞收集后的TCT制片，可见粪便中的单个有核细胞，以及一定数量的血红细胞(如箭头所示)；
图2为粪便脱落细胞保存液进行的正常人的粪便脱落细胞收集后的TCT制片，可见粪便中的单个有核细胞；
图3为粪便脱落细胞保存液进行的正常人的粪便脱落细胞收集后的TCT制片，可见粪便中的单个有核细胞，以及一定数量的血红细胞(如箭头所示)。
其中，图1和图3所对应的样本为在正常人粪便样品中加入少量正常人血液。
图1～3的放大倍数均为200倍。
具体实施方式
下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。
本发明所述的室温为本领域常规的室温，较佳地为10～30℃。
实施例1脱落细胞液基保存液的配制
按如下的配方组成配制脱落细胞液基保存液：
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.27g；
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.42g；
氯化钠(NaCl)：8g；
氯化钾(KCl)：0.2g；
冰醋酸(HAc)：10.49g；
多聚甲醛：40g；
甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐：10g；
乙酰半胱氨酸：1g
加双蒸水后用NaOH调节pH至7.5定容至1L，即得所述的脱落细胞液基保存液。
实施例2脱落细胞液基保存液的配制
磷酸二氢钾(KH2PO4)：0.28g；
磷酸氢二钠(Na2HPO4)：1.45g；
氯化钠(NaCl)：7.5g；
氯化钾(KCl)：0.1g；
冰醋酸(HAc)：8g；
多聚甲醛：42g；
N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐：12g；
乙酰半胱氨酸：2g
加双蒸水后用NaOH调节pH至7.5，定容至1L，即得所述的脱落细胞液基保存液。
实施例3脱落细胞液基保存液的配制
按如下的配方组成配制脱落细胞液基保存液：
磷酸二氢钾：0.3g；
磷酸氢二钠：1.5g；
氯化钠：8.5g；
氯化钾：0.3g；
冰醋酸：12g；
多聚甲醛：41g；
N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐：15g；
乙酰半胱氨酸：1.2g
加双蒸水后用NaOH调节pH至7.5定容至1L，即得所述的脱落细胞液基保存液。
实施例4脱落细胞液基保存液的配制
按如下的配方组成配制脱落细胞液基保存液：
磷酸二氢钾：0.25g；
磷酸氢二钠：1.3g；
氯化钠：8.2g；
氯化钾：0.15g；
冰醋酸：15g；
多聚甲醛：38g；
N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐：8g；
乙酰半胱氨酸：1.5g
加双蒸水后用NaOH调节pH至7.5定容至1L，即得所述的脱落细胞液基保存液。
实施例5脱落细胞液基保存液的配制
按如下的配方组成配制脱落细胞液基保存液：
磷酸二氢钾：0.25g；
磷酸氢二钠：1.2g；
氯化钠：8.2g；
氯化钾：0.15g；
冰醋酸：12g；
多聚甲醛：38g；
N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐：15g；
乙酰半胱氨酸：1.5g
加双蒸水后用NaOH调节pH至7.5定容至1L，即得所述的脱落细胞液基保存液。
实施例6检测粪便脱落细胞
1)取约0.5g粪便样品，放置于10mL所述的脱落细胞液基保存液中5分钟，得到混合液；
2)将步骤1)获得的所述混合液依次过40目、80目、100目、200目筛网除去杂质，得到滤液；
3)将步骤2)获得的所述滤液6000rpm离心1分钟，弃去上清，再加入10mL所述的脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液；
4)将步骤3)获得的所述混匀的混合液加入湖南省丽拓生物科技有限公司的液基保存瓶中，使用湖南省丽拓生物科技有限公司LT-YJ2000自动液基薄层细胞涂片机进行制片，并用苏木素-伊红染色液染色。
结果见图1、2、3所示。图1～3中所示的细胞均为粪便样品中的脱落细胞，经脱落细胞液基保存液处理后固定，粪便样品中的脱落细胞形态清晰，同时也可观察到红细胞(见图1、3箭头所指处)，由此可以判断图1～3中细胞有较为清晰的轮廓和细胞核，大小合适，可以判断为正常人体细胞。
实施例7检测粪便脱落细胞
1)将粪便样本获得后，放置于8mL所述的脱落细胞液基保存液中8分钟，得到混合液；
2)将步骤1)获得的所述混合液依次过40目、80目、100目、200目筛网除去杂质，得到滤液；
3)将步骤2)获得的所述滤液5000rpm离心2分钟，弃去上清，再加入等体积所述的脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液；
4)将步骤3)获得的所述混匀的混合液加入液基保存瓶，使用液基薄层细胞涂片机进行TCT制片。
实施例8检测粪便脱落细胞
1)将粪便样本获得后，放置于15mL所述的脱落细胞液基保存液中3分钟，得到混合液；
2)将步骤1)获得的所述混合液依次过40目、80目、100目、200目筛网除去杂质，得到滤液；
3)将步骤2)获得的所述滤液7000rpm离心0.5分钟，弃去上清，再加入等体积所述的脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液；
4)将步骤3)获得的所述混匀的混合液加入液基保存瓶，使用液基薄层细胞涂片机进行TCT制片。
实施例9检测长期保存的粪便脱落细胞
取适量粪便样品加入10mL加入如实施例2所述的脱落细胞液基保存液，混匀放置5分钟；将该混合液依次过40目、80目、100目、200目筛网除去杂质；将该滤液于6000rpm离心1分钟，弃去上清，再加入10ml脱落细胞液基保存液，得保存液A。所述的保存液A在室温条件下保存2周后可在4℃长期保存，将其加入液基保存瓶，使用液基薄层细胞涂片机进行TCT制片。观察制得的TCT片可知，可以明显地区分粪便中的单个有核细胞，以及一定数量的血红细胞，即长时间保存的粪便脱落细胞仍可以利用所述脱落细胞液基保存液制片观察。
对比实施例1
现有常规的脱落细胞液基保存液会裂解样本中的红细胞，不能判断是否存在隐血症状。由于粪便中成分复杂，同时也含有较大量的食物残渣和细菌及大量肠道粘液，以至于普通的液基保存液不能很好的分离脱落细胞。同时普通的液基保存液，对粪便脱落细胞进行处理需要通过多个步骤，同时利用现有常规的脱落细胞液基保存液，收集粪便脱落细胞操作十分困难。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不构成对权利要求范围的限制，本领域内技术人员可以想到的其他实质上等同的替代，均在本发明保护范围内。
Claims (10)
1.一种脱落细胞液基保存液，其特征在于，所述脱落细胞液基保存液由以下成分组成：多聚甲醛3.8～4.2％、N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐0.8～1.5％、冰醋酸0.8～1.5％、乙酰半胱氨酸0.1～0.2％、氯化钠0.75～0.85％、氯化钾0.01～0.03％、磷酸氢二钠0.12～0.15％和磷酸二氢钾0.025～0.03％，余量为水，使用pH调节剂调节pH至7.2～7.8，所述百分比为质量体积百分比。
2.如权利要求1所述的脱落细胞液基保存液，其特征在于，所述多聚甲醛为4.0～4.1％；所述N-甲基-N-环己基-2-氨基-3,5-二溴苯甲胺盐酸盐为1.0～1.2％；所述乙酰半胱氨酸为0.12～0.15％；所述氯化钠为0.80～0.82％；所述氯化钾为0.015～0.02％；所述磷酸氢二钠为0.142～0.145％；所述磷酸二氢钾为0.27～0.28％；所述pH调节剂为氢氧化钠；所述调节pH为调节pH至7.5；和/或所述水为双蒸水。
3.一种利用如权利要求1所述的脱落细胞液基保存液的液基薄层细胞学制片的方法，其特征在于，其包括以下的步骤：
1)将样品放置于所述的脱落细胞液基保存液中3～8分钟，得到混合液；
2)将步骤1)获得的所述混合液依次通过筛目数为40目～200目且筛目数从小到大的筛网，除去杂质后得到滤液；
3)将步骤2)获得的所述滤液5000～7000rpm离心0.5～2分钟，弃去上清，再加入所述脱落细胞液基保存液，混匀，得混匀的混合液；
4)将步骤3)获得的所述混匀的混合液，使用液基薄层细胞涂片机进行制片。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤1)所述脱落细胞液基保存液的体积为8～15mL，较佳地为10mL；和/或所述放置于所述脱落细胞液基保存液的时间为5分钟。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤2)所述混合液依次通过40目、80目、100目和200目的筛网。
6.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤3)所述的离心的速度为6000rpm；所述脱落细胞液基保存液的体积为与步骤1)所述的脱落细胞液基保存液的体积相同的体积；和/或所述的离心的时间为1分钟。
7.如权利要求3所述的方法，其特征在于，步骤4)所述混匀的混合液放置在液基保存瓶中；和/或所述的制片为TCT制片。
8.一种含有如权利要求1所述脱落细胞液基保存液的TCT法检测脱落细胞的试剂盒。
9.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还含有酒精固定液。
10.如权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，所述的脱落细胞的样品的来源为粪便。
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