ES2901734T3

ES2901734T3 - Armazones de páncreas humano

Info

Publication number: ES2901734T3
Application number: ES19193211T
Authority: ES
Inventors: Giuseppe Mazza; Massimo Malago; Coppi Paolo De; Massimo Pinzani; Walid Al-Akkad
Original assignee: UCL Business Ltd
Current assignee: UCL Business Ltd
Priority date: 2014-06-03
Filing date: 2015-06-02
Publication date: 2022-03-23
Anticipated expiration: 2035-06-02
Also published as: JP2017522009A; JP6636956B2; EP3613447A1; GB201409858D0; CN112546302A; EP3151875A1; DK3613447T3; US10688221B2; DK3151875T3; CN106687152A; CN106687152B; US20170112967A1; EP3613447B1; JP2020072672A; EP3151875B1; JP7361591B2; ES2756049T3; WO2015185912A1

Abstract

Un método para producir un armazón de páncreas humano, que comprende: (i) dañar mecánicamente las células en tejido pancreático humano sano o patológico que comprende un páncreas entero o una unidad funcional del mismo, (ii) someter las células del tejido a estrés osmótico exponiendo el tejido a un reactivo hipotónico o a un reactivo hipertónico, (iii) opcionalmente, exponer el tejido a una proteasa y/o a una ADNasa, (iv) exponer el tejido a un detergente, y (v) repetir una o más veces en cualquier orden cada una de la etapa (ii), de la etapa (iii) y de la etapa (iv), produciendo de este modo un armazón de páncreas humano, en donde el tejido pancreático humano es sometido a un estrés de cizalla de flujo generado por la perfusión del tejido pancreático humano en una dirección retrógrada durante las etapas (ii) a (v) a una tasa que se incrementa progresivamente hasta un valor máximo durante dos o más repeticiones de las etapas (ii) a (iv) y, a continuación, se mantiene.

Description

DESCRIPCIÓN

Armazones de páncreas humano

La presente invención se refiere a la producción de armazones de matriz extracelular (MEC) pancreática humana, por ejemplo, para su uso en: terapia, cribado de fármacos, identificación de biomarcador o modelización de enfermedad. La ingeniería de tejido es un campo emergente que está dirigido al mejoramiento de la calidad de vida de millones de personas por todo el mundo mediante la restauración de la función del órgano. La ingeniería de tejido combina células y armazones para el desarrollo de la estructura 3D para regenerar órganos y para recapitular la enfermedad in vitro. Además de la restauración de la función del órgano, la ingeniería de tejido puede proporcionar importantes aplicaciones biomédicas incluyendo plataformas para el ensayo in vitro de fármacos terapéuticos y agentes biológicos, para ensayar la toxicidad del fármaco, para la evaluación de nuevos dispositivos y técnicas de intervención, y para el descubrimiento de nuevos biomarcadores.

El hígado humano es un órgano único que está dividido en subunidades funcionales, denominadas segmentos (8 segmentos con suministro portal y arterial individual, drenaje venoso hepático y biliar) y sectores (más segmentos que comparten pedículos vasculares y biliares). Estos rasgos anatómicos permiten que el hígado humano se divida en varias subunidades funcionales que se pueden utilizar en la práctica de resección de hígado y trasplante de hígado segmentado. El hígado humano se perfunde de forma clásica con sangre de manera anterógrada desde la vena porta y los sistemas arteriales hepáticos; la sangre se drena por el sistema venoso hepático, la bilis secretada por el hígado por el sistema biliar.

El hígado tiene un amplio rango de funciones, incluyendo destoxificación, síntesis de proteínas, producción de compuestos bioquímicos necesarios para la digestión y un papel clave en el metabolismo de carbohidrato y lípido. El hígado es necesario para la supervivencia; actualmente no hay modo de compensar la ausencia de la función hepática a largo plazo. Esta función única es organizada por las células parenquimales y no parenquimales estrictamente organizadas en una red de proteínas de la matriz extracelular (MEC) que constituyen un armazón 3D.

La enfermedad del hígado debido a la infección viral, alcohol y otras afecciones está aumentado y actualmente causa 10.000 fallecimientos cada año en el RU y 32.000 fallecimientos en los EE.UU. El trasplante de hígado es el único tratamiento eficaz para la enfermedad del hígado aguda avanzada o crónica y está asociado a excelente supervivencia a largo plazo y calidad de vida. Sin embargo, la disponibilidad es limitada y la demanda está aumentado. Los tiempos de espera están aumentado con el 15 % a 25 % de las personas adecuadas para el trasplante de hígado muriendo o llegando a estar demasiado mal mientras están en la lista de espera. El desarrollo de un hígado artificial reducirá los fallecimientos debido a la enfermedad del hígado y proporcionará una solución para los pacientes en los que actualmente no se puede conseguir trasplante de órgano.

Además, todos los modelos usados para investigar la fibrosis hepática (HF) y el desarrollo del carcinoma hepatocelular (HCC) tienen problemas inherentes. Por tanto, los estudios en cultivos celulares sencillos monocapa 2D o cocultivos han formado la columna vertebral de la mayoría de los estudios in vitro, pero están muy alejados de la realidad. Además, la mayoría de los modelos animales, aunque comparten muchas características con la enfermedad humana no comparten el mismo modo de expresión génica que los seres humanos y su validez como un modelo in vivo es limitada. Por tanto, hay una necesidad no cubierta de desarrollar modelos que reproduzcan la complejidad de la enfermedad humana.

En los últimos años, la posibilidad de obtener armazones adecuados para su uso para la repoblación con células humanas se ha evaluado usando los hígados de grandes animales, tales como cerdos y ovejas. Sin embargo, a parte de las diferencias inherentes en las capacidades metabólicas del hígado, el armazón de MEC extracelular tiene distintos rasgos macroscópicos y microscópicos en diferentes especies. En particular, la segmentación y la lobulación del hígado humano no es tan evidente como en otras especies. Además, la anatomía lobular microscópica y la estructura del hígado humano es única y diferente de otros animales, tales como el cerdo, puesto que los límites fibróticos entre los lóbulos del hígado no están presentes en los seres humanos (y la arquitectura lobular humana es sin límites estructurales formales). La presencia de límites fibróticos típicos de los hígados de cerdo representa un problema principal para el uso de armazones obtenidos del hígado de cerdo en trasplante en seres humanos, después de la repoblación con células humanas. De hecho, la diferente arquitectura en cerdos podría conducir a hipertensión portal, puesto que la formación de puentes predispone a barreras de flujo en el hígado humano normal.

El desarrollo in vitro de tejido hepático humano 3D que recapitula la composición y la organización de las proteínas de MEC humana 3D es uno de los retos principales en el campo de la ingeniería de tejido. Un planteamiento prometedor implica el establecimiento de armazones biológicos mediante un proceso de descelularización de tejido. Sin embargo, informes previos de otros autores han fallado en obtener el armazón de hígado humano 3D debido a la diferencia intrínseca en la macro y microestructura, peculiar a los seres humanos y característicamente diferente de otros animales. Aunque se ha publicado la descelularización de hígados de ratón, rata, hurón, oveja y cerdo, no hay publicaciones que describan la generación con éxito de armazón biológico de hígado humano.

Los presentes inventores han reconocido que se pueden usar regímenes que comprenden uno o más ciclos de tratamiento con conjuntos de diferentes agentes dañinos celulares para someter a descelularización el tejido hepático humano sin dañar la matriz extracelular. Esto puede ser útil en la producción reproducible de armazones acelulares que mantienen la arquitectura y la morfología de la matriz extracelular de hígado humano.

La invención es como se expone en las reivindicaciones adjuntas.

Un aspecto de la invención proporciona un método para producir un armazón de páncreas humano que comprende

(i) dañar mecánicamente las células en el tejido pancreático humano sano o patológico que comprende el páncreas entero o una unidad funcional del mismo,

(ii) someter las células en el tejido a estrés osmótico exponiendo el tejido a un reactivo hipotónico o reactivo hipertónico,

(iii) opcionalmente exponer el tejido a una proteasa y/o a una ADNasa, y

(iv) exponer el tejido a un detergente, y

(vi) repetir cada una de la etapa (ii), la etapa (iii) y la etapa (iv) una o más veces en cualquier orden,

produciendo de ese modo un armazón de hígado humano,

en donde el tejido pancréatico humano está sometido a esfuerzo de cizalla de flujo generado por la perfusión del tejido pancréatico humano en una dirección retrógrada durante la etapa (ii) a (v) a una tasa que se incrementa progresivamente a un valor máximo durante dos o más repeticiones de las etapas (ii) a (iv) y, a continuación, se mantiene.

En algunas realizaciones, el método puede comprender la etapa (iii). En otra realización, se puede omitir la etapa (iii) (es decir, el método no incluye la etapa (iii)).

Un armazón de hígado humano producido por los métodos reivindicados consiste en matriz extracelular (MEC) de hígado humano acelular (es decir, el armazón se somete a descelularización) y conserva la arquitectura tridimensional y la bioactividad de la MEC del tejido de páncreas fuente.

Después de dañar mecánicamente las células, el tejido pancréatico se expone a los diferentes reactivos de descelularización (es decir, reactivos de estrés osmótico, proteasa/ADNasa y detergentes) de manera secuencial. Las Etapas (ii), (iii) y (iv), y opcionalmente la etapa (iii), se pueden realizar una o más veces en cualquier orden para someter el armazón a descelularización. En algunas realizaciones, el tejido pancréatico puede exponerse a múltiples ciclos de todas las tres etapas (ii), (iii) y (iv), y opcionalmente la etapa (ii), en cualquier orden.

En algunas realizaciones, la etapa (i) se puede repetir una o más veces. Por ejemplo, el tejido hepático se puede exponer a múltiples ciclos que comprenden la etapa (i). Esto, por ejemplo, puede ser útil cuando se usan técnicas de no congelar descongelar, tales como ultrasonido, para dañar mecánicamente las células.

El tejido de páncreas se somete a esfuerzo de cizalla de flujo durante las etapas (ii) a (v). Esto facilita la penetración de los reactivos de descelularización dentro del tejido.

El esfuerzo de cizalla de flujo se genera en el tejido pancreático humano por perfusión.

El tejido pancreático humano para la descelularización como se describe en el presente documento se puede obtener de páncreas humanos que son inapropiadas para el uso clínico en trasplante. Se pueden obtener páncreas adecuados de acuerdo con las leyes nacionales y las directrices éticas pertinentes.

En algunas realizaciones, el tejido hepático puede ser tejido normal que no presenta patología asociada a daño o enfermedad.

En otras realizaciones, el tejido pancreático puede ser tejido patológico que presenta patología asociada a daño o enfermedad. Por ejemplo, el tejido pancreático puede ser graso, fibrótico, estar inflamado o presentar uno u otros rasgos más asociados a enfermedad o daño.

Los armazones de páncreas producidos a partir de tejido pancreático patológico pueden tener una estructura y composición diferente de los armazones producidos a partir de tejido pancreático sano. Por ejemplo, la morfología del armazón patológico o las cantidades o cantidades relativas de componentes de MEC, tales como colágeno, tenascina y laminina pueden estar alteradas en los armazones de tejido pancreático patológico en comparación con el tejido pancreático sano. Esto puede ser útil en la obtención de armazones de páncreas modificado por enfermedad específicos para la modelización de la enfermedad.

El tejido pancreático patológico se puede obtener de un individuo con una enfermedad del páncreas o una enfermedad que afecta al páncreas (por ejemplo, una enfermedad caracterizada por daño al páncreas o función pancreática alterada).

Los métodos para obtener y almacenar el tejido pancreático para descelularización como se describe en el presente documento son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, el páncreas se puede heparinizar para prevenir la coagulación y/o perfundir con un agente crioprotector para reducir o prevenir la alteración del tejido después de la descongelación.

El tejido pancreático humano adecuado para la descelularización como se describe en el presente documento puede incluir páncreas enteros o partes de un páncreas, incluyendo unidades funcionales pancreáticas, tales como pequeñas muestras o secciones de un páncreas.

La cantidad y la masa del tejido pancreático que se somete a descelularización como se describe en el presente documento puede depender del uso previsto del armazón. Por ejemplo, la masa del tejido pancreático que se somete a descelularización para su uso en un implante puede depender de la masa corporal del individuo y la cantidad de tejido pancreático funcional en el individuo.

En otras realizaciones, la parte puede se una pequeña sección o pedazo de páncreas no vascularizado de 0,2-2 cm de ancho, largo y/o diámetro, preferentemente 0,2-1,25 cm, más preferentemente 0,2-1,0cm (por ejemplo, una sección con un volumen de 0,008 cm3 a 2 cm3, más preferentemente 0,008 cm3 a 1 cm3, por ejemplo, aproximadamente 0,125 cm3). Preferentemente, la sección es de un tamaño adecuado para la manipulación en recipientes de laboratorio convencionales, tales como placas de multipocillos, y puede ser, por ejemplo, aproximadamente cúbica con lados de aproximadamente 0,5 cm.

Las pequeñas secciones o pedazos de páncreas no vascularizados pueden ser útiles en la reproducción de la complejidad del microambiente humano 3D a escala pequeña para la modelización de la enfermedad del páncreas, cribado de fármacos, identificación y validación de biomarcador y el desarrollo de diagnósticos de la enfermedad. Se pueden obtener secciones adecuadas usando un cortador de tejido, biopsia de punzón, biopsia con aguja o por escisión por escalpelo simple de secciones, tales como cubos, de parénquima.

Se pueden obtener múltiples partes de páncreas para descelularización como se describe en el presente documento a partir de un páncreas, por tanto, se puede usar un páncreas humano donante para más de un paciente o se puede usar tanto para aplicaciones clínicas como de modelización de enfermedad.

Un método puede comprender proporcionar un páncreas humano entero descartado o una parte del mismo. El páncreas humano entero se puede dividir en una o más partes antes de la descelularización como se describe en el presente documento.

En algunas realizaciones, el tejido pancreático humano se puede tratar con crioprotectores antes de la etapa (i). Por ejemplo, el tejido se puede tratar con crioprotectores intracelulares y/o extracelulares antes de ser congelado. Los crioprotectores adecuados incluyen DMSO, etilenglicol, propilenglicol, glicerol, 2-metil-2,4, pentanodiol (MPD), y sacarosa.

En la primera etapa de descelularización, las células en el tejido pancreático humano se someten a daño mecánico para facilitar su destrucción y eliminación. Las células se pueden dañar mecánicamente por cualquier técnica adecuada que dañe las células del tejido pancreático sin afectar a la matriz extracelular, incluyendo congelar/descongelar, sonicación, o ultrasonido focalizado de alta intensidad (HIFU).

En algunas realizaciones, las técnicas de daño mecánico no se pueden repetir después del tratamiento inicial. Por ejemplo, tal como el tratamiento de congelar/descongelar después de la exposición a otros reactivos de descelularización puede conducir a daño de la MEC.

En otras realizaciones, las células en el tejido pancreático se pueden someter a daño mecánico una o más veces después del tratamiento inicial (por ejemplo, en la etapa (v) anterior). Por ejemplo, el tejido se puede someter a HIFU o sonicación una o más veces.

Preferentemente, las células se dañan mecánicamente sometiendo el tejido pancreático humano a uno o más ciclos de congelar/descongelar. Por ejemplo, el tejido se puede congelar a -20 °C o menos, preferentemente -50 °C o menos, -60 °C o menos, -70 °C o menos y, a continuación, se descongela una o más veces. El tejido congelado se puede descongelar convenientemente a 4 °C o 37 °C. En algunas realizaciones preferidas, el tejido se puede descongelar a aproximadamente 4 °C para minimizar los gradientes de temperatura dentro del tejido que pueden dañar la MEC. Por ejemplo, el tejido se puede congelar a aproximadamente -80 °C durante 24 horas o más y, a continuación, se descongela a aproximadamente 4 °C.

El tejido pancreático humano que se somete a congelar/descongelar está preferentemente seco para prevenir el daño de la MEC. En algunas realizaciones, el tejido pancreático humano se puede secar antes de la etapa de congelar/descongelar, por ejemplo, por exposición 5 a 30 min a temperatura ambiente.

El tejido pancreático se puede someter a congelar/descongelar en un tampón isotónico, tal como solución salina, tal como NaCI al 0,90 % (p/v), o PBS.

Después del daño mecánico, el tejido pancreático humano se somete a descelularización por una serie de exposiciones secuenciales a reactivos osmóticos, enzima(s) y detergentes (es decir, reactivos de descelularización). Estas exposiciones secuenciales a diferentes reactivos de descelularización despegan las células y los restos celulares de la matriz extracelular (MEC) y los elimina del tejido pancreático.

El estrés osmótico causa lisis de las células en el tejido pancreático e intensifica los efectos del daño mecánico. El estrés osmótico se puede inducir exponiendo el tejido a uno o más reactivos osmóticos que tienen una presión osmótica diferente a las células en el tejido (es decir, un reactivo no isotónico). El tejido se puede exponer a uno o más reactivos hipotónicos que tienen una presión osmótica inferior que las células y someten las células a un ambiente hipotónico y/o uno o más reactivos hipertónicos que tienen una presión osmótica mayor que las células y somete las células a un ambiente hipertónico. En algunas realizaciones se pueden preferir reactivos hipotónicos.

Los reactivos hipertónicos pueden ser útiles, por ejemplo, en disociación de ADN de proteínas. Los reactivos hipertónicos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen solución salina (por ejemplo, NaCl al >0,9 % (p/v), por ejemplo, NaCl al 3 % a 7 % (p/v)), que opcionalmente se puede tamponar con, por ejemplo, soluciones de fosfato, borato o tris, y polietilenglicol.

Los reactivos hipotónicos pueden ser útiles, por ejemplo, en la inducción de lisis celular a través de efectos osmóticos simples con cambios mínimos en las moléculas y la arquitectura de la MEC. Los reactivos hipotónicos adecuados son bien conocidos en la técnica e incluyen agua, agua desionizada y solución salina de NaCl al <0,9 % (p/v).

En algunas realizaciones, las enzimas se usan para alterar las estructuras celulares y subcelulares en el tejido pancreático y romper las uniones celulares con la MEC. Por ejemplo, las proteínas en el tejido se pueden degradar con una proteasa. Las proteasas adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen tripsina. El tejido pancreático se puede exponer a tripsina al 0,0025-0,25 % (p/v), por ejemplo, tripsina al 0,025 %. En algunas realizaciones, el tejido pancreático se puede exponer a una proteasa en solución con agente quelante, tal como EDTA, el cual somete a quelación iones metálicos divalentes, tales como Ca2+, y altera la adhesión celular a la MEC.

En las series de exposiciones a reactivos de descelularización, el tejido pancreático se puede exponer a una proteasa antes de la exposición a un detergente. Esto permite que las células o el material celular se despeguen de la MEC por la proteasa para ser lavados del tejido por el detergente.

En otras realizaciones, el tejido pancreático se puede someter a descelularización sin el uso de una proteasa.

En algunas realizaciones, las estructuras genómicas y el ácido desoxirribonucléico en el tejido se puede despegar con una desoxirribonucleasa (ADNasa). Las ADNasas adecuadas son bien conocidas en la técnica e incluyen la ADNasa I. El tejido pancreático se puede exponer a 1000-10000 KU ADNasa 1, por ejemplo, aproximadamente 2000 KU ADNasa 1. El tratamiento con desoxirribonucleasa puede ser particularmente útil en métodos que emplean un detergente suave, tal como desoxicolato de sodio. En algunas realizaciones, la ADNasa puede estar en una solución equilibrada con sal, por ejemplo, NaCl 1 M. En otras realizaciones, el tejido pancreático se puede someter a descelularización sin el uso de una desoxirribonucleasa.

En algunas realizaciones, el tejido pancreático se puede someter a descelularización sin el uso de una desoxirribonucleasa o una proteasa.

Los detergentes solubilizan lípidos y grasas en el tejido y facilitan la eliminación de restos celulares de la MEC.

Los detergentes pueden incluir detergentes aniónicos, tales como dodecil fosfato de sodio (SDS), desoxicolato de sodio (SdC), y Triton™ X-200. Por ejemplo, el tejido pancreático se puede exponer a SDS al 0,01 % a 5 %, por ejemplo, SDS al 0,01-1 %; desoxicolato de sodio (SdC) al 0,01 % a 5 %, por ejemplo, aproximadamente desoxicolato de sodio al 4 %; y/o Triton™ X-200 al 0,01 % a 5 %, por ejemplo, Triton™ X-200 al 3 %.

Los detergentes pueden incluir detergentes no iónicos, tales como polietilenglicol y Triton™ X100, por ejemplo, polietilenglicol p-(1, 1,3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter. Por ejemplo, el tejido pancreático se puede exponer a Triton™ X-100 al 0,01 % a 5 %, o Triton™ X-100 al 1 % a 3 %, por ejemplo, Triton™ X-100 al 3 %.

Los detergentes pueden incluir detergentes zwitteriónicos, tales como CHAPS (3-[(3-Colamidopropil)dimetilamonio]-1-propanosulfonato), sulfobetaína-10 (3-(Decildimetilamonio)propanosulfonato), sulfobetaína-16 (n-Hexadecil-N,N-dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato), y Tri(n-butil)fosfato. Por ejemplo, el tejido pancreático se puede exponer a detergente zwitteriónico al 0,01 % a 5 %, por ejemplo, detergente zwitteriónico al 0,01-1 %.

Otros numerosos detergentes adecuados son bien conocidos en la técnica y están disponibles de fuentes comerciales (por ejemplo, Sigma Aldrich Co LLC, MO, EE.UU.).

En algunas realizaciones preferidas, el tejido pancreático se puede exponer a un primer detergente y un segundo detergente en etapas separadas. Por ejemplo, un método puede comprender (a) exponer el tejido a un detergente aniónico, tal como SDS y (b) exponer el tejido a un detergente no iónico, tal como Triton™ X-100.

En algunas realizaciones, la concentración del reactivo de descelularización que se emplea en cada etapa de tratamiento se puede incrementar progresivamente a un valor máximo. Por ejemplo, la concentración de detergente que se emplea se puede incrementar progresivamente a un valor máximo. La concentración de detergente inicial se puede bajar suficientemente para evitar la formación de agregados o agrupaciones de material celular que ocluyen los vasos en el tejido pancreático. Después del tratamiento con detergente inicial, la concentración del detergente se incrementa para eliminar eficazmente todo el material celular.

Por lo tanto, la etapa (iv) puede comprender la exposición del tejido hepático al detergente a concentraciones progresivamente crecientes. Preferentemente, se emplea la mayor concentración cuando se repite la etapa (iv). Por ejemplo, el tejido pancreático se puede exponer a SDS al 0,005-0,02 %, por ejemplo, aproximadamente SDS al 0,01 %, seguido de exposición a SDS al 0,05 % a SDS al 0,2 %, por ejemplo, aproximadamente SDS al 0,1 %, seguido de exposición a SDS al 0,5 % a SDS al 2 %, por ejemplo, aproximadamente SDS al 1 %.

Las etapas de tratamiento con detergente posteriores (es decir, repeticiones de la etapa iv) pueden emplear SDS al 0,5 % a SDS al 2 %, por ejemplo, aproximadamente s Ds al 1 %.

El tejido pancreático se puede exponer a los reactivos de descelularización mediante perfusión del tejido con los reactivos. El tejido pancreático se perfunde en una dirección retrógrada y no en una dirección anterógrada.

Las técnicas adecuadas para la perfusión de tejido in vitro son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo, el tejido pancreático se puede preparar para perfusión mediante la inserción de una cánula dentro de un vaso, conducto o cavidad. A continuación, el tejido sometido a canulación se puede perfundir con los reactivos de descelularización a través de la canulación.

La tasa de perfusión del tejido pancreático con los reactivos de descelularización no es constante. Por ejemplo, la tasa inicial de perfusión del tejido puede ser baja (por ejemplo, <0,99 ml/min/gramo de tejido) para evitar el daño arquitectural al tejido pancreático. Durante el trascurso de la descelularización, cuando se repiten las etapas (ii) a (iv), el tejido pancreático llega a ser menos resistente a la perfusión y la tasa de perfusión se incrementa (por ejemplo, >1 ml/min/gramo de tejido). Esto incrementa el esfuerzo de cizalla de flujo en el tejido.

La tasa de perfusión se incrementa progresivamente a un valor máximo (fase de compensación) durante dos o más ciclos de exposición a reactivos de descelularización y, a continuación, se mantiene a o cerca de este valor máximo (fase de estabilización). En algunas realizaciones, el tejido se puede perfundir inicialmente con los reactivos de descelularización a un caudal de 0,1-1,99 ml/min/gramo de tejido, por ejemplo, 0,5 a 1,5 ml/min/gramo, y progresivamente incrementado a 2-20 ml/min/gramo de tejido, por ejemplo, 2-8 ml/min/gramo. En otras realizaciones, el tejido se puede perfundir inicialmente con los reactivos de descelularización a un caudal de 0,01-0,99 ml/min/gramo de tejido, por ejemplo, 0,5 a 1,5 ml/min/gramo, y progresivamente incrementado, durante por encima de 5 a 10 días, preferentemente aproximadamente 9 días, hasta 1-10 ml/min/gramo de tejido, por ejemplo, 2-8 ml/min/gramo.

El tejido pancreático se puede perfundir con cada reactivo de descelularización durante aproximadamente 0,004 horas a aproximadamente 5 horas por gramo de tejido sólido (para muestras de tejido de >40 gramos) o aproximadamente 2 horas a aproximadamente 12 horas por gramo de tejido sólido (para muestras de tejido de <40 gramos).

Por ejemplo, la descelularización como se describe en el presente documento puede tardar 1-60 días, por ejemplo, 7 60 días, dependiendo de la masa inicial del tejido pancreático.

El orden en el que se perfunde el tejido con los diferentes reactivos de descelularización puede variar, someter el tejido pancreático a perfundir con cada reactivo al menos una vez, al menos dos veces o al menos tres veces durante el trascurso de la descelularización.

El orden de exposición a los diferentes detergentes se basa en su diferente mecanismo de acciones. El daño mecánico (primera etapa) fomenta una alteración celular intensa. La exposición a soluciones hipotónicas (segunda etapa) intensifica la lisis celular, cuando se lavan los materiales celulares. Tras ello, el tejido pancreático opcionalmente se expone a enzimas proteolíticas (tercera etapa) para eliminar los materiales celulares unidos a la MEC. Finalmente, el páncreas se expone a los diferentes detergentes (cuarta etapa) para lavar eficazmente los materiales celulares. Las cuatro etapas se pueden repetir en función del caudal.

El daño mecánico de la etapa (i) fomenta la alteración celular intensa dentro del tejido humano. Normalmente, la etapa (i) se realiza una vez al comienzo de la descelularización, pero en algunas realizaciones, se puede inducir daño mecánico mediado por HIFU o sonicación más de una vez durante la descelularización. La lisis celular causada por el daño mecánico se intensifica por el estrés osmótico en la etapa (ii). La exposición a soluciones osmóticas también lava los restos celulares del tejido. A continuación, el tejido pancreático opcionalmente se expone a ADNasa o preferentemente a enzima proteolítica en la etapa (iii) para eliminar el material celular que está unido a la MEC. Finalmente, el páncreas se expone a uno o más detergentes en la etapa (iv) para lavar los materiales celulares del tejido. Las etapas (ii) a (i) se pueden repetir una o más veces con incremento del esfuerzo de cizalla de flujo.

En algunas realizaciones, un método puede comprender repetir las etapas (ii) a (iv) en la siguiente secuencia por perfusión a través del tejido hepático; (ii), (iii), (ii), (iii) (iv), [(ii), (iv)]n, (ii), (iii), [(ii), (iv)]n, donde n es de 1 a 25. Un régimen de descelularización por perfusión adecuado se muestra en la Tabla 1. Opcionalmente, la etapa (i) también se puede repetir una o más veces en el método.

Los reactivos de descelularización se pueden perfundir a través de un páncreas entero o una unidad funcional del mismo para generar un armazón de MEC que se ajusta al tamaño y la estructura del tejido fuente. En algunas realizaciones, este armazón se puede repoblar posteriormente con células para obtener tejido pancreático funcional que puede, por ejemplo, ser adecuado para trasplante directo en seres humanos.

En algunas realizaciones, el tejido pancreático puede ser patológico. La perfusión del tejido pancreático patológico con los reactivos de descelularización puede ser útil, por ejemplo, en la generación de un armazón de m Ec que se puede repoblar con células para la modelización de enfermedad en 3D.

En otros ejemplos no reivindicados, el tejido hepático humano se puede exponer a los reactivos de descelularización sumergiendo el tejido en los reactivos y sometiéndolo a agitación, por ejemplo, en un agitador rotativo.

Las secciones o las muestras del tejido hepático se pueden agitar en reactivos de descelularización para generar armazones que reproducen la complejidad del microambiente humano 3D a pequeña escala para la modelización de la enfermedad del hígado. Las muestras pueden ser de tejido hepático normal o patológico. Las muestras adecuadas pueden oscilar de 0,2-2 cm o 0,2-1,0 cm de ancho/largo o diámetro. Por ejemplo, la muestra puede ser una sección o cubo de aproximadamente 5 mm de ancho, denominado un "cubo de tejido hepático" (CTH) en el presente documento. Las muestras de tejido hepático para la descelularización a través de un régimen de agitación se pueden obtener usando un cortador de tejido, biopsia con aguja, biopsia de punzón, o por escisión por escalpelo simple de secciones o cubos de parénquima de hígado humano, de acuerdo con técnicas convencionales.

La agitación del tejido hepático sumergido en los reactivos de descelularización puede someterlo a esfuerzo de cizalla de flujo. La agitación adecuada puede incluir agitación rotativa, por ejemplo, en un agitador rotativo o agitador magnético, a 100-1.000 rpm, preferentemente aproximadamente 900 rpm.

En algunos ejemplos no reivindicados, el tejido agitado se puede someter a uno o más ciclos de;

(a) exponer el tejido a un reactivo de estrés osmótico, por ejemplo, un reactivo hipotónico o hipertónico, (b) exponer el tejido a una proteasa y/o a una ADNasa, y

(c) exponer el tejido a un detergente,

en donde (a), (b) y (c) se pueden dar en cualquier orden en cada ciclo.

Por ejemplo, el tejido se puede someter a uno o más ciclos de;

(a) exponer el tejido a un reactivo hipotónico,

(b) exponer el tejido a un detergente, y

(c) exponer el tejido a una ADNasa,

Por ejemplo, se pueden realizar 1 a 25 ciclos.

El tejido se puede exponer al reactivo hipotónico, tal como agua, durante 12 a 36 horas, preferentemente, aproximadamente 24 horas. El tejido se puede exponer al reactivo hipotónico a 4 °C.

El tejido se puede exponer al detergente, tal como SdC, por ejemplo, SdC al 4 %, durante 4 a 12 horas, preferentemente aproximadamente 6 horas. El tejido se puede exponer al detergente a temperatura ambiente. El tejido se puede exponer a la ADNasa durante aproximadamente 3 horas. El tejido se puede exponer a la ADNasa a temperatura ambiente. Por ejemplo, el tejido se puede exponer a 2000KU ADNasa1 en NaCl 1 M.

Un método puede comprender además exponer el tejido a una solución de lavado después de la exposición a cualquiera de los reactivos de descelularización anteriormente expuestos. El tejido se puede lavar entre una o más de las etapas anteriores y/o entre los ciclos, por ejemplo, entre las etapas (a) y (b), entre las etapas (b) y (c) y/o después de la etapa (c) y antes de cualquier repetición de ciclo. Por ejemplo, el tejido se puede lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o PBS complementado con un agente antibiótico-antimicótico durante 5 a 30 min a temperatura ambiente, preferentemente aproximadamente 5 min. Los agentes antibióticos-antimicóticos adecuados son bien conocidos en la técnica.

En otros ejemplos no reivindicados, el tejido se puede someter a uno o más ciclos de;

(a) exponer el tejido a un reactivo hipotónico, tal como agua,

(b) exponer el tejido a una proteasa, tal como tripsina, preferentemente en dH2O (agua desionizada).

(c) exponer el tejido a un primer detergente, por ejemplo, un detergente aniónico, tal como SDS,

(d) exponer el tejido a un segundo detergente, por ejemplo, un detergente iónico, tal como Triton™ X-100.

El tejido se puede exponer al reactivo hipotónico, tal como agua, durante 15 a 30 min a temperatura ambiente. El tejido se puede exponer a la proteasa, por ejemplo, 0,025 % de tripsina en dH2O (agua desionizada) o EDTA durante 12 a 36 horas a temperatura ambiente.

El tejido se puede exponer al primer detergente, por ejemplo, SDS al 0,01-1 % durante 12 a 96 horas a temperatura ambiente.

El tejido se puede exponer al segundo detergente, por ejemplo, Triton™ X100 al 0,01-3 % durante 12 a 72 horas a temperatura ambiente.

Entre una o más de las etapas anteriores y/o entre los ciclos, se puede lavar el tejido. El tejido se puede lavar entre una o más de las etapas anteriores y/o entre los ciclos, por ejemplo, entre las etapas (a) y (b), entre las etapas (b) y (c), entre las etapas (c) y (d) y/o después de la etapa (d) y antes de cualquier repetición de ciclo. Por ejemplo, el tejido se puede lavar con solución salina tamponada con fosfato (PBS) o PBS complementado con un agente antibióticoantimicótico durante 5 min a 3 horas, por ejemplo, 30 min a 1 hora, a temperatura ambiente.

Por ejemplo, un método no reivindicado puede comprender someter el tejido agitado a uno o más ciclos de;

(a) exponer el tejido a agua desionizada,

(b) lavar el tejido en PBS,

(c) exponer el tejido a SdC,

(d) lavar el tejido en PBS

(e) exponer el tejido a ADNasa, y

(f) lavar el tejido en PBS.

Las etapas (a) a (f) se pueden repetir de 4-8 veces, preferentemente aproximadamente 4 veces.

La agitación adecuada se puede proporcionar por un agitador orbital a 600-1.200 rpm, por ejemplo, aproximadamente 900 rpm; o un agitador magnético a 150-600 rpm, por ejemplo, 300-400 rpm.

En algunos ejemplos no reivindicados, el tejido se puede exponer a agua y solución de dextrosa alternativamente durante 4-12 horas, por ejemplo, 8 horas, antes de la etapa (a).

En otros ejemplos no reivindicados, un método anteriormente descrito puede comprender, además;

(f) exponer el tejido a un agente hipertónico, tal como solución salina al 9 %.

La duración de cada ciclo de exposición a los reactivos de descelularización puede ser de 2-3 días. El tiempo total para someter el armazón a descelularización usando un régimen de agitación puede ser de 2,5-25 días, por ejemplo, aproximadamente 8 días.

Después de la descelularización, el armazón se puede esterilizar, por ejemplo, mediante exposición a un agente de esterilización. Los agentes de esterilización adecuados incluyen Y-irradiación, agua electrolizada y agentes químicos, tales como ácido paracético. El armazón se puede exponer a ácido paracético al 0,01 % y etanol al 4 %, por ejemplo, durante 30 min a 2 horas.

El armazón se puede perfundir con el agente de esterilización o sumergirse en el agente de esterilización y someterse a agitación, como se describe en el presente documento.

Después de la descelularización y la esterilización, el armazón de páncreas se puede ensayar, por ejemplo, para la ausencia de células y/o la presencia de componentes de MEC, tales como colágeno, laminina, elastina, proteoglicanos, ácido hialurónico, fibronectina, factores de crecimiento y proteasa extracelulares.

Las técnicas adecuadas, incluyendo técnicas de visualización macroscópica, microscopía e inmunohistoquímicas, son bien conocidas en la técnica.

Los armazones de páncreas humano descelularizados pueden carecer de miofilamentos, células endoteliales, células de músculo liso, y restos celulares y núcleos detectables en secciones histológicas usando procedimientos de tinción histológica convencionales.

Los armazones de páncreas humano descelularizados producidos como se describe en el presente documento conservan la morfología y la arquitectura del órgano 3D y la bioactividad de la MEC del tejido pancreático fuente.

En algunas realizaciones, la arquitectura y la morfología de un armazón de páncreas descelularizado producido por los métodos anteriormente descritos se pueden confirmar por microscopía electrónica.

Dependiendo del tejido fuente, el armazón de páncreas puede comprender una MEC normal o puede ser una MEC modificada por enfermedad. Por ejemplo, el armazón de páncreas puede comprender una o más alteraciones estructurales que son características de una enfermedad o patología del páncreas.

Los armazones de páncreas humano permiten unión, migración, proliferación y organización tridimensional eficaces de las células que se cultivan en el armazón. El armazón de páncreas humano descelularizado también puede proporcionar moléculas bioactivas y propiedades bioinductivas, las cuales mantienen el fenotipo celular y las propiedades funcionales, y estimulan la producción de la matriz especifica a tejido.

Después de la producción del armazón de páncreas humano descelularizado como se describe en el presente documento, un método puede comprender la repoblación del armazón con células para producir el tejido pancreático artificial.

Las células adecuadas incluyen células pancreáticas primarias y de línea celular humanas, células endoteliales, iPSC o células derivadas de iPSC específicas a paciente, células madre embrionarias (hESC), células madre mesenquimales (hMSC), células madre fetales (por ejemplo, células madre de fluido amniótico), células cancerosas y células progenitoras endoteliales (EPC).

En algunas realizaciones, el armazón de páncreas humano descelularizado se puede repoblar con células humanas autólogas obtenidas de un paciente, por ejemplo, para producir tejido pancreático artificial para la implantación en el paciente. En otras realizaciones, el armazón de páncreas humano descelularizado se puede repoblar con células humanas alogénicas, es decir, células derivadas de un individuo humano diferente, por ejemplo, para producir tejido pancreático artificial para la implantación en el paciente. En algunas realizaciones, las células humanas alogénicas se pueden cribar para la inmunocompatibilidad con el paciente antes de la implantación.

El armazón descelularizado se puede repoblar sembrando el armazón con células dentro del armazón y cultivando bajo condiciones adecuadas. Por ejemplo, las células se pueden inyectar directamente en el parénquima del armazón descelularizado; perfundir a través de los accesos vasculares principales; y/o añadir gota a gota sobre la superficie del armazón descelularizado

Otros ejemplos no reivindicados proporcionan la descelularización del tejido hepático de un animal no humano, tal como un primate no humano, cerdo, oveja, caballo o vaca, usando los métodos anteriormente descritos con los cambios que correspondan, para producir un armazón de hígado no humano. El armazón no humano se puede repoblar con células humanas como se ha descrito anteriormente para producir tejido hepático artificial que comprende células humanas dentro de un armazón de MEC no humano. Esto puede ser útil en la producción de tejido hepático artificial para la implantación en los pacientes.

En algunos ejemplos no reivindicados, un armazón de hígado humano descelularizado o tejido hepático artificial producido como se describe en el presente documento, se puede diseccionar para eliminar una o más estructuras del tejido hepático, tales como conductos y vasos. Las estructuras eliminadas de un armazón de hígado humano descelularizado opcionalmente se pueden repoblar con células como se ha descrito anteriormente. Las estructuras eliminadas del armazón o el tejido hepático pueden ser útiles para trasplante, por ejemplo, para tratar la enfermedad como se describe más adelante, o para la modelización de la enfermedad.

Otros ejemplos no reivindicados proporcionan un armazón de hígado humano o tejido hepático artificial producido por un método anteriormente descrito.

Los armazones de páncreas humano producidos como se describe en el presente documento son acelulares y presentan la estructura poro de la matriz extracelular y la morfología del tejido pancreático fuente

El armazón o el tejido puede ser útil para la modelización de la enfermedad. Los armazones adecuados se pueden derivar del tejido pancreático normal o el tejido pancreático patológico, como se ha descrito anteriormente.

Un método de ejemplo no reivindicado de modelización de la enfermedad puede comprender;

proporcionar un armazón de hígado humano o tejido hepático humano artificial producido como se ha descrito anteriormente

determinar el efecto de un compuesto, fármaco, agente biológico, dispositivo o invención terapéutica sobre el armazón o el tejido o las células en el mismo.

Los métodos de ejemplo no reivindicados descritos en el presente documento pueden ser útiles en la modelización de enfermedades del hígado o enfermedades que afectan al hígado, tales como fibrosis de hígado, cáncer de hígado y metástasis, toxicidad de fármaco de hígado, respuestas inmunes postrasplante, y hepatitis autoinmune.

Los agentes biológicos pueden incluir virus, tales como VHB y VHC.

Los armazones de páncreas descelularizados pueden ser útiles para el diagnóstico de la enfermedad de páncreas. Los armazones adecuados se pueden derivar del tejido pancreático de un individuo sospechoso de tener enfermedad de páncreas.

Un método de diagnóstico no reivindicado de la enfermedad de hígado en un individuo humano puede comprender; proporcionar una muestra del armazón de hígado del individuo producido como se ha descrito anteriormente determinar la presencia y la cantidad de una o más proteínas del armazón de hígado en la muestra.

La presencia y la cantidad de proteínas del armazón de hígado en la muestra pueden ser indicativas de la presencia de enfermedad de hígado en el individuo.

El armazón o el tejido pueden ser útiles en terapia, por ejemplo, para el reemplazo o la complementación de tejido pancreático en un individuo.

Un método de tratamiento de una enfermedad de páncreas puede comprender;

implantar un armazón de páncreas humano o un tejido pancreático humano artificial producido como se ha descrito anteriormente en un individuo que lo necesita.

El armazón o el tejido implantado puede reemplazar o complementar el páncreas existente en el individuo.

Otro aspecto de la invención proporciona un armazón de páncreas humano o un tejido pancreático humano artificial producido como se ha descrito anteriormente para su uso en el tratamiento de la enfermedad o disfunción pancreática en un individuo.

Por ejemplo, se puede implantar un armazón de páncreas humano o un tejido pancreático humano artificial en un individuo para regenerar o completar un páncreas nuevo completo o para proporcionar la reparación de un páncreas dañado, o puede apoyar la función pancreática del individuo desde fuera del cuerpo.

El armazón de páncreas humano descelularizado producido por un método descrito anteriormente puede repoblarse con células para producir tejido pancreático artificial.

Aspectos de la invención proporcionan un armazón de páncreas humano descelularizado y tejido pancreático artificial producidos por los métodos descritos en el presente documento.

El armazón de páncreas humano y el tejido pancreático artificial pueden utilizarse para la modelización, el diagnóstico y los métodos de tratamiento de enfermedades como se describe anteriormente, con los cambios que correspondan, para armazones y tejido hepático.

Diversos aspectos y realizaciones adicionales de la presente invención estarán claros para los expertos en la técnica en vista de la presente divulgación.

Otros aspectos y realizaciones de la invención proporcionan los aspectos y las realizaciones anteriormente descritos con el término "que comprende" reemplazado por el término "que consiste en" y los aspectos y las realizaciones anteriormente descritos con el término "que comprende" reemplazado por el término "que consiste esencialmente en". Hay que entender que la solicitud divulga todas las combinaciones de cualquiera de los anteriores aspectos y realizaciones anteriormente descritos unos con otros, a menos que el contexto exija lo contrario. De manera similar, la solicitud divulga todas las combinaciones de los rasgos preferidos y/o opcionales o bien por separado o juntos con cualquiera de los otros aspectos, a menos que el contexto exija lo contrario.

Las modificaciones de las anteriores realizaciones, realizaciones adicionales y modificaciones de las mismas estarán claras para los expertos en la técnica en la lectura de esta divulgación, y propiamente dicho estas están dentro del alcance de la presente invención.

Todos los documentos y entradas de bases de datos de secuencias mencionados en la presente memoria descriptiva se incorporan en el presente documento por referencia en su totalidad a todos los efectos.

"y/o" cuando se usa en el presente documento debe tomarse como divulgación específica de cada uno de los dos rasgos o componentes especificados con o sin el otro. Por ejemplo, "A y/o B" debe tomarse como una divulgación específica de cada uno de (i) A, (ii) B e (iii) A y B, como si cada uno de ellos se expusiera individualmente en el presente documento.

Algunos aspectos y realizaciones de la invención se ilustrarán ahora mediante los siguientes ejemplos no reivindicados y con referencia a las figuras descritas a continuación.

La Figura 1 muestra el caudal (en ml/min) en relación a las diferentes fases de perfusión durante los 14 días del proceso de descelularización.

La Figura 2 muestra cubos de tejido hepático (CTH) de 125 mm3 antes de la descelularización.

La Figura 3 muestra comparación histológica de tejido nativo y CTH descelularizados (CTHd) después de 4 ciclos de descelularización. La tinción con H&E (Hematoxilina y Eosina) mostró eliminación de células después de la descelularización de los CTH y la tinción con RS (Rojo Sirio) mostró conservación de colágeno (rojo) y eliminación de materiales celulares (amarillo).

La Figura 4 muestra la medición cuantitativa de colágeno (parte superior) y ADN (parte inferior) después de la descelularización. La cuantificación de colágeno después de diferentes velocidades de agitación (900C1- 900C4) demostró una conservación de la cantidad de colágeno cuando se compara con tejido fresco. La descelularización era eficaz con una disminución marcada en el contenido de ADN (p<0,01) ya después de 1 ciclo de tratamiento (parte inferior).

La Figura 5 muestra la repoblación de armazones de hígado humano con la línea de célula estrellada hepática humana LX2. (Panel superior) La tinción con H&E demuestra progresiva migración de célula LX2 en el armazón de CTH cuando se compara el día 1 con 21 días después de la recelularización. (Panel inferior) El proceso de la repoblación se caracteriza por proliferación celular marcada cuando se detecta con una inmunotinción para el marcador de proliferación Ki67.

La Figura 6 muestra un incremento en el recuento celular total después de 14 días de repoblación con LX2. De manera importante, el recuento celular total en los armazones de hígado humano se incrementó significativamente entre 14 y 21 días (panel izquierdo). La inmunohistoquímica de KI67 muestra que más del 85 % de las células estaban proliferando en todos los diferentes momentos (panel derecho).

La Figura 7 muestra la repoblación de armazones de hígado humano descelularizados con la línea celular de carcinoma hepatocelular humano SK-Hep. La tinción con H&E y HVG (Hematoxilina Van Gieson) demuestra la unión celular después de 1 día de modificación por bioingeniería y progresiva migración celular en el armazón de hígado humano cuando se compara el día 1 con el día 14 después de la recelularización.

La Figura 8 muestra la tinción de FACS de SK-Hep con anti-Nanog humano (derecha) y control con isotipo (izquierda). La Figura 9 muestra la repoblación de armazones de hígado humano descelularizados con la línea celular de carcinoma hepatocelular humano SK-Hep después de 1 y 7 días. La expresión de Nanog se analizó por inmunohistoquímica (IHC, forma siglada de immunohistochemistry). Es evidente que las células unidas a la MEC el día 1 y las células que migran dentro del armazón en el día 7 son células Nanog positivas.

La Figura 10 muestra la repoblación de armazones de hígado humano descelularizados con la línea celular de carcinoma hepatocelular humano SK-Hep después de 14 días. La expresión de Nanog se analizó por inmunohistoquímica (Marrón) y las células se sometieron a contratinción con Hematoxilina (Azul). El proceso de repoblación después de 14 días se caracteriza por tanto células Nanog positivas como Nanog negativas (parte inferior). Es notable que en esta fase las células Nanog positivas rodean el armazón repoblado (parte superior) con rasgos que se parecen al desarrollo del carcinoma hepatocelular humano.

La Figura 11 muestra la apariencia macroscópica del lóbulo izquierdo del hígado humano descelularizado usando dos fondos de luz diferentes para resaltar la conservación del árbol vascular.

La Figura 12 muestra secciones histológicas del árbol vascular (vena porta, arteria hepática y placa hiliar) y biliar descelularizado. H&E muestra ausencia de células en los tejidos descelularizados. Las tinciones con RS y EVG muestran conservación de colágeno (rojo) y elastina (azul), respectivamente.

La Figura 13 muestra la comparación histológica de tejido hepático fresco y los segmentos del lóbulo izquierdo de hígado humano descelularizados (S1, S2, S3 y S4). La tinción con H&E mostró la eliminación de células después de la descelularización y las tinciones con RS y EVG (Elastina Van Gieson) muestran conservación de colágeno (rojo) y elastina (azul), respectivamente.

La Figura 14 muestra la repoblación de armazones de hígado humano con la línea de célula estrellada hepática humana LX2. Las tinciones con H&E y HVG demuestran unión celular después de 1 día de modificación por bioingeniería y progresiva migración celular en el armazón de hígado humano cuando se compara el día 1 con el día 14 después de la recelularización.

La Figura 15 muestra una imagen de SEM (forma siglada de scanning electrón microscopy, microscopia electrónica de barrido) a bajo aumento (90x) que incluye un tracto portal rodeado por una estructura lobular típica.

La Figura 16 muestra una imagen de SEM 300x que confirma la acelularidad del armazón y que define claramente los espacios una vez ocupados por hepatocitos (es decir, espacios libres de hepatocito).

La Figura 17 muestra una imagen de SEM a alto aumento (2.500x) que demuestra una malla tridimensional excepcionalmente conservada de fibras de tejido conectivo que estructura los espacios libres de hepatocito.

Abreviaturas; SdC Desoxicolato de sodio; PBS/AA/PBS Antibiótico Antimicótico; T/E 0,025 % Tripsina/EdTA al 0.

025 %; SDS Dodecilsulfato sódico; TX100 Triton X 100; TA temperatura ambiente; PAA Ácido Paracético; EtOH Etanol.

1. Métodos

1.1 Recogida de hígado humano y canulación

Se heparinizaron órganos de hígado humano descartados (OHHD) inapropiados para el trasplante de hígado según el procedimiento estándar para trasplante. Los OHHD se preparan adecuadamente por subdivisión de bloque múltiple en pequeñas unidades de hígado no vascularizadas de 0,2-1,0 cm (cubos de tejido hepático, CTH) y/o mediante preparación en segmento o subsegmento de unidades proporcionadas de pedículos vasculares-biliares. El hígado humano entero o alternativamente el lóbulo izquierdo (segmentos 2-3-4 ±1), lóbulo derecho (segmentos 5-8) o el hígado lateral izquierdo (segmentos 2-3± 1) así como los cubos de tejido hepático (CTH) se congelaron a -80 °C durante al menos 24 horas para facilitar la lisis celular.

1.2 Descelularización por perfusión del lóbulo izquierdo de hígado humano entero

Primero, se descongeló el lóbulo izquierdo de hígado humano entero durante la noche en PBS a 4 °C. Segundo, se sometieron a canulación la vena cava o las venas hepáticas para iniciar un sistema de perfusión retrógrado.

Finalmente, se aplicaron 5CDFs para conseguir descelularización de órgano completa, como se muestra en la Tabla 1.2 y la Figura 1. Se adoptaron dos fases de perfusión a) incremento abrupto del caudal para compensar la resistencia b) estabilización del caudal cuando trascurre la descelularización. Las dos fases de caudal se muestran en la Figura 1.

1.3 Descelularización por agitación de CTH humano

Los CTH se descongelaron a 37 °C durante 1-1,5 h. El protocolo para la descelularización de los CTH se muestra en las Tablas 3 a 5.

2. Resultados

Se compararon el tejido hepático nativo y los CTH descelularizados (CTHd) de manera histológica después de 4 ciclos de descelularización. Se encontró que los ciclos de descelularización habían eliminado las células y el material celular de los CTH, mientras que se conservaba el colágeno (Figura 3).

Se cuantificaron el colágeno y el ADN en los CTHd después de la descelularización. Se encontró que la cantidad de colágeno en los CTHd se conservaba a diferentes velocidades de agitación cuando se comparaba con tejido fresco (900C1- 900C4) (parte superior de la Figure 4). La descelularización era eficaz con una disminución marcada en el contenido de ADN (p<0,01) después de solamente 1 ciclo de tratamiento (parte inferior de la Figura 4).

Los CTH humanos descelularizados se repoblaron con la línea de célula estrellada hepática humana LX2. Se encontró que las células LX2 migraban progresivamente en el armazón de CTH durante 21 días después de la recelularización (Panel superior de la Figura 5). Se encontró que el recuento celular total en los armazones de hígado humano se incrementaba después de 14 días de repoblación con LX2 y se incrementaba significativamente entre los 14 y 21 días (Panel izquierdo de la Figura 6). La inmunotinción para el marcador de proliferación Ki67 mostró que el proceso de repoblación se caracteriza por proliferación celular marcada (Panel inferior de la Figura 5) y en todos los diferentes momentos, más del 85 % de las células estaban proliferando (Panel derecho de la Figura 6).

Los armazones de hígado humano descelularizados se repoblaron con la línea celular del carcinoma hepatocelular humano SK-Hep. Se observó la unión celular después de 1 día de modificación por bioingeniería y las células SK-Hep migraron progresivamente dentro del armazón de hígado humano en los 14 días después de la recelularización (Figura 7). Se mostró que las células unidas a la MEC el día 1 y las células que migraron dentro del armazón el día 7 eran células Nanog positivas (Figuras 8 y 9). El proceso de repoblación después de 14 días estaba caracterizado tanto por células Nanog positivas como por Nanog negativas (Figura 10). Notablemente, después de 14 días, se encontró que las células Nanog positivas rodeaban el armazón repoblado con rasgos parecidos al desarrollo del carcinoma hepatocelular humano (Figura 10; panel superior).

Se encontró que se conservaba el árbol vascular del lóbulo izquierdo del hígado humano observado después de la descelularización (Figura 11). Se encontró que las células estaban ausentes de los tejidos descelularizados mientras que el colágeno y la elastina se conservaban (Figura 12).

La comparación de tejido hepático fresco y los segmentos del lóbulo izquierdo del hígado humano descelularizados (S1, S2, S3 y S4) confirmó la eliminación de las células después de la descelularización y la conservación de colágeno y elastina (Figura 13).

Los segmentos del lóbulo izquierdo del hígado humano descelularizados se repoblaron con la línea de célula estrellada hepática humana LX2. Se encontró que las células LX1 se unían al armazón descelularizado después de 1 día y migraban progresivamente dentro del armazón durante 14 días (Figura 14).

Los armazones de hígado humano descelularizados se analizaron por microscopía electrónica de barrido. Las imágenes de SEM confirmaron la acelularidad del armazón y mostraron la presencia de espacios claramente definidos una vez ocupados por hepatocitos (es decir, espacios libres de hepatocitos). Se encontró que la malla tridimensional de fibras de tejido conectivo que estructura los espacios libres de hepatocitos, así como los tractos portales y la estructura lobular, estaban excepcionalmente conservados (Figura 15-17).

Tabla 1

continuación

DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA DÍA

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 100 300 425 475 550 675 850 1.300 1.500 1.750 1.750 1.800 1.750 1.750 1.750 150 350 450 500 600 700 1.000 1.350 1.550 1.755 1.800 1.750 1.750 1.750 1.750 200 375 450 525 650 750 1.200 1.400 1.700 1.850 1.800 1.750 1.750 1.750 1.750 250 400 450 525 650 800 1.200 1.400 1.700 1.900 1.800 1.750 1.750 1.750 1.750

1.700

1.750

Tabla 2

Tabla 3

Tabla 4

Tabla 5

Tabla 6

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para producir un armazón de páncreas humano, que comprende:

(i) dañar mecánicamente las células en tejido pancreático humano sano o patológico que comprende un páncreas entero o una unidad funcional del mismo,

(ii) someter las células del tejido a estrés osmótico exponiendo el tejido a un reactivo hipotónico o a un reactivo hipertónico,

(iii) opcionalmente, exponer el tejido a una proteasa y/o a una ADNasa,

(iv) exponer el tejido a un detergente, y

(v) repetir una o más veces en cualquier orden cada una de la etapa (ii), de la etapa (iii) y de la etapa (iv), produciendo de este modo un armazón de páncreas humano,

en donde el tejido pancreático humano es sometido a un estrés de cizalla de flujo generado por la perfusión del tejido pancreático humano en una dirección retrógrada durante las etapas (ii) a (v) a una tasa que se incrementa progresivamente hasta un valor máximo durante dos o más repeticiones de las etapas (ii) a (iv) y, a continuación, se mantiene.

2. Un método según la reivindicación 1, en el que se dañan las células mecánicamente (i), sometiendo el tejido a una o más rondas de congelación y de descongelación o (ii) sometiendo el tejido a HIFU o a sonicación.

3. Un método según la reivindicación 1 o según la reivindicación 2, en el que el agente hipotónico es agua desionizada y/o el agente hipertónico es agua o una solución salina.

4. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que se expone el tejido a una proteasa en la etapa (iii), opcionalmente tripsina o pronasa.

5. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que el detergente es un detergente aniónico, opcionalmente, dodecil sulfato de sodio (SDS) o desoxicolato de sodio (SdC).

6. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el detergente es un detergente no iónico, opcionalmente, polietilenglicol p-(1, 1, 3, 3-tetrametilbutil)-fenil éter (Triton X100™).

7. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la tasa de perfusión inicial es de 0,1-1,99 ml/min/gramo de tejido y/o en donde la tasa de perfusión objetivo es de 2-20 ml/min/gramo de tejido.

8. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la etapa (v) comprende;

a) repetir las etapas (ii) a (iv) en la siguiente secuencia por perfusión a través del tejido pancreático; (ii), (iii), (ii), (iii) (iv), [(ii), (iv)]n, (ii), (iii), [(ii), (iv)]n, donde n es 1 a 25; o;

b) repetir las etapas (ii) y (iv) 1 a 25 veces por perfusión a través del tejido pancreático.

9. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende esterilizar el armazón después de la descelularización.

10. Un método según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende repoblar el armazón con células para producir tejido pancreático artificial, en donde, opcionalmente, las células son: células pancreáticas primarias y de línea celular humanas, células endoteliales, iPSC humanas o células derivadas de iPSC específicas de paciente, células madre embrionarias humanas (hESC), células madre mesenquimales humanas (hMSc), células madre fetales humanas, células cancerosas humanas o células progenitoras endoteliales humanas (EPC).

11. Un armazón de páncreas humano producido por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, o un tejido pancreático artificial producido por un método según la reivindicación 10.

12. Un armazón de páncreas humano producido por un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, para su uso en un método de tratamiento de una enfermedad o de una disfunción pancreáticas, que comprende implantar el armazón de páncreas humano en un individuo que lo necesite.