CN102172418B - 一种缓释生长因子的无细胞基质材料 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种缓释生长因子的无细胞基质材料，所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子和无细胞基质组成。所述的无细胞基质是指膀胱无细胞基质、真皮无细胞基质或血管无细胞基质。所述的血管再生的生长因子是指VEGF或bFGF。所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)。本发明将纳米缓释系统成功地复合到无细胞基质中，缓释出的生长因子仍有效保持其生物学特性，缓释过程长且平稳。本发明得到了可以长期、平稳缓释生长因子的无细胞基质，完成了对无细胞基质的生长因子修饰。

Description

一种缓释生长因子的无细胞基质材料

技术领域

本发明涉及一种无细胞基质材料技术领域，具体地说，是关于一种缓释生长因子的无细胞基质材料。

背景技术

膀胱替代的临床病例很多，但膀胱替代一直是泌尿科医生的难题，其中的关键因素是缺乏合适的膀胱替代材料。本发明人研发组和其他很多研究小组已经明确膀胱无细胞基质（bladder acellular matrix allograft ，BAMA）可以作为支架允许膀胱再生，但存在明显的挛缩。

中国专利申请号：200810020808.0公开了一种多孔的保留有生物活性因子的膀胱无细胞基质及制备方法。但是关于可以长期、平稳缓释生长因子的膀胱无细胞基质，目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种缓释生长因子的无细胞基质材料。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：

一种缓释生长因子的无细胞基质材料，所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子和无细胞基质组成。

所述的无细胞基质是指膀胱无细胞基质、真皮无细胞基质或血管无细胞基质。

所述的血管再生的生长因子是指VEGF或bFGF。

所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)。

所述的缓释生长因子的无细胞基质材料是由双乳化溶剂蒸发方法制备得到，双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间1-10分钟，乳化速率1-6千转/分钟，有机相-外水相体积比0.1-0.8。

所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间优选为5.5。

所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化速率优选为6。

所述的双乳化溶剂蒸发方法中有机相-外水相体积比优选为0.45。

所述的材料是采用25%的F127溶液制备得到的纳米凝胶材料。

所述的纳米凝胶材料的凝胶、溶胶转变温度为20℃。

本发明优点在于：

1、本发明的缓释生长因子的无细胞基质材料采用生物可降解型聚合物制备，可以实现血管再生的生长因子的长效缓释。

2、本发明将液状的纳米缓释系统转换为具有溶胶-凝胶转变特性的F127嵌段聚合物溶液，得到温敏纳米凝胶体系热敏凝胶可防止嵌入猪膀胱无细胞基质的纳米粒子溢出，使血管再生的生长因子实现在基质内的长效释放，同时凝胶可加强纳米粒子的缓释效果，延长血管再生的生长因子在基质内的作用时间，为缺损膀胱组织的再构建提供长效的生长因子供应。

3、本发明将纳米缓释系统成功地复合到膀胱无细胞基质中，缓释出的生长因子仍有效保持其生物学特性，缓释过程长且平稳。本发明得到了可以长期、平稳缓释生长因子的膀胱无细胞基质，完成了对膀胱无细胞基质的生长因子修饰。

4、本发明深入研究了纳米粒子制备各环节的关键影响因素对纳米粒子粒径、包封率、粒子多分散性能的影响，优选出载蛋白纳米粒子的最佳配方和制备参数。

附图说明

图1：单纯的纳米粒子的扫描电镜照片。

图2：包被在F127凝胶中的纳米粒子的扫描电镜照片。

图3：不同浓度的Pluronic F127的温敏行为转变的温度点。

图4：纳米粒子—F127的溶胶—凝胶转变行为。A，15℃时纳米粒子（50mg/ml）溶于20%（左）、25%（右）F127中，处于溶液状态；B，20℃时纳米粒子（50mg/ml）溶于20%（左）F127中，仍为溶液状态；溶于25%（右）F127中，转变为溶胶状态；C，全厚层猪膀胱无细胞基质；D，VEGF-NPs（纳米粒子）-F127多点序贯性注入膀胱无细胞基质后。

图5：裸鼠体内温敏行为的荧光检测：（a）量子点—纳米粒子—F127溶胶注射在裸鼠皮下；（b）量子点—纳米粒子溶液注射在裸鼠皮下；（c）量子点生理盐水溶液注射于裸鼠皮下。量子点使用剂量均为2mg/kg。

图6：在10 ng/ml VEGF、20 ng/ml VEGF以及含10 ng/ml VEGF的纳米介质（VEGF in NPs）、20 ng/ml VEGF的纳米介质（VEGF in NPs）刺激下，人脐血管内皮细胞培养1——5天的增殖情况，设无VEGF的纳米介质（NL-NPs）和无血清培养基（Control）为阴性对照。X轴为培养天数，Y轴为与无血清培养基相比的增殖倍数。* 表示P<0.05，** 表示P<0.01。

图7：PLGA纳米粒子在PBS溶液（PH7.4、37℃）中的时间——VEGF缓释百分比曲线。图中Released from F127 gel：从F127中缓释VEGF， Released from NPs: 从纳米粒子中缓释， Released from 包被在膀胱无细胞基质中的NPs—F127凝胶中缓释。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

实施例1

实验材料：

Pluronic

F127 (聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯三嵌段聚合物)

Tween® 80 (聚山梨酯80)

聚乙烯醇(PVA) (Mw 14–16 kDa)

乙交酯丙交酯共聚物（PLGA，乙交酯丙交酯比例50:50，购自济南岱罡生物材料公司）

rhVEGF₁₆₅ （购自Peprotech公司）

rhVEGF ELISA 试剂盒（购自Peprotech公司）

其余试剂未特殊说明均购自Sigma-Aldrich公司。

（一）纳米粒子的制备优化及表征评价

纳米粒子制备方法

采用双乳化溶剂蒸发技术制备载VEGF的PLGA纳米粒。具体为：精密称取20mgPLGA（50:50），溶于体积二氯甲烷中作为有机相；将VEGF、HAS、Hp（1:500:1）溶于100μl、pH值为7.4的磷酸盐缓冲溶液中作为内水相；将有机相注入内水相中，使用高速剪切机在3krpm转速下匀化2min得初乳(W1/O)；新鲜配制1.5%PVA和2%Tween80水溶液作为外水相，将初乳加入外水相中，使用高速剪切机匀化后得复乳(W1/O/W2)，迅速将复乳转移至旋转蒸发器中，室温下将有机溶剂蒸发，溶液中乳滴收缩，在表面效应下形成球形纳米粒子；将纳米粒子分散液旋转搅拌，固化后经高速冷冻离心后分离，加入超纯水洗涤、重新分散纳米粒子，共洗涤3次，分散后加入适量甘露醇冷冻干燥，得纳米粒子冻干粉。

预实验表明，纳米粒子粒径、多分散性和载药率为控制纳米粒子药物释放的关键指标。一般聚合物材料用量越多，纳米粒子粒径越大，因此为保证均一性，研究中每个优化配方统一使用等量聚合物材料；外水相中表面活性剂的种类与用量，也是影响纳米粒子制备的关键因素，一般用量越少纳米粒子粒径越大，但用量过多会造成溶液粘稠，并且使过多表面活性剂残留在纳米粒子中，因此研究统一采用1.5%PVA和2%Tween80水溶液作为外水相。除聚合物材料及表面活性剂因素外，研究发现有机相与外水相体积比、复乳制备时的匀化速度和时间为控制关键指标的关键因素，因此着重考察这三项因素对纳米粒子粒径、多分散性和载药率的影响。实验阵列安排见表1.

为直观考察纳米凝胶温敏行为及生物体相容性，制备了载有CdTe量子点荧光探针（激发波长400nm，发射波长590nm）的纳米粒。制备方法为：将量子点加入内水相溶液中替代蛋白药物，按上述方法制备。同时制备不含VEGF或量子点的纳米粒为对照备用。

纳米粒子在超纯水中重新分散，加入到嵌段聚合物F127，搅拌使溶解，使F127浓度至25%，得纳米粒子温敏凝胶-溶胶体系。

纳米粒子蛋白包封率的测定

取刚制备好的纳米粒子PVA、Tween80分散液，定溶后在20,000×g, 4℃, 10 min条件下离心，弃去沉淀，BCA法测定上清液中的蛋白总量，同时测定制备纳米粒子加入的蛋白总量，按以下公式计算纳米粒子包封率：包封率（%）=[(总蛋白量-上清液中蛋白量)]/总蛋白量×100% 。

结果与讨论

很多可变因素会对纳米粒子的制备造成影响，有些关键因素会对载药纳米粒子的关键考核指标造成巨大影响。通常情况下，纳米粒子的粒径、多分散性、对药物的包封率被认为是影响纳米粒子形态及药物释放的关键指标：粒径越大，纳米粒子的质地越疏松，药物释放就越快；多分散性越好，纳米粒子的形态就越均一，越容易得到均一的药物释放；提高对药物的包封率，可避免药物，特别是昂贵药物在载药纳米粒子制备过程中的浪费。

研究采用双乳化-溶剂蒸发法制备载蛋白的纳米粒子，选用纳米粒子粒径、多分散性和对药物的包封率作为控制制备过程的关键指标。预实验中发现，二次乳化过程为载蛋白纳米粒子制备过程的关键，由此设计实验阵列，对二次乳化过程中的三个关键影响因素：有机相-外水相体积比、乳化速度、乳化时间进行考察，通过优化以上三个关键因素，得到较为理想的载蛋白纳米粒子。

表1所示为载蛋白纳米粒子制备实验阵列安排，激光动态光散射法测定结果表明，各配方纳米粒子粒径从280.8 nm到2503.5 nm，其中配方1所制备的纳米粒子粒径最小（280.8），配方12所制备的纳米粒子粒径最大（2503.5）；多分散系数测定结果表明，配方2制备的纳米粒子多分散系数最小（0.286），配方6多分散系数最大（0.806）；对蛋白的包封率配方1最小（35.29±0.07%），配方8最大（55.88±0.10）。表1提示，增加乳液制备时的匀化速度可减小纳米粒子粒径，但过高的匀化速度会降低纳米粒子对蛋白的包封率，综合考虑，兼顾粒径、多分散性及包封率，配方5为较优配方。

表1：载蛋白纳米粒子制备时相关变量的实验阵列。

Experiment code	X1	X2	X3	aZ-Ave(nm)	Polydispersibility Indice	E.E.(%)±SD (n=6)
							1	8.2	5	0.66	280.8	0.483	35.29±0.07
2	8.2	5	0.24	309.5	0.286	38.82±0.53
							3	8.2	2	0.66	602.6	0.702	51.76±0.28
4	8.2	2	0.24	1428.7	0.632	50.59±0.46
							5	5.5	6	0.45	291.2	0.378	48.82±0.12
6	5.5	1	0.45	890.7	0.806	54.71±0.09
							7	5.5	3.5	0.8	355.4	0.567	42.94±0.14
8	5.5	3.5	0.1	640.2	0.686	55.88±0.10
							9	2.8	5	0.66	337.0	0.492	44.12±0.74
10	2.8	5	0.24	345.8	0.384	45.88±0.67
							11	2.8	2	0.66	651.0	0.712	50.00±0.41
12	2.8	2	0.24	2503.5	0.762	52.35±0.75
							13	10	3.5	0.45	380.5	0.536	44.71±0.69
14	1	3.5	0.45	1025.5	0.691	49.41±0.21
							15	5.5	3.5	0.45	429.2	0.555	47.06±0.552

注：X1：乳化时间，X2：乳化速率， X3：有机相-外水相体积比， ^aZ-Ave(nm)：粒径大小，E.E.：包封率。

纳米粒子形貌及粒径表征观察

通过Zeiss Ultra 55型扫描电子显微镜观察纳米粒子的形貌。样品制备方法：将上述制备的纳米粒子冻干粉，加入超纯水重新分散，直接滴在导电硅片上自然干燥，然后转入干燥器中减压彻底干燥，表面喷金，即可直接放入扫描电镜样品台观察，电压5KV。

通过Nicomp 380ZLS粒度分析仪测量纳米粒子的粒径。样品制备方法为：将上述制备的纳米粒子冻干粉，加入超纯水重新分散，放入测量池中直接测量，读取粒径及多分散系数数值。

结果与讨论

透射电镜图表明（图1和图2），纳米粒子呈表面光滑、粒径较均一的纳米级小球体，冻干处理后的纳米粒子无明显团聚，图中90%的纳米粒子粒径小于600nm，粒径多数处在100-400nm之间，集中于300nm左右，且粒径分布围绕300nm呈正态分布。由于对制备过程进行了优化，并选用合适浓度的Tween80与PVA进行复配制备纳米粒子，因此本研究中制备的载蛋白纳米粒子具有制备方法简单、方法可重复性强、纳米粒子粒径小、粒径分布均一、表面光滑、形态完整的优点，这些特点对于其中所包载蛋白药物的长效、稳定释放奠定了良好的基础。

二 ) 纳米凝胶的制备与评价

溶胶 - 凝胶转变温度及体外温敏行为考察

不同浓度的Pluronic F127具有不同的溶胶-凝胶转变温度，为了使制备的纳米凝胶在预期温度实现溶胶-凝胶转换，采用倒置管法考察了15%-30%浓度范围F127的溶胶-凝胶转变温度。首先将精确称量的F127在低温下溶解于少量超纯水中，将其定溶后移至EP管中，在恒温状态下不断翻转EP管，当溶液不再下滴，该温度即为该浓度F127的溶胶-凝胶转变温度。

纳米凝胶动物体内温敏行为及生物相容性考察

研究采用裸鼠皮下注射载量子点纳米凝胶，考察纳米凝胶在生物体体内的温敏行为及生物相容性。设载量子点纳米凝胶组、载量子点纳米粒子组、量子点生理盐水溶液组，以2mg/kg量子点浓度给以裸鼠皮下注射，从第10min开始，采用博托公司动物成像仪观测给药部位荧光强度变化，观测24h。

结果与讨论

合适的溶胶-凝胶转变温度对防止纳米粒子溢出膀胱无细胞基质、实现VEGF在基质中的长效释放非常重要，为此研究考察了不同浓度F127的溶胶-凝胶转变温度，F127水溶液具备温敏性源自其分子结构中的PPO、PEO分子链与水分子间的相互作用（临界共溶温度，LCST），在LCST以上，F127分子在水溶液中通过自组装形成PPO在内、PEO在外的胶束结构，随温度上升，胶束数量增加，胶束外壳PEO亲水性降低，PEO分子链间的水分子受到挤压和排斥，在到达一定温度后，水分子被完全挤压排出胶束结构，聚合物与水实现相分离，F127水溶液实现从溶胶到凝胶转变。

图3表明，随浓度增加，F127的溶胶-凝胶转变温度逐步降低，浓度低于15.4% F127 溶液无法形成凝胶，浓度高于30%的F127溶液很难配制，因此未予考察。据此，采用25%的F127溶液制备纳米凝胶，其凝胶、溶胶转变温度约在20℃(图4 中A、B)。图4 中C为单纯的膀胱无细胞基质，图4 中D为包封量子点探针的纳米凝胶缓释系统复合于膀胱无细胞基质。

图5：皮下注射量子点探针在不同时间点的裸鼠活体荧光成像图。（a）组注射载量子点纳米凝胶，皮下注射后10min可检测到强烈荧光信号，24h后荧光信号未有明显减弱，注射部位皮丘形状圆整，周围未显明显炎症反应，说明凝胶的生物体相容性优良，注射后荧光探针被很好地固定于凝胶中而完整保存；(b)组注射载量子点纳米粒子，皮下注射后荧光信号迅速聚集并快速衰减，这是由于注射物中水分被生物体迅速吸收，组成纳米粒子的生物可降解材料被生物体分解所致；(c)组注射量子点生理盐水溶液，由于量子点本身的强烈毒性及表面的包覆分子对生物体的刺激作用，因此给药后注射部位产生强烈的炎症反应，使荧光探针未被生物体迅速吸收而产生潴留，同时迅速炎症产生的肿胀造成注射部位皮肤变薄，使皮肤对荧光信号的通透性增加，荧光强度得以维持。

三 ) 纳米凝胶的 VEGF 体外缓释研究及生物活性考察

纳米凝胶体外释放研究

10mg载药纳米粒子重悬于0.2ml 25% F127溶液中，混合均匀，采用多点注射法将混悬液注入2cm²大小猪膀胱无细胞基质中，将基质浸入2ml pH7.4的无菌磷酸盐缓冲溶液，释放体系移入37℃饱和湿度环境中，每隔一定时间取样，同时补充等量新鲜释放介质，研究同时设载VEGF凝胶组、载VEGF纳米粒子组为参照，采用VEGF ELISA检测试剂盒测定取样液中VEGF的含量，具体操作参照试剂盒说明书进行。

缓释的 VEGF 生物活性考察

采用四甲基偶氮唑盐微量酶反应法（MTT）考察从纳米粒子中释放的VEGF的生物活性。载VEGF纳米粒子以人脐静脉内皮细胞（HUVEC）无血清细胞培养液为介质进行体外释放，分别于一定时间点取样后采用ELISA法测定VEGF含量，以无血清细胞培养液调整VEGF含量至特定浓度（10 ng/ml、20 ng/ml），备用。

将正常培养的HUVEC细胞以1000/孔的浓度种植于96孔板中，隔夜贴壁培养，分别加入VEGF浓度为10ng/ml 及20ng/ml的纳米粒子释放介质，同时设以无血清细胞培养液配制的10ng/ml 及20ng/ml 浓度的VEGF溶液为阳性对照，设不含VEGF的纳米粒子释放介质及无血清细胞培养液为阴性对照。细胞于正常培养环境培养3天后，采用MTT法检测细胞增殖倍数。统计检验采用t检验，95%置信区间。

结果与讨论

VEGF生物活性考察实验结果表明（图6），与不含VEGF的纳米粒子释放介质相比，含有10 或 20 ng/ml VEGF的纳米粒子释放介质可使HUVEC细胞3天后增殖增加2-2.5倍（P<0.01 ），这与未使用纳米粒子包裹的VEGF活性相当，说明使用纳米粒子作为VEGF的载体并未显著影响其生物活性，但10 ng/ml VEGF与20 ng/ml VEGF对HUVEC细胞增殖效果无显著差异。此外，无VEGF的空白纳米粒子释放介质对HUVEC细胞活性有轻微影响，但与空白细胞培养液相比不具备统计学差异，提示在实验浓度下，纳米粒子具有优良的细胞相容性。

图7为包埋载VEGF纳米凝胶的猪膀胱无细胞基质中VEGF的体外释放曲线，同时设载VEGF纳米粒子及载VEGF凝胶的体外释放为对照。图7表明，载VEGF纳米粒子的突释效应很强（2天达到约30%），在60d内约75%的VEGF得到释放；而载VEGF纳米凝胶中VEGF的释放，由于受到凝胶及无细胞基质的阻滞作用，突释效应被大大减弱（2天释放约15%），在60d内仅有约60%的VEGF得到释放，相对其它研究组，其对VEGF的缓释效果大大增强。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明方法的前提下，还可以做出若干改进和补充，这些改进和补充也应视为本发明的保护范围。

Claims (5)

1.一种缓释生长因子的无细胞基质材料，其特征在于：所述的材料由可降解疏水聚合物，血管再生的生长因子VEGF和膀胱无细胞基质组成；所述的可降解疏水聚合物是指聚乙交酯丙交酯、聚丙交酯、聚己内酯、聚(丙交酯-己内酯)或聚(丙交酯-乙交酯-己内酯)；所述的缓释生长因子的无细胞基质材料的制备方法是：首先制得载VEGF的可降解疏水聚合物纳米粒子，再将所述的载VEGF的可降解疏水聚合物纳米粒子悬于25%的Pluronic F127溶液制备得到纳米凝胶，最后将所述的纳米凝胶注入膀胱无细胞基质；所述的载VEGF的可降解疏水聚合物纳米粒子是由双乳化溶剂蒸发方法制备得到，双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间1-10分钟，乳化速率1-6千转/分钟，有机相-外水相体积比0.1-0.8。

2.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化时间优选为5.5分钟。

3.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述的双乳化溶剂蒸发方法中乳化速率优选为6千转/分钟。

4.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述的双乳化溶剂蒸发方法中有机相-外水相体积比优选为0.45。

5.根据权利要求1所述的材料，其特征在于：所述的纳米凝胶的凝胶、溶胶转变温度为20℃。

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