CN103623984A - 钛合金表面生长因子-纳米凝胶功能化修饰的方法 - Google Patents

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本发明涉及钛合金表面生长因子-纳米凝胶功能化修饰方法，以含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为间隔壁，先通过NHS与多巴胺的反应，再将羧基活化，并与生长因子-纳米凝胶表面的氨基反应，形成含多巴胺的生长因子-纳米凝胶，通过多巴胺在钛合金表面的自聚反应将生长因子-纳米凝胶偶联于钛合金表面。生长因子包括：骨形态发生蛋白、转化生长因子、血管内皮生长因子、血小板衍生生长因子和成纤维细胞生长因子。本发明的优点是利用简单的一锅反应将生长因子纳米凝胶偶联到钛合金表面，反应操作简单，反应条件温和，对于生长因子具有良好的活性保持。

Description

钛合金表面生长因子-纳米凝胶功能化修饰的方法
技术领域
本发明涉及以含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为间隔壁，先通过NHS与多巴胺的反应，再将羧基活化，并与生长因子-纳米凝胶表面的氨基反应，形成含多巴胺的生长因子纳米凝胶，通过多巴胺在钛合金表面的自聚反应将生长因子纳米凝胶偶联于钛合金表面从而实现对钛合金表面的生长因子纳米凝胶功能化修饰。
背景技术
随着人口老龄化和老年退行性疾病年轻化的趋势，各种脊柱和关节疾患的发病率逐年增加，需要进行脊柱融合手术和关节置换手术的数量也随之递增。钛合金具有优异的力学性能和良好的生物相容性，其作为主体材料已被广泛应用于此类手术，市场需求日益增加。但是，由于治疗对象为患骨质疏松症的老年人，他们体内的骨代谢失衡，其骨吸收胜过骨生成。而钛合金为生物惰性，其与植入部位骨组织整合性差，易于周围宿主组织分离而引起松动。因此，改善钛合金的生物活性，提升植入部位骨组织的修复能力、缩短愈合时间成为目前医用钛合金的研究焦点，而钛合金与骨的整合速率和植入后的稳定性主要取决于表面涂层的生物活性和骨诱导性。
基于对骨整合过程中分子时间的认识，在骨重建的不同阶段起关键作用的生长因子或基因的作用逐渐明确。在钛合金表面负载生长因子可增加植入部位生长因子浓度，提高骨组织的形成速度。早在1989年，Aspenberg就将胰岛素生长因子与钛组合用于骨的修复，从此以后，国内外一些课题组也陆续开展了类似的研究，目前针对骨科的应用，研究最多的骨形态发生蛋白2（BMP-2）。解放军总医院的李众利等采用三维连通多孔钛结构复合BMP-2，肌肉植入实验发现BMP-2能促使纤维组织长入孔隙结构内部，刺激血管生成，且30天后发现有钙化骨组织形成。
但是对于生长因子，其实际应用都面临着投递方式和活性保持两个主要问题。已经报导的钛合金表面生长因子投递技术包括：表面直接共价偶联、通过天然大分子共价结合、可生物降解合成聚合物物理包埋涂覆、羟基磷灰石和二氧化钛纳米管储库式承载等。虽然生长因子应用于钛合金表面促进骨整合与修复已有大量的研究，但在活性保持和持续投递等方面还难以满足临床需求。最近，卢云峰课题组以纳米凝胶技术成功投递生长因子，该技术通过自由基反应，以高分子单分子膜包覆蛋白，形成粒径40-80nm的微粒，可有效提高蛋白的稳定性。从而解决了生长因子稳定性的问题。但是在对钛合金材料改性时，由于钛合金本身的惰性和生长因子Nanogel的大尺寸造成的空间位阻效应，很难实现生长因子Nanogel在钛合金表面的直接固定化。因此必须选择合适的媒介来实现这种固定化。
本发明基于将生长因子纳米凝胶通过小分子HOOC-PEG-NHS连接到多巴胺分子上，然后利用多巴胺在碱性环境中的自聚合反应，实现生长因子纳米凝胶与钛合金表面的偶联。
发明内容
本发明的目的是将具有高稳定性的生长因子纳米凝胶通过pH诱导的多巴胺自聚合反应偶联到钛合金表面，实现植入钛合金部位骨组织的快速修复。
本发明的原理是利用HOOC-(PEG)4-NHS的NHS端与多巴胺的氨基反应，COOH端通过EDC、NHS活化与生长因子纳米凝胶的氨基反应，将多巴胺与生长因子纳米凝胶连接，然后利用pH诱导的多巴胺自聚合反应将生长因子纳米凝胶偶联到钛合金的表面上。
本发明的制备方法如下：
钛合金表面生长因子-纳米凝胶功能化修饰方法，以含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为间隔壁，先通过NHS与多巴胺的反应，再将羧基活化，并与生长因子-纳米凝胶表面的氨基反应，形成含多巴胺的生长因子-纳米凝胶，通过多巴胺在钛合金表面的自聚反应将生长因子-纳米凝胶偶联于钛合金表面。
所述的生长因子包括：骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）。
所述的含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为HOOC-(PEG)n-NHS，其中n=2～700。
所述的多巴胺在钛合金表面的自聚反应是pH诱导的多巴胺的自聚反应。
构建权生长因子-纳米凝胶功能化修饰钛合金表面的方法，步骤如下：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1-4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1-6h；按照摩尔比1:1-1:10加入HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应2-24h；
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析；然后加入EDC和NHS活化15min-60min，加入2-巯基乙醇终止反应；将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净；然后按照摩尔比0.5:1-5:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应2-6h；所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净；用NaOH溶液调节pH到7.0-8.5；
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1-6mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性；将所得的Ti片真空烘干；
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育1-24h。
本发明的优点是利用简单的一锅反应将生长因子纳米凝胶偶联到钛合金表面，反应操作简单，反应条件温和，对于生长因子具有良好的活性保持。
说明书附图
钛合金表面生长因子纳米凝胶功能化修饰示意图
具体实施方式
下面通过例子对本发明进行进一步的阐述。
实施例1：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1h。按照摩尔比1:1加入一定量的HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应2-24h。
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析。然后加入EDC和NHS活化15minmin，加入2-巯基乙醇终止反应。将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净。然后按照摩尔比0.5:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应2h。所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净。用NaOH溶液调节pH到7.0。
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性。将所得的Ti片真空烘干。
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育1h。
通过ELISA试剂盒测定固定在钛片上的生长因子的量为0.2ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持52%的相对活性。
实施例2：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为2mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理2h。按照摩尔比1:7加入一定量的HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应8h。
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析。然后加入EDC和NHS活化40min，加入2-巯基乙醇终止反应。将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净。然后按照摩尔比2:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应4h。所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净。用NaOH溶液调节pH到8.0。
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和4mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性。将所得的Ti片真空烘干。
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育12h。
通过ELISA试剂盒测定固定在钛片上的生长因子的量为6.8ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持48%的相对活性。
实施例3：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理6h。按照摩尔比1:10加入一定量的HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应24h。
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析。然后加入EDC和NHS活化60min，加入2-巯基乙醇终止反应。将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净。然后按照摩尔比5:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应6h。所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净。用NaOH溶液调节pH到8.5。
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和6mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性。将所得的Ti片真空烘干。
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育24h。
通过ELISA试剂盒测定固定在钛片上的生长因子的量为24ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持60%的相对活性。
实施例4：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为2mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1-6h。按照摩尔比1:3加入一定量的HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应24h。
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析。然后加入EDC和NHS活化60min，加入2-巯基乙醇终止反应。将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净。然后按照摩尔比5:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应6h。所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净。用NaOH溶液调节pH到8.5。
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和6mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性。将所得的Ti片真空烘干。
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育24h。
通过ELISA试剂盒测定固定在钛片上的生长因子的量为18.1ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持57%的相对活性。
实施例5：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理5h。按照摩尔比1:4加入一定量的HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应2-24h。
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析。然后加入EDC和NHS活化45min，加入2-巯基乙醇终止反应。将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净。然后按照摩尔比1:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应6h。所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净。用NaOH溶液调节pH到8.2。
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和6mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性。将所得的Ti片真空烘干。
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育16h。
通过ELISA试剂盒测定固定在钛片上的生长因子的量为13.5ug。钛片经伽马射线消毒后，生长因子仍保持52%的相对活性。

Claims (5)

1.钛合金表面生长因子-纳米凝胶功能化修饰方法，其特征是：以含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为间隔壁，先通过NHS与多巴胺的反应，再将羧基活化，并与生长因子-纳米凝胶表面的氨基反应，形成含多巴胺的生长因子-纳米凝胶，通过多巴胺在钛合金表面的自聚反应将生长因子-纳米凝胶偶联于钛合金表面。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的生长因子包括：骨形态发生蛋白（BMP）、转化生长因子（TGF）、血管内皮生长因子（VEGF）、血小板衍生生长因子（PDGF）和成纤维细胞生长因子（FGF）。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的含羧基和碳二亚胺端基的短链分子为HOOC-(PEG)n-NHS，其中n=2～700。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是所述的多巴胺在钛合金表面的自聚反应是pH诱导的多巴胺的自聚反应。
5.构建权利要求1的生长因子-纳米凝胶功能化修饰钛合金表面的方法，其特征是步骤如下：
a．将多巴胺溶解于20mM pH=7.4的PBS溶液中配成浓度为1-4mg/ml的多巴胺溶液，将上述溶液中冲入氮气流处理1-6h；按照摩尔比1:1-1:10加入HOOC-(PEG)4-NHS，搅拌反应2-24h；
b．将上述反应后的溶液在20mM pH=6.0MES缓冲液中透析；然后加入EDC和NHS活化15min-60min，加入2-巯基乙醇终止反应；将上述反应液在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析，将小分子物质透析干净；然后按照摩尔比0.5:1-5:1的比例加入生长因子纳米凝胶室温反应2-6h；所得的反应物在20mM pH=7.4的PBS溶液中透析将小分子透析干净；用NaOH溶液调节pH到7.0-8.5；
c．将Ti片表面进行抛光处理，然后分别在正己烷和1-6mol/L NaOH中洗涤干净，然后用超纯水冲洗至洗脱液为中性；将所得的Ti片真空烘干；
d．将处理好的Ti片加入到b中所得到的的终溶液中，摇床温育1-24h。
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