CN114958731A - 一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型及制备方法与应用 - Google Patents

一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型及制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型及制备方法与应用，属于生物材料的组织工程技术领域。所述工程化脂肪组织模型由间充质干细胞接种到包被了基质胶的纳米孔丝素蛋白支架材料上，进行间充质干细胞的成脂诱导分化而得。本发明以脐带间充质干细胞作为种子细胞接种在基质胶包被的纳米孔丝素蛋白支架上，经成脂诱导后构建的脂肪组织模型不但可推进软组织修复治疗，且有望为脂肪组织病理生理研究提供新的体外研究模型。

Description

一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型及制备 方法与应用
技术领域
本发明属于生物材料的组织工程技术领域，具体涉及一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型及制备方法与应用。
背景技术
损伤、肿瘤切除、先天性异常或创伤等引起的软组织缺损需要通过手术进行修复重建。这些缺损常因脂肪组织的缺失而导致正常组织的形态改变和功能障碍。目前软组织修复的方法包括游离脂肪移植，皮瓣移植，假体植入等。然而这些方法有很多缺点，尚无一种理想的支架材料可以满足所有的临床需求。游离脂肪移植后，由于缺乏血管支持系统，移植物易被吸收。皮瓣移植来源受限，且存在皮瓣坏死，血肿形成等问题。而假体植入往往容易导致异物反应，感染等的发生。脂肪组织工程技术的发展有望为患者提供新的治疗手段。脂肪组织工程是通过将细胞与支架生物材料结合起来，作为组织再生的模板，引导新组织的生长，从而再生受损的组织，因此选择合适的种子细胞和支架材料对脂肪组织的再生十分重要。
骨髓间充质干细胞和脂肪干细胞，它们的取材均有创且扩增能力受年龄影响，脐带间充质干细胞取材方便，原始，体外扩增效果好，具有良好的成骨、成软骨、成脂肪等多种分化潜能和广泛的应用前景。将脐带间充质干细胞向成脂细胞方向定向诱导，为脂肪组织工程的研究提供重要的理论指导，进而为创伤及肿瘤切除后的软组织修复提供新思路。
选择合适的支架材料也很重要，前人研究已成功应用多种支架材料进行成脂诱导分化，但目前可促进成脂分化的支架材料多为人工合成材料，难以形成理想的材料-细胞界面，影响种子细胞在材料上的黏附、增殖、分化，同时其降解产物可能有毒进而造成局部炎症或pH值改变，导致植入后愈合延迟及各种并发症的产生；天然支架更利于细胞生长，但材料可塑性差且机械性能低。因此仍需开发合适的天然材料支架用于高效形成稳定的脂肪细胞，这将有利于获得更好的工程化脂肪组织，为软组织修复提供新的思路，为体外脂肪组织研究建立新模型。
发明内容
为了解决现有技术存在的问题，本发明提供了一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织制备方法，依靠一种能够理想维持人脐带间充质干细胞生长活性，并显著提高人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化表型与功能的基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架材料构建体外脂肪组织模型，这种脂肪组织模型体外维持时间长，且脂肪形成情况好，可用于体外脂肪组织病理生理研究，同时可以用于体内移植治疗。
本发明提供了一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型，由间充质干细胞接种到包被了基质胶的纳米孔丝素蛋白支架材料上，进行间充质干细胞的成脂诱导分化而得。
进一步地，上述技术方案中，所述纳米孔丝素蛋白支架富集纳米孔，所述纳米孔的孔径为50-300nm；
所述纳米孔丝素蛋白支架具有良好的渗透性和较高的机械性能。
进一步地，上述技术方案中，所述良好的渗透性为钙黄绿素透过率96.56％±3.59，葡聚糖透过率88.57％±5.36；所述较高的机械性能为压缩模量：34±1.1kPa。
进一步地，上述技术方案中，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
本发明还提供了一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型的制备方法，包括下述步骤：
(1)制备纳米孔丝素蛋白支架；
(2)纳米孔丝素蛋白支架包被基质胶；
(3)将间充质干细胞接种在包被了基质胶的纳米孔丝素蛋白支架上；
(4)成脂诱导培养，即得到工程化脂肪组织模型。
所述纳米孔丝素蛋白支架包被基质胶的方法包括：将纳米孔丝素蛋白支架置于基质胶溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18小时即完成包被。所述基质胶溶液由基质胶和DMEM-F12培养基以1:80体积比例混合配置。
进一步地，上述技术方案中，所述纳米孔丝素蛋白支架的制备方法，包括如下步骤：
1)以蚕茧为原料，于碳酸钠溶液中萃取，溴化锂溶液中溶解，透析和灭菌后，制备丝素蛋白水溶液；
2)将丝蛋白水溶液真空干燥、聚乙二醇400(PEG 400)退火处理后，冷冻干燥，即得。
具体地，所述纳米孔丝素蛋白支架的制备方法包括：将蚕茧剪碎于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂溶液中，蒸馏水透析并离心，超纯水稀释后高压灭菌获得丝素蛋白(ASF)溶液。ASF溶液真空干燥，PEG 400退火处理，冷冻干燥获得纳米孔丝素蛋白支架。
所述冷冻干燥为在-20℃下预冷冻12小时后，冻干48小时。
进一步地，上述技术方案中，所述蚕茧为桑蚕茧、柞蚕茧或蓖麻蚕茧中的一种。
进一步地，上述技术方案中，在将间充质干细胞接种到纳米孔丝素蛋白支架前，所述支架纳米孔丝素蛋白需经灭菌处理；所述灭菌处理包括高温高压灭菌或乙醇灭菌。
进一步地，上述技术方案中，接种间充质干细胞后的纳米孔丝素蛋白支架凝胶化1～1.5小时，然后进行成脂诱导培养。
进一步地，上述技术方案中，所述成脂诱导培养的培养基包括A液和B液，所述A液由DMEM-F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗、100μM吲哚美辛、50μM磷酸二酯酶抑制剂、1μM地塞米松、10μg/mL胰岛素混合而成；所述B液由DMEM-F12培养基、10％胎牛血清、1％双抗、10μg/mL胰岛素混合而成。所述成脂诱导培养的方法为：A液诱导3～4天换B液诱导1～2天，如此为一个循环，进行3～5个循环。
本发明还提供了所述的工程化脂肪组织模型或者所述的制备方法制备的工程化脂肪组织模型在体外脂肪组织病理生理研究或体内移植治疗中的应用。
本发明同现有技术相比，具有如下优点：
以丝素蛋白为原料制得的纳米孔丝素蛋白支架生物相容性好、具有良好的渗透性、机械强度高、比其他天然生物材料降解速度慢，独特的纳米孔结构赋予其良好的渗透性和物质交换能力，可大大提高支架内外的物质交换水平，有利于人脐带间充质干细胞在体外培养过程中维持其活性及多能性。基质胶包被可使细胞更易粘附于支架表面，所包含的细胞外基质成分也利于细胞在支架内生长，基质胶包被的纳米孔丝素蛋白支架不但能够为人脐带间充质干细胞提供三维生长空间，而且其具有生物相容性、材料可塑性和支持人脐带间充质干细胞生长的特点。脐带间充质干细胞取材方便，原始，体外扩增效果好，具有良好的成脂肪分化潜能，是用于体外成脂诱导分化的理想细胞。以脐带间充质干细胞作为种子细胞接种在基质胶包被的纳米孔丝素蛋白支架上，经成脂诱导后构建的脂肪组织模型不但可推进软组织修复治疗，且有望为脂肪组织病理生理研究提供新的体外研究模型。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现技术描述中所需要的附图作简单地介绍，显而易见，下面描述中的附图仅仅是本发明实施例的一部分，而不是全部附图。对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。
图1为利用活/死细胞双染色试剂盒显示人脐带间充质干细胞在基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架上的生长形态和细胞活性。其中，图A为未加成脂诱导培养基的3D-C组，图B为加入成脂诱导培养基的3D-I组；图A、B中标记D的为死细胞，图中未做标记的其余细胞为活细胞。
图2为所述基于纳米孔丝素蛋白支架的脂肪组织模型的油红O和苏木素染色。其中，图A为油红O染色和苏木素鉴定，未加成脂诱导培养基的3D-C组；图B为油红O染色和苏木素鉴定，加入成脂诱导培养基的3D-I组；图中标记D的为被染成红色的脂滴。
图3为扫描电镜(SEM)检测显示人脐带间充质干细胞在基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架上的生长形貌及特征。其中，图A为纳米孔丝素蛋白支架的扫描电子显微镜图，图B为扫描电子显微镜鉴定，加入成脂诱导培养基的3D-I组。
图4为透射电镜(TEM)检测显示人脐带间充质干细胞在基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架内的生长情况。
图5为所述支架材料诱导分化构建脂肪组织模型的脂滴形成情况，蓝色荧光是用DIPY染的细胞核，绿色荧光是用BOPIPY染的脂滴。其中，图A为BODIY染色鉴定，未加成脂诱导培养基的3D-C组，图B为BODIY染色鉴定，加入成脂诱导培养基的3D-I组。
图6为利用qRT-PCR方法检测本发明所述支架材料对人脐带间充质干细胞成脂特异性基因表达水平的影响。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
本发明中所用到的生物材料或化学试剂，如无特殊说明，均由常规方法制备获得，或商业途径获得。
下面将结合实例附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
实施例1纳米孔丝素蛋白支架的制备
将桑蚕茧剪碎于0.02M碳酸钠溶液中进行萃取并溶解于9.3M溴化锂(Sigma)溶液中，蒸馏水透析并离心，超纯水稀释后高压灭菌获得高压灭菌丝素蛋白(ASF)溶液。ASF溶液真空干燥，聚乙二醇400(PEG400)退火处理，冷冻干燥(Virtis Genesis 25-LE)获得纳米孔丝素蛋白支架后切片使用。本发明所述的纳米孔丝素蛋白支架的制备方法在下述文献中有所记载Jian Liu,Huijuan Chen,Yongfeng Wang,Gang Li,Zhaozhu Zheng,DavidL.Kaplan,Xiuli Wang and Xiaoqin Wang.Flexible Water-Absorbing Silk-FibroinBiomaterial Sponges with Unique Pore Structure for Tissue Engineering.ACSBiomater Sci Eng.2020Mar 9；6(3):1641-1649.
纳米孔丝素蛋白支架在接种细胞前需经高压蒸汽灭菌处理。
实施例2基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架制备
将纳米孔丝素蛋白支架置于基质胶溶液中，在2-8℃条件下浸泡6-18小时即完成包被。基质胶溶液由基质胶和DMEM-F12培养基以1:80体积比例混合配置。制备获得基质胶包被的纳米孔丝素蛋白支架。
实施例3人脐带间充质干细胞的体外培养
人脐带间充质干细胞培养于维持培养基(DMEM-F12+10％FBS+1％Pen/Strep)中，细胞生长至近80～90％融合度时进行1:2常规传代培养，培养于37℃，5％CO2细胞培养箱内。
实施例4人脐带间充质干细胞的体外成脂诱导分化
以实施例3获得人脐带间充质干细胞为种子细胞，以实施例2获得的基质胶包被的纳米孔丝素蛋白支架，作为人脐带间充质干细胞体外成脂诱导分化的培养载体，将消化后获得的5×105～1×106个人脐带间充质干细胞接种到支架上，并将支架置于成脂诱导分化微环境中进行培养。
所述的将细胞接种到基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架的具体操作如下：取1.2×107/mL对数生长至第3～5代的细胞40μL，多点接种到基质胶包被的纳米孔丝蛋白支架上；并置于37℃、5％CO2条件下凝胶化1～1.5小时，然后将支架置于成脂诱导分化微环境中进行培养。
所述的将基质胶包被纳米孔丝素蛋白支架置于成脂诱导分化微环境中进行培养的具体操作步骤如下：凝胶化后的支架按照2个支架/孔的密度放置到6孔细胞培养板中，加入维持培养基，并将多孔细胞培养板置于细胞培养箱中，稳定一天。然后加入成脂诱导培养基进行细胞培养，A液诱导2～4天换B液诱导1～2天，如此为一个循环，3～5个循环后收获样品。即得到基于人脐带间充质干细胞的三维成脂诱导分化模型。
实施例5
以同批次人脐带间充质干细胞为种子细胞，以2D非诱导组为对照组1(2D-C)，另设2D诱导组为对照组2(2D-I)及纳米孔丝素蛋白非诱导组为对照组3(3D-C)，以纳米孔丝蛋白诱导组为实验组(3D-I)。
2D非诱导组制备及培养方法：将对数生长的第3～5代细胞接种于6孔细胞培养板中每个孔约1×106个细胞，以维持培养基培养。
2D诱导组制备及培养方法：
将对数生长的第3～5代细胞接种于6孔细胞培养板中每个孔约1×106个细胞，然后向多孔细胞培养板的每个孔中加入成脂诱导培养基进行细胞培养。
纳米孔丝素蛋白非诱导组制备及培养方法：
取1.2×107/mL对数生长至第3～5代的细胞40μL，多点接种到基质胶包被的纳米孔丝蛋白支架上；并置于37℃、5％CO2条件下凝胶化1～1.5小时，凝胶化后的支架按照2个支架/孔的密度放置到6孔细胞培养板中，加入维持培养基进行培养。
实施例6人脐带间充质干细胞三维成脂诱导分化模型的检测
(1)脐带间充质干细胞生长形态及活性检测：为了更好的观察三维成脂诱导分化体系内细胞生长形态及活性检测，细胞培养20天后，采用Calcein-AM/EthD-1染色试剂盒(Invitrogen)，37℃孵育2小时，其余操作按说明书进行。染色后于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。
人脐带间充质干细胞生长形态及活性检测结果：如附图1(下同)所示，在纳米孔丝素蛋白支架上人脐带间充质干细胞生长状态良好，细胞活性染色显示大部分细胞均为绿色荧光，仅有少量细胞死亡，显示红色荧光，说明实验组和对照组细胞活性理想。图A、B中标记D的为死细胞，图中未做标记的其余细胞为活细胞。其中A为3D-C组(scale bars＝100μm)，B为3D-I组(scale bars＝250μm)(不经特殊强调下同)。
(2)油红O和苏木素染色：样品收集后经PBS冲洗，蔗糖脱水后OCT包埋，-80℃冷冻过夜后切片、染色、正视光学显微镜下观察，拍照，细胞在支架及孔隙边缘细胞较密集。人脐带间充质干细胞呈梭形伸展，生长状态良好。
油红O和苏木素染色(图2)结果进一步证明人脐带间充质干细胞的生长形态特征。可见：人脐带间充质干细胞在支架内部分布均匀，在支架及孔隙边缘细胞较密集。人脐带间充质干细胞呈梭形伸展，生长状态良好，未加成脂诱导培养基的3D-C组(A图scale bars＝200μm)没有红色脂滴的形成，加入成脂诱导培养基的3D-I组(B图scale bars＝200μm)细胞核周围可见大量被油红O染液染成红色，标记为D的脂滴。
(3)扫描电镜观察：所收集样品经PBS充分清洗后，2.5％戊二醛溶液前固定4-6小时，PBS冲洗后，2％锇酸后固定2小时，再次PBS充分清洗后，采用冷冻干燥法进行干燥。干燥后样品经喷金15分钟后，于扫描电镜下观察拍照。
如图3所示，A图(scale bars＝500nm)为支架的扫描电镜图，可见其内部为纳米多孔结构；B图(scale bars＝10μm)可见人脐带间充质干细胞紧密生长于支架表面及三维孔隙，分泌大量的细胞外基质，同时，可见大量脂滴形成。彼此间相互连接，形成类组织化的表观形貌特征。
(4)透射电镜观察：样品收集后2.5％冷戊二醛固定2小时，1％锇酸固定2小时冲洗后乙醇梯度脱水，环氧树脂做包埋剂与环氧丙烷浸透、包埋后固化(37℃12小时后移入45℃24小时再60℃24小时)制备超薄切片，重金属染色后于透射电镜下拍照。
如图4所示，透射电镜结果显示人脐带间充质干细胞胞质内存在大量脂滴及内质网等细胞器，表明成脂诱导结果成功。
(5)BODIPY染色：样本收集后经PBS冲洗，多聚甲醛固定1.5小时，PBS冲洗后加入Trition X-100孵育1小时，再次PBS冲洗，用BODPIY(1.5小时)和DAPI(1小时)染色液分别进行避光染色，于激光共聚焦显微镜下观察、拍照。
如图5所示：BODIPY染色结果显示人脐带间充质干细胞成脂情况良好，未加成脂诱导培养基的3D-C组(A图scale bars＝25μm)有极少量绿色荧光，表明仅有极少的细胞发生成脂分化；加入成脂诱导培养基的3D-I组(B图scale bars＝25μm)有大量LIPID阳性区域，表明成脂分化效果良好，细胞内有大量脂滴形成。
(6)定量RT-PCR测定成脂特异性基因表达：成脂诱导分化21天后，直接采用TRIzol裂解细胞，加入氯仿震荡混匀4℃放置3-5分钟后4℃，12000rpm离心15分钟，吸取上层水相加入异丙醇颠倒混匀放置10分钟后4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，加入1mL预冷的75％乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀，4℃，12000rpm离心15分钟，弃上清，室温干燥后加入DEPC水溶解RNA使用Nanodrop 2000测RNA浓度和纯度。按照abm转录试剂盒合成cDNA。采用PrimeScriptTM RT试剂盒和SYBR Premix Ex TaqTM II试剂盒(TaKaRa)进行定量RT-PCR扩增。依据各目的基因的Ct值及内参基因的Ct值进行定量分析(ABI smart I)，确定各目的基因的表达水平。
如图6所示：adipsin为成脂诱导相关的两个基因。2DC为2D非诱导对照组，2DI为2D诱导组对照组，3DC为纳米孔丝素蛋白非诱导对照组，3DI为纳米孔丝蛋白诱导实验组。可见相对于对照组，纳米孔丝蛋白诱导实验组脂肪相关基因表达量更高，脂肪形成情况更好。

Claims (10)

1.一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型，其特征在于，由间充质干细胞接种到包被了基质胶的纳米孔丝素蛋白支架材料上，进行间充质干细胞的成脂诱导分化而得。
2.根据权利要求1所述的工程化脂肪组织模型，其特征在于，所述纳米孔丝素蛋白支架富集纳米孔，所述纳米孔的孔径为50-300nm；
所述纳米孔丝素蛋白支架具有良好的渗透性和较高的机械性能。
3.根据权利要求2所述的工程化脂肪组织模型，其特征在于，所述良好的渗透性为钙黄绿素透过率96.56％±3.59，葡聚糖透过率88.57％±5.36；所述较高的机械性能为压缩模量：34±1.1kPa。
4.根据权利要求1所述的工程化脂肪组织模型，其特征在于，所述间充质干细胞为脐带间充质干细胞。
5.一种基于纳米孔丝素蛋白支架的工程化脂肪组织模型的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：
(1)制备纳米孔丝素蛋白支架；
(2)纳米孔丝素蛋白支架包被基质胶；
(3)将间充质干细胞接种在包被了基质胶的纳米孔丝素蛋白支架上；
(4)成脂诱导培养，即得到工程化脂肪组织模型。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述纳米孔丝素蛋白支架的制备方法，包括如下步骤：
1)以蚕茧为原料，于碳酸钠溶液中萃取，溴化锂溶液中溶解，透析和灭菌后，制备丝素蛋白水溶液；
2)将丝蛋白水溶液真空干燥、聚乙二醇400退火处理后，冷冻干燥，即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述蚕茧为桑蚕茧、柞蚕茧或蓖麻蚕茧中的一种。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，在将间充质干细胞接种到纳米孔丝素蛋白支架前，所述支架纳米孔丝素蛋白需经灭菌处理；所述灭菌处理包括高温高压灭菌或乙醇灭菌。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，接种间充质干细胞后的纳米孔丝素蛋白支架凝胶化1～1.5小时，然后进行成脂诱导培养。
10.权利要求1-4中任一项所述的工程化脂肪组织模型或者权利要求5-9中任一项所述的制备方法制备的工程化脂肪组织模型的应用，其特征在于，在体外脂肪组织病理生理研究或体内移植治疗中的应用。
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