CN109821072A - 一种利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架 - Google Patents

一种利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架 Download PDF

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乔之光
唐佳昕
戴尅戎
孙彬彬
王友
连梅菲
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Abstract

发明属于医疗技术领域，尤其为利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，包括以下步骤：S1：种子细胞的培养；S2：肌腱支架的制备；S3：细胞的种植；本发明通过结合熔融静电纺丝三维打印和同轴纺丝技术，结合了两者的优点，熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，易于控制纤维直径与打印路径，而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，通过不同的路径参数，直接获得肌腱‑软骨‑骨三相支架，该制作方法简单方便，同时携带大量细胞因子进行缓释，可促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。

Description

一种利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相 支架
技术领域
本发明属于医疗技术领域，具体涉及利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架。
背景技术
腱骨联合损伤是一种常见的运动损伤之一，也是临床软组织损伤中的常见类型，其发病率有逐年上升趋势，腱骨联合的结构包括骨、钙化软骨、软骨及肌腱四层结构，由于其复杂的多层结构，各层组织不同，因此腱骨联合损伤的修复较同种组织之间的损伤修复更加缓慢和困难，特殊的组织梯度结构是腱骨联合损伤修复的难点，如何有效提高其梯度结构的修复及整合，是腱骨联合损伤修复成功的关键；
对于腱骨联合缺损，目前的治疗方法存在着一定的局限性或不足，组织工程技术为临床肌腱修复提供了一种理想、符合生理特点的方法，用组织工程技术修复缺损，即在体外培养少量的种子细胞，在扩增后和生物可降解支架结合成复合物，将其植入缺损部位后细胞增殖、分化、分泌基质，修复损伤组织，同时生物材料逐渐降解，最终达到生物学意义上的完全修复，该复合物在组织工程中起到支撑作用，同时为细胞提供寄宿、成长、分化和增殖的场所，支架与种子细胞共同对受损组织的再生进行引导和对再生组织的结构进行控制，是临床治疗的关键。
发明内容
为解决上述背景技术中提出的问题，本发明提供了利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，该方法结合熔融静电纺丝三维打印和同轴纺丝技术，结合了两者的优点，熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，易于控制纤维直径与打印路径；而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，通过不同的三维打印路径参数，打印获得肌腱-软骨-骨三相支架，熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，该方法所获得的支架具有骨-软骨-肌腱的组织梯度结构，同时携带大量的细胞因子，可进行缓释，促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。
本发明提供如下技术方案：利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
优选的，所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
优选的，所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
优选的，所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
优选的，所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
优选的，所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
优选的，所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
优选的，所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过结合熔融静电纺丝三维打印和同轴纺丝技术，结合了两者的优点，熔融静电纺丝三维打印技术可以极大地提高打印精度，易于控制纤维直径与打印路径，而同轴纺丝技术则可使我们获得内层含有细胞因子的双层纤维，通过不同的路径参数，直接获得肌腱-软骨-骨三相支架，该制作方法简单方便，同时携带大量细胞因子进行缓释，可促进细胞增殖修复，利于腱骨联合修复及正常功能恢复。
附图说明
图1为本发明的MTT法检测结果示意图；
图2为本发明的qRT-PCR检测结果示意图；
图3为本发明力学压缩测试结果示意图。
具体实施方式
下面将结合附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
本发明提供以下技术方案：利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
具体的，所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
具体的，所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
具体的，所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
具体的，所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区。
实施例1
利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
具体的，所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
具体的，所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
具体的，所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
具体的，所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区，分别与三相支架各区作对比，分别培养1，3，5，7天后，利用MTT法检测肌腱支架中的肌腱细胞活，结果如图1所示，熔融静电纺丝三维打印结合同轴纺丝技术得到的支架上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。
实施例2
利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
具体的，所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
具体的，所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
具体的，所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
具体的，所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区，进行qRT-PCR检测，以单纯聚己内酯三维打印得到的支架，分别种植肌腱干细胞、软骨细胞、骨髓干细胞为对照组作对比，分别培养7天后，进行qRT-PCR检测，监测结果如图2所示，显示实验组肌腱区肌腱相关产物(SCX、TNMD)、软骨区软骨相关产物(SOX9、Aggrecan)、骨区骨相关产物(OCN、BMP4)表达明显较多。
实施例3
利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
具体的，所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
具体的，所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
具体的，所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
具体的，所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
具体的，所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区，将所得到的三相一体支架进行拆分，分为肌腱区支架、软骨区支架、骨区支架，肌腱区进行力学拉伸测试，软骨区、骨区放置于万能测试机上进行力学压缩测试，测得结果如图3所示，显示肌腱-软骨-骨三相一体支架力学性能较好。
最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：包括以下步骤：
S1：种子细胞的培养；
S2：肌腱支架的制备；
S3：细胞的种植。
2.根据权利要求1所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S1步骤种子细胞的培养的操作方法为：肌腱干细胞以含10％胎牛血清的DMEM培养基培养于孵箱中，软骨细胞以含10％胎牛血清的F12培养基培养于孵箱中，骨髓干细胞以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于孵箱中。
3.根据权利要求2所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S1步骤中孵箱中的温度为37℃，其中孵箱内有5％CO2。
4.根据权利要求1所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S2步骤肌腱支架的制备包括以下步骤：
S21、模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，为多层长方形状，肌腱区、软骨区、骨区路径间隙不同；
S22、材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3，及生物高分子材料B1、B2、B3(聚乳酸，聚己内酯，聚乳酸-羟基乙酸共聚物，聚乳酸-己内酯共聚物，聚对二氧环己酮中的一种或几种构成)，生物高分子材料B1、B2、B3分别与适量BMP2、CTGF、TGFβ1细胞因子混合，得到B1’(B1+BMP2)、B2’(B2+TGFβ1)、B3’(B3+CTGF)；分别用于制备骨区、软骨区、肌腱区；
S23、设备的准备：调校熔融静电纺丝三维打印设备的工艺参数，将步骤二的生物高分子材料A1和B1’分别置入两外接料筒，使生物高分子材料A1进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒外层，细胞因子生物高分子材料B1混合物进入熔融静电纺丝三维打印设备的料筒内层，启动设备进行熔融静电纺丝三维打印，由骨区开始打印，当骨区制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2’，对软骨区进行打印，完毕后使用A3、B3’对肌腱区域进行打印，获得肌腱-软骨-骨三相一体支架。
5.根据权利要求4所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S22步骤中生物高分子材料A1、A2、A3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
6.根据权利要求4所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S22步骤中生物高分子材料B1、B2、B3由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物和聚对二氧环己酮中的一种或几种构成。
7.根据权利要求4所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S23步骤中三维打印设备的参数为：打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，熔融纺丝负高压模块电压为-2～-10kV，打印结构由打印路径控制，打印路径为0/90°、0/60°和0/60/120°。
8.根据权利要求1所述的利用熔融电纺三维打印与同轴纺丝制备腱骨联合三相支架，其特征在于：所述S3步骤细胞的种植的操作方法为：取适量肌腱干细胞种植于肌腱支架区，取适量软骨细胞种植于软骨支架区，取适量骨髓干细胞种植于骨支架区。
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