CN105477682B - 一种组织工程半月板支架及制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种组织工程半月板支架及制备方法，其中方法包括以下步骤：将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120‑140℃，并在600‑1000kPa的气压下准备打印；将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6‑0.75mm/s，纤维直径设置为300‑320μm，纤维间隔设置为200‑300μm，打印出组织工程半月板支架；使用钴60进行辐照灭菌处理。本发明通过熔融沉积成型的方法打印出具有合适孔隙结构、合适纤维直径、合适生物力学强度的组织工程半月板支架，有利于提高接种细胞和植入区域自体长入细胞的存活率、增殖率，并能增加成纤维软骨诱导分化率，使新生半月板组织具有良好的功能。

Description

一种组织工程半月板支架及制备方法
技术领域
本发明涉及生物材料与组织工程技术领域，更具体地说，涉及一种组织工程半月板支架及制备方法。
背景技术
半月板由纤维软骨组成，内外各一，位于膝关节的胫股关节间隙，是膝关节的重要组成部分。其具有吸收震荡、传递负荷、营养关节软骨及维持关节稳定等重要功能。半月板严重损伤或切除后，会加快膝关节骨性关节炎发展。尽管半月板切除术后短期疗效好、功能恢复快，但再生半月板不具有正常半月板的功能，远期将加重关节软骨退变。组织工程技术的进展为半月板修复和替代提供了一种新的治疗模式。组织工程半月板(TEM)构建需要种子细胞复合植入支架材料，在特定生长因子或应力刺激下完成。
TEM的支架材料包括人工合成和天然材料。人工合成材料包括聚己内酯(PCL)、聚乳酸(PLA)、碳纤维、聚乙醇酸(PGA)、聚乳酸-羟基乙酸共聚物(PLGA)、涤纶、特富龙、聚氨酯等。天然材料包括胶原、小肠粘膜下组织、脱钙骨、骨膜、软骨膜等。
理想的支架材料具有以下性能：1、良好的生物相容性和生物可降解性；2、足够的力学强度；3、高孔隙率；4、高表面积；5、表面利于细胞的黏附增殖和分化；6、易于消毒及植入；7、可加工成各种形状和结构，易于重复操作。人工合成材料来源广泛，可塑性强，具有良好的生物相容性和生物学活性，且能满足TEM的生物力学强度。其中，聚己内酯(PCL)因其良好的生物力学、生物活性及材料加工特性已被广泛应用于组织工程构建软骨、骨等方面。天然材料有良好的生物相容性，且含有生物活性成分，能够促进细胞增殖和基质分泌，但大多数在生物学强度及孔隙率和形态上难以满足完整TEM构建的要求。
由于半月板组织结构的异构性，人工构建的半月板支架需要其微观结构能够仿造正常半月板结构，显然传统制造工艺(盐析、冻干、电纺丝等)不能满足此要求。熔融沉积成型技术(FDM)是3D打印技术的一种，是将热熔性材料加热熔化，通过喷头挤喷出来，随即与前一个层面熔结在一起，逐层沉积直至形成三维支架。其具有良好的成型、控制支架的孔径及孔隙率等特性，促进种子细胞发挥良好的生物学性能的同时兼顾生物力学的特性，适用于组织工程半月板的构建。目前，尽管文献报道有将FDM打印组织工程骨修复方面的应用，但半月板特殊的结构和尺寸特点决定了其生物力学功能与其他部位不同，例如骨修复支架要求具有较强的抗压能力，而半月板支架要求具有更大的抗拉伸强度和弹性模量。现有FDM打印的组织工程支架形态往往不能满足半月板支架的性能要求。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于，针对现有FDM打印组织工程支架的方法不能满足半月板支架性能要求的问题，提供一种基于FDM的组织工程半月板支架及制备方法。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：构造一种组织工程半月板支架的制备方法，包括以下步骤：
S1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印；
S2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为300-320μm，纤维间隔设置为200-300μm，打印出组织工程半月板支架；
S3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
在根据本发明所述的组织工程半月板支架的制备方法中，所述组织工程半月板支架的外形为环形，且其环形外径为9.5-10.5mm，环形内径为3.5-4.5mm，厚度1.4-1.6mm。
在根据本发明所述的组织工程半月板支架的制备方法中，所述组织工程半月板支架的环形外径为10mm，环形内径为4mm，厚度1.5mm。
在根据本发明所述的组织工程半月板支架的制备方法中，所述步骤S2中设置的纤维直径为300μm，纤维间隔为200μm。
在根据本发明所述的组织工程半月板支架的制备方法中，所述制备方法还包括：S4、将骨髓间充质干细胞细胞接种到所述组织工程半月板支架上复合培养7天。
在根据本发明所述的组织工程半月板支架的制备方法中，所述聚己内酯材料的重均分子量为60000。
本发明还提供了一种组织工程半月板支架，其采用如上所述的组织工程半月板支架的制备方法制得。
本发明还提供了另一种组织工程半月板支架，所述组织工程半月板支架为环形三维结构，由熔融沉积的多层聚己内酯纤维构成，每层聚己内酯纤维的纤维直径为300-320μm，纤维间隔为200-300μm。该组织工程半月板支架的环形外径为9.5-10.5mm，环形内径为3.5-4.5mm，厚度1.4-1.6mm。所述组织工程半月板支架的拉伸弹性模量为40-45Mpa，压缩弹性模量为25-30Mpa。
实施本发明的组织工程半月板支架及制备方法，具有以下有益效果：本发明通过使用熔融沉积成型的方法打印出具有合适可修剪外形、合适孔隙结构、合适纤维直径、合适生物力学强度的组织工程半月板支架，有效地提高了拉伸和压缩弹性模量，使生物力学强度更高，更适于用作部分缺损半月板的修复和完全切除半月板的移植替代，并且其孔隙结构更利于提高接种细胞和植入区域自体长入细胞的存活率、增殖率和向半月板纤维软骨细胞分化的能力，从而最终形成形态、结构、力学性能和功能良好的新生半月板。
附图说明
下面将结合附图及实施例对本发明作进一步说明，附图中：
图1为根据本发明优选实施例的组织工程半月板支架的制备方法的流程图；
图2为根据本发明优选实施例的组织工程半月板支架的结构示意图；
图3为根据本发明优选实施例的组织工程半月板支架的外形示意图；
图4a和4b分别为实验组的组织工程半月板支架的大体观察图及表面电镜图；
图5a为实验组的组织工程半月板支架的细胞复合培养图；图5b和5c分别为实验组和对照组的细胞死活染色结果图；
图6为实验组和对照组的细胞增殖活性检测实验结果图；
图7a和7b分别为实验组和对照组的拉伸弹性模量和压缩弹性模量测试结果图；
图8a为对照组手术后的大体观察图，图8b和8c分别实验组和空白对照组手术后6周的大体观察图；
图9a和9b分别为实验组和空白对照组的半月板覆盖区域(胫骨平台)HE染色结果图；图9c和9d分别为实验组和空白对照组的半月板覆盖区域(胫骨平台)甲苯胺蓝染色结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。
请参阅图1，为根据本发明优选实施例的组织工程半月板支架的制备方法的流程图。如图1所示，该实施例提供的制备方法主要包括以下步骤：
首先，在步骤S1中，将聚己内酯(PCL)材料置入熔融沉积成型(FDM)三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。该熔融沉积成型三维打印机包括高精度气动三维实验平台及尖笔直写喷头。优选地，PCL材料的重均分子量Mw为60000，熔点为60℃。
随后，在步骤S2中，将FDM三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为300-320μm，纤维间隔设置为200-300μm，打印出组织工程半月板支架。请参阅图2，为根据本发明组织工程半月板支架的结构示意图。如图2所示，打印出的组织工程半月板支架由多层PCL纤维熔融沉积而成，通过对其中FDM三维打印机的参数设置，并对支撑结构进行设计，可以使得每层聚己内酯纤维的纤维直径D为300-320μm，纤维间隔S为200-300μm。更优选地，该步骤S2中设置的纤维直径为300μm，纤维间隔为200μm。
最后，在步骤S3中，使用钴60对步骤S2制得的组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理，得到本发明的组织工程半月板支架。
在本发明的更优选实施例中，该步骤还可以包括步骤S4，将骨髓间充质干细胞细胞接种到组织工程半月板支架上复合培养7天。并且在手术时根据半月板修复或移植所需大小取用相应节段进行缝合即可。
本发明制备的组织工程半月板支架选用的PCL为高分子聚合物材料，其制备工艺成熟且广泛，可解决半月板修复材料来源有限的问题。并且PCL无细胞毒性，生物相容性好，其生物降解速率符合组织再生要求。此外，使用FDM打印技术可控制支架的孔径及孔隙率，并且实验证明采用本发明的FDM参数制备的组织工程半月板支架的生物力学强度可满足半月板修复和替代的要求。本发明制得的组织工程半月板支架的拉伸弹性模量为40-45Mpa，压缩弹性模量为25-30Mpa。
进一步地，本发明的组织工程半月板支架可以根据需要设计成各种形状。优选地，在本发明的一些实施例中，可以在步骤S2中将组织工程半月板支架的外形设计成环形，这也是本发明的另一个独特之处。请参阅图3，为根据本发明优选实施例的组织工程半月板支架的外形示意图。如图3所示，该组织工程半月板支架呈环形，其环形外径d1为9.5-10.5mm，环形内径d2为3.5-4.5mm，厚度h为1.4-1.6mm。优选地，其环形外径d1为10mm，环形内径d2为4mm，厚度h为1.5mm。现有的半月板支架通常采用圆形的设计，其细胞粘附和增殖的效果不理想。本发明采用环形支架替代现有的圆形支架，并制备了多个环形的实验样本以及圆形的对比样本，将与体积相对应的等量半月板细胞接种到环形支架和圆形支架上，复合培养7天后，通过CCK8进行检测。CCK8检测结果显示，环形支架的细胞密度明显高于圆形支架，差异有显著性。因此，该实施例中环形的外形设计可增加组织工程半月板支架的表面积，有利于细胞与培养液的物质充分交换，减少支架内部细胞凋亡，从而增加了细胞数量。并且，正常半月板尤其是人体外侧半月板接近于一个完整的环形，而手术当中半月板并非必须完全切除，需要根据半月板损伤的范围和程度决定，但是损伤的情况在术前很难预计。采用本发明的环形支架，就可以在手术过程中根据需要移植和替代部分的大小和形状对环形支架进行修剪后进行移植。被切除部分的支架还可以用于植入前的检测，因此本发明的环形支架可同时满足植入及植入前检测的需要。
本发明还相应提供了一种组织工程半月板支架。该组织工程半月板支架可以通过前述本发明的组织工程半月板支架的制备方法制得，也可以采用其它工艺步骤进行制备。如图2-3中所示，该组织工程半月板支架为外观呈环形的三维支架，由熔融沉积的多层聚己内酯纤维构成，每层聚己内酯纤维的纤维直径为300-320μm，纤维间隔为200-300μm。优选地，纤维直径为300μm，纤维间隔为200μm。该组织工程半月板支架的环形外径d1为9.5-10.5mm，环形内径d2为3.5-4.5mm，厚度h为1.4-1.6mm。优选地，其环形外径d1为10mm，环形内径d2为4mm，厚度h为1.5mm。该组织工程半月板支架也可以等间隔设置6-12个放射状的沿环形直径延伸的通孔。
下面对本发明的具体实施例进行详细说明。应该理解的是，本发明是根据特定实施例进行描述的，但本领域的技术人员应明白在不脱离本发明范围时，可进行各种变化和等同替换。此外，为适应本发明技术的特定场合或材料，可对本发明进行诸多修改而不脱离其保护范围。因此，本发明并不限于在此公开的特定实施例，而包括所有落入到权利要求保护范围的实施例。
实施例1
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为300μm，纤维间隔设置为200μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为10mm，环形内径d2为4mm，厚度h为1.5mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例2
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为320μm，纤维间隔设置为300μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为10.5mm，环形内径d2为4.5mm，厚度h为1.6mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例3
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为310μm，纤维间隔设置为250μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为10.5mm，环形内径d2为4.5mm，厚度h为1.6mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例4
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为320μm，纤维间隔设置为250μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为9.5mm，环形内径d2为3.5mm，厚度h为1.4mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例5
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为310μm，纤维间隔设置为250μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为9.5mm，环形内径d2为3.5mm，厚度h为1.4mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例6
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为330μm，纤维间隔设置为500μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为10mm，环形内径d2为4mm，厚度h为1.5mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
实施例7
1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印。
2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为330μm，纤维间隔设置为600μm，打印出环形的组织工程半月板支架，其中环形外径d1为10mm，环形内径d2为4mm，厚度h为1.5mm。
3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理。
本发明分别对上述实施例1-7制备的组织工程半月板支架进行了力学性能分析，实验结果表明使用实施例1-5的纤维直径和纤维间隔能够得到更适于半月板支架的抗拉伸强度和弹性模量，同时体外细胞及体内种植实验表明实施例1-5制备的组织工程半月板支架的孔隙率及孔隙结构更适于细胞的生长，更有利于半月板部位的修复。尤其实施例1的组织工程半月板支架的性能最佳。
下面将详细介绍实施例1和实施例6的支架对比试验结果。其中以实施例1作为实验组，实施例6作为对照组。请参阅图4a和4b，分别为实验组的组织工程半月板支架的大体观察图及表面电镜图。如图所示，该实施例1的制备方法打印出的PCL支架结构完整，支架的纤维均匀一致，孔隙连通率高。
(1)细胞培养实验：分别采用前述实验组和对照组PCL支架，将骨髓间充质干细胞100ul(密度1×107/ml)接种于12孔板预湿的PCL支架上，培养4小时后加入10％胎牛血清的α-MEM 1ml，每2天换液一次。24小时后进行live-dead染色，激光共聚焦检测。请参阅图5a，为实验组的组织工程半月板支架的细胞复合培养图。图5b和5c，分别为实验组和对照组的细胞死活染色结果图，图中标尺＝500μm。图5b和5c中可见实验组PCL支架上活细胞数目明显多于对照组。
(2)细胞增殖活性检测实验：分别采用前述实验组和对照组PCL支架，将骨髓间充质干细胞100ul(密度1×107/ml)接种于12孔板预湿的PCL支架上，复合培养3、5、7天后，进行细胞增殖与活性检测实验。如图6为实验组和对照组的细胞增殖与活性检测实验结果图。CCK8检测显示按上述实验组参数制备的环形支架上存活的细胞更多，更利于种子细胞增殖，两者的差异具有显著性。
(3)免疫荧光实验：分别采用前述实验组和对照组PCL支架，将骨髓间充质干细胞100ul(密度1×10^7/ml)接种于12孔板预湿的PCL支架上，成纤维软骨诱导复合培养14天后，进行免疫荧光实验。其中分别对细胞核，一、二型胶原进行荧光成像。通过实验结果可知，实验组种子细胞周围一、二型胶原分布均匀且密度大，与对照组相比差异有显著性。因此，实验组的PCL支架更利于种子细胞成纤维软骨分化并形成一、二型胶原。
(4)生物力学分析：将骨髓间充质干细胞100ul(密度1×107/ml)接种于12孔板预湿的PCL支架上，成纤维软骨诱导复合培养28天后，进行拉伸和压缩弹性模量测试。请参阅图7a和7b分别为实验组和对照组的拉伸弹性模量测试结果和压缩弹性模量测试结果图。如图所示，实验组的PCL支架的拉伸和压缩弹性模量均明显高于对照组，其中拉伸弹性模量达到40Mpa，压缩弹性模量达到26Mpa，且在复合培养28天之后，力学性能有所增加，拉伸弹性模量达到43Mpa，压缩弹性模量达到27Mpa，支架性能更稳定。实验组抗拉强度和抗压强度均较好，符合组织工程半月板对生物力学的要求。
(5)体内移植效果：本发明将实验组的支架移植到兔膝关节内，移植后6周取材。对另外一组兔进行半月板全切除手术，且未植入任何支架，以形成空白对照组。如图8a为对照组手术后的大体观察图，图8b和8c分别实验组和空白对照组手术后6周的大体观察图，图中黑色箭头所指为半月板位置。如图所示，实验组在种植入支架6周后，支架部分吸收，周围组织开始长入，而空白对照组的关节退变明显，周围骨赘增生。
(6)关节软骨组织学观察:本发明在上述体内移植实验组和空白对照组术后6周进行半月板覆盖区域(胫骨平台)关节软骨组织学观察。如图9a和9b，分别为实验组和空白对照组的关节软骨HE染色结果图；图9c和9d，分别为实验组和空白对照组的关节软骨甲苯胺蓝染色结果图，其中标尺＝100μm。结果显示实验组支架植入后6周关节软骨接近正常，HE显示关节表面平整无裂隙，细胞数量及排列分布正常，潮线完整，仅甲苯胺蓝染色(TB)显示基质轻度失染；而空白对照组在切除半月板后软骨损伤明显，表层纤维化，细胞排列紊乱，潮线不规则且有簇聚细胞出现，TB染色不均匀且大部分失染。
上述一系列的实验结果证明实施例1的组织工程半月板支架相较于对照组而言，其孔隙结构更利于提高接种细胞和植入区域自体长入细胞的存活率、增殖率和向半月板纤维软骨细胞分化的能力，同时其生物力学强度更高，从而最终形成形态、结构、力学性能和功能良好的新生半月板。并且，实施例1的支架在植入兔膝关节中6周，支架保留原有形态，部分吸收，周围组织开始长入。同时，相较于全切半月板的对照组其软骨保护能力更高。

Claims (5)

1.一种组织工程半月板支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、将聚己内酯材料置入熔融沉积成型三维打印机的喷头内加热至120-140℃，并在600-1000kPa的气压下准备打印；所述聚己内酯材料的重均分子量为60000；
S2、将熔融沉积成型三维打印机的打印速度设置为0.6-0.75mm/s，纤维直径设置为300-320μm，纤维间隔设置为200-300μm，打印出组织工程半月板支架；
S3、使用钴60对所述组织工程半月板支架进行辐照灭菌处理；
该方法制得的组织工程半月板支架的拉伸弹性模量为40-45Mpa，压缩弹性模量为25-30Mpa；
所述组织工程半月板支架的外形为环形，且其环形外径为9.5-10.5mm，环形内径为3.5-4.5mm，厚度1.4-1.6mm。
2.根据权利要求1所述的组织工程半月板支架的制备方法，其特征在于，所述组织工程半月板支架的环形外径为10mm，环形内径为4mm，厚度1.5mm。
3.根据权利要求1所述的组织工程半月板支架的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中设置的纤维直径为300μm，纤维间隔为200μm。
4.根据权利要求1所述的组织工程半月板支架的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括：
S4、将骨髓间充质干细胞细胞接种到所述组织工程半月板支架上复合培养7天。
5.一种组织工程半月板支架，其特征在于，采用权利要求1-4中任意一项所述的组织工程半月板支架的制备方法制得。
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