KR101488716B1

KR101488716B1 - 치조골 재생용 키트

Info

Publication number: KR101488716B1
Application number: KR20120096986A
Authority: KR
Inventors: 엄인웅; 김영균
Original assignee: 엄인웅
Priority date: 2012-09-03
Filing date: 2012-09-03
Publication date: 2015-02-04
Also published as: KR20140030605A

Abstract

본 발명은 치조골 재생용 키트에 관한 것으로, 성장인자 또는 성장인자 유도체를 치아와 함께 구성함으로써 치조골 재생속도를 향상시킨 치조골 재생용 키트에 관한 것이다. 본 발명의 치조골 재생용 키트는 치아만 투여한 경우보다 치조골 재생속도가 월등하며. 재생된 골조직의 완성도 및 일체성 역시 현저히 개선된다. 이런 신속하고 완전한 치조골 재생은 환자의 불편을 크게 경감시키고, 특히 광범위한 골조직 결손부에서 형상유지가 중요한 경우에 골조직의 변형 혹은 수축으로 인한 부작용을 감소시켜 더욱 바람직하다.

Description

치조골 재생용 키트 {Kit for Regenerating Alveolar Bone}

본 발명은 치조골 재생용 키트에 관한 것으로, 성장인자 또는 성장인자 유도체를 치아와 함께 구성함으로써 치조골 재생속도를 향상시킨 치조골 재생용 키트에 관한 것이다.

최근 의학계에서는 물리적, 화학적 및 화상으로 인한 골조직 손상이나 염증 또는 종양 등과 같은 질환으로 인한 골조직 결손의 재생이 중요하게 다루어지고 있다. 골조직이 결손된 부위는 외력에 의한 골파절이나 골수염이 쉽게 일어난다. 또한 피부, 근육, 골조직 및 신경조직 등이 복합으로 손상된 경우 각 층별로 정상적인 조직 또는 기관으로의 재생이 어려워, 흉터조직으로 대체되면서 운동성 및 기능성의 제약이 수반된다.

종래에는 이러한 문제를 해결하기 위하여 환자 자신의 다른 부위의 골조직을 이식하여 채워 주었으나, 다른 정상부위의 골조직 결손이나 운동성 및 기능성 제약과 같은 부작용이 초래되었다.

그리고, 자가골이나 기타 골이식재들은 치유기간 동안 많은 골흡수가 수반되어 부피유지 능력이 떨어져 치밀한 골이식재가 필요하지만 이들 재료에서는 관통형 기공을 갖추기가 어려웠다.

또한, 결손된 골조직이 치유되기 전에 다른 조직이 성장해오는 것을 차단하거나 외부 세균이 조직 내부로 침입하는 것을 막기 위해 차폐막을 이용하거나, 결손 부위에 손상된 골조직의 세포가 성장할 수 있는 공간을 마련해 주는 다공성 지지체(scaffold)를 이용한다. 또한 치유나 재생에 필요한 줄기세포가 화학주성을 통해 결손부위 방향으로 이동해 오도록 하는 성장인자를 이용하거나, 한국등록특허 제 644296 호와 같이 상기 줄기세포를 조작 혹은 배양하여 결손부위에 이식함으로써 세포성장을 하도록 하는 시도가 증가하는 추세이다.

한편, 재조합 인간 뼈형성 단백질 (recombinant human Bone Morphogenetic Protein. BMP)의 성장인자는 치유에 필요한 간엽줄기세포를 화학주성으로 결손부위로 이동해 오도록 하여 다양한 조직으로 분화시킨다. 특허 WO 1993/000050에서는 BMP-2가 간엽줄기세포를 골조직으로 성장시킨다고 주장하였다.

그러나, 이들 줄기세포를 이용한 기술 역시 치조골 재생에 많은 시간이 소요돼 환자의 불편이 몹시 큰 실정이다.

한국등록특허 제 644296 호 (정필훈 등) 국제공개특허 WO 1993/000050 (제네틱스 인스티튜트, 엘엘씨)

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여 안출된 것으로서, 성장인자 또는 성장인자 유도체를 치아와 함께 구성한 치조골 재생용 키트를 제공하는 것을 그 목적으로 한다.

본 발명의 치조골 재생용 키트는 상술한 바와 같은 목적을 달성하기 위하여,

사람 또는 동물의 치아, 및

성장인자 (growth factor) 또는 성장인자 유도체를 포함하는 것을 특징으로 한다.

또한, 상기 치조골 재생 키트는 친수성 폴리머를 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 치조골 재생 키트는 뼈, 탈회골, 칼슘인산염 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 추가로 포함할 수 있다.

또한, 상기 성장인자는 재조합 인간 뼈형성 단백질 (recombinant human Bone Morphogenetic Protein. BMP), BMP를 구성하는 아미노산의 공이중결합체, 섬유아세포 성장인자, 성장분화인자 (Growth Differentiation Factor. GDF), 변형성장인자 (Transforming Growth Factor. TGF), 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유사 성장인자, 상피성장인자, 케라티노사이트성장인자 2 (KGF2), 형태형성단백질 52 (Morphogenic Protein 52. MP52), 이들의 유전자재조합단백질 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 성장인자 유도체는 폴리디옥시리보누클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide. PDRN)일 수 있다.

또한, 상기 친수성 폴리머는 알긴산, 키토산, 콜라겐, 히알루론산, 셀룰로즈, 폴리 (비닐리덴 플루오라이드) [poly (vinylidene fluoride)], 폴리(테트라플루오로에틸렌) [poly(tetrafluoroethylene)], 폴리(비닐알콜) [poly (vinyl alcohol)], 폴리(하이드록시알카노에이트) [poly(hydroxyalkanoate)], 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트) [poly (ethylene terephthalate)], 폴리 (부틸렌 테레프탈레이트) [poly (butylene terephthalate)], 폴리 (메틸 메타크릴레이트) [poly (methyl methacrylate)], 폴리 (하이드록시에틸 메타크릴레이트) [poly (hydroxyethyl methacrylate)], 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드) [poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리 (디메틸 실록산) [poly (dimethyl siloxane)], 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리 (글리콜산) [poly (glycolic acid)], 폴리 (락트산) [poly (lactic acids)], 폴리 (에틸렌 옥사이드) [poly (ethylene oxides)], 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) [poly(lactide-co-glycolides)], 폴리(s-카프로락톤) [poly(s-caprolactone)], 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리(오르토-에스테르) [poly(ortho-esters)], 폴리이미드(polyimides) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

또한, 상기 치아는 평균입경 50 내지 800 ㎛의 분말, 평균장경 800 내지 2000 ㎛의 칩, 평균두께 0.2 내지 5.0 mm의 막, 치근 형태의 지지체(scaffold) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 형태일 수 있다.

또한, 상기 치아는 치수강 내 연조직을 제거하고, 탈지될 수 있다.

또한, 상기 치아는 추가로 탈회될 수 있다.

또한, 상기 치조골 재생용 키트는 냉동건조될 수 있다.

또한, 상기 치조골 재생용 키트는 그 구성요소인 치아와, 성장인자 또는 성장인자 유도체가 별도로 보관되거나, 함께 보관될 수 있다.

또한, 상기 치조골 재생용 키트는 그 구성요소인 치아와, 성장인자 또는 성장인자 유도체 및 친수성 폴리머가 별도로 보관되거나, 함께 보관될 수 있다.

또한, 상기 친수성 폴리머는 상기 치아와 교차결합될 수 있다.

또한, 상기 친수성 폴리머는 겔 상태일 수 있다.

성장인자 또는 성장인자 유도체를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트는 치조골을 전혀 재생시키지 못하는 합성골 투여군은 물론, 치아 투여군에 비해서도 골유도 능력을 극대화시켜 치조골 재생속도가 월등하며, 재생된 골조직의 완성도 및 일체성 역시 현저히 개선된다. 이런 신속하고 완전한 치조골 재생은 환자의 불편을 크게 경감시키고, 특히 광범위한 골조직 결손부에서 형상유지가 중요한 경우에 골조직의 변형 혹은 수축으로 인한 부작용을 감소시켜 더욱 바람직하다. 나아가, 자가골 이식으로 인한 다른 정상부위의 골조직 결손이나 운동성 및 기능성 제약의 부작용을 획기적으로 개선시키는 효과가 있고, 장시간에 걸친 재생에 따른 감염을 예방하는 부수적인 효과도 있어 일선 의료현장에서의 효용이 몹시 크다.

도 1은 본 발명의 치조골 재생용 키트를 구성하는 분말 형태의 치아를 촬영한 사진이다.
도 2는 본 발명의 치조골 재생용 키트를 구성하는 칩 형태의 치아를 촬영한 사진이다.
도 3은 본 발명의 치조골 재생용 키트를 구성하는 막 형태의 치아를 촬영한 사진이다.
도 4는 본 발명의 치조골 재생용 키트를 구성하는 치근 형태의 치아를 촬영한 사진이다.
도 5는 치아가 보관된 바이알과 성장인자가 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 6은 치아와 성장인자가 함께 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 7은 성장인자를 치아에 코팅하여 동결건조된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 8은 치아가 보관된 바이알과 칼슘인산염 및 성장인자가 함께 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 9는 치아와 콜라겐 및 성장인자를 혼합하여 동결건조한 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 10은 치아가 보관된 바이알과 성장인자 및 콜라겐이 함께 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 11은 치아가 보관된 바이알과 성장인자가 보관된 바이알 및 콜라겐이 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이다.
도 12 및 도 13은 rhBMP-2를 이량화하고 정제한 후 시행한 SDS-PAGE 분석결과이며, U는 비환원 rhBMP-2이고 R은 환원 rhBMP-2이며, Dimer는 이량체 분획을 Monomer는 단량체 분획을 가리킨다.
도 14는 rhBMP-2의 HPLC profile이다.
도 15는 C2C12 세포에 rhBMP-2 이량체를 적용한 경우 알칼리성 인산효소의 분비 정도를 나타낸 그래프이다.
도 16은 C2C12 세포에 rhBMP-2를 투입하여 골아세포 형태로 변화됨을 보여주는 사진이다.
도 17은 rhBMP-2를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 18은 PDRN을 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 19는 치아 분말을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 20은 합성골을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 21은 rhBMP-2를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 확대사진이다.
도 22는 PDRN을 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 확대사진이다.
도 23은 치아 분말을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 확대사진이다.
도 24는 합성골을 삽입한 지 2 주 후의 생검 조직을 촬영한 확대사진이다.
도 25는 rhBMP-2를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 4 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 26은 PDRN을 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 4 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 27은 치아 분말을 삽입한 지 5 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 28은 합성골을 삽입한 지 4 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 29는 rhBMP-2를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트 내용물을 삽입한 지 8 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.
도 30은 치아 분말을 삽입한 지 8 주 후의 생검 조직을 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예에 대하여 상세히 설명한다. 또한, 하기의 설명에서는 구체적인 구성요소 등과 같은 많은 특정사항들이 설명되어 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해서 제공된 것일 뿐 이러한 특정 사항들 없이도 본 발명이 실시될 수 있음은 이 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게는 자명하다 할 것이다. 그리고, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

치아는 치조골과 동일한 성분의 콜라젠과 골형성 유도 단백질을 함유하고 있어 그 성분이 거의 동일하고, 골개조에 포함되는 흡수능력을 가지고 있으며, 5 내지 200 ㎛ 굵기의 콜라겐 섬유가 관통된 미세 기공이 있어 기존 골유도 재생술에 최적이다. 본 발명은 이에 착안하여 과거 발치 후 버리던 치아를 자가골 이식과 동일한 기능과 효력을 지니는 이식재로 변화시키는 기술이며, 상기 관통형 기공에 성장인자가 함유되어 장시간 작용하는 점을 이용하여, 성장인자 또는 성장인자 유도체를 포함시킴으로써 이식 후 치조골 재생속도를 증가시키는 것을 가장 주요한 특징으로 한다.

즉, 본 발명의 치조골 재생용 키트는 사람 또는 동물의 치아와 함께 성장인자 (growth factor) 또는 성장인자 유도체를 포함하는 것을 특징으로 한다. 상기 치아는 환자 본인의 치아인 자가 치아일 수도 있고, 다른 사람의 치아인 동종 치아, 그리고 사람 이외의 동물의 치아인 이종 치아일 수도 있다.

상기 치아는 세척을 통해 표면의 이물질을 제거하고, 우식부위 및 치수강 내 신경 등의 연조직까지 완전히 제거한다. 그리고, 탈지과정을 거치는 것이 바람직한데, 지방을 제거하면 소독이 용이하고 오염 가능성을 줄이며, 골형성에 유리한 무기질과 콜라겐 등의 유기질만 남아 면역거부반응을 예방할 수 있다. 본 발명에 사용되는 치아는 나아가 탈회과정을 거칠 수도 있다.

각 과정을 구체적으로 예를 들어 설명하면, 탈지는 탈수한 치아의 5 내지 10 배 부피의 에틸 에테르 또는 클로로포름 메탄올 용액으로 10 분 내지 24 시간 동안 시행한다. 그리고, 탈회는 20 배 부피의 0.2 내지 0.7 N 염산 수용액에 12 내지 72 시간 시행한다. 상기 염산 수용액은 탈지한 치아 1 g 당 5 ml씩 사용한다.

또한, 상기 치아는 평균입경 50 내지 800 ㎛의 분말, 평균장경 800 내지 2000 ㎛의 칩, 평균두께 0.2 내지 5.0 mm의 막, 치근 형태의 지지체(scaffold) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 분말 형태의 치아는 도 1에, 칩 형태의 치아는 도 2에, 막 형태의 치아는 도 3에, 치근 형태의 지지체는 도 4에 각각 도시되어 있다.

상기 막이나 블럭은 조직절편기 (microtome knife. DS Global , 한국)를 이용하여 정해진 두께로 잘라 제조하며, 그 모양은 결손부의 모양과 형태에 따라 변경될 수 있다. 그리고, 상기 막이나 블럭에 구멍 또는 관통공을 다수 형성하는 것도 가능하다. 이러한 구멍 또는 관통공은 성장인자 또는 성장인자 유도체가 머무르는 공간으로 작용할 수 있다는 점에서 더욱 바람직하다.

나아가, 치근 형태로 지지체로서 이용함으로써 치조골 재생에 걸리는 시간을 단축시키고 이식 초기부터 기본적인 지지력을 제공하는 것도 가능하다. 구체적으로, 발치한 치아의 뿌리부를 그대로 사용하여 원래 치조골 자리에 이식함으로써 손상된 치조골을 원형대로 복구할 수 있다. 이러한 치근 형태의 지지체에도 평균지름 0.2 내지 1 mm의 구멍 또는 관통공을 다수 형성할 수 있다.

본 발명의 치조골 재생용 키트는 상기 치아 외에 성장인자 또는 성장인자 유도체를 포함한다. 상기 성장인자 또는 성장인자 유도체는 치아만 사용한 경우보다 치조골의 재생속도가 현저히 빨라지는 효과를 낳는다.

여기서, 성장인자는 재조합 인간 뼈형성 단백질 (recombinant human Bone Morphogenetic Protein. BMP), BMP를 구성하는 아미노산의 공이중결합체, 섬유아세포 성장인자, 성장분화인자 (Growth Differentiation Factor. GDF), 변형성장인자 (Transforming Growth Factor. TGF), 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유사 성장인자, 상피성장인자, 케라티노사이트성장인자 2 (KGF2), 형태형성단백질 52 (Morphogenic Protein 52. MP52), 이들의 유전자재조합단백질 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 상기 BMP는 현재까지 여러 종류가 개발되어 활용되고 있으며, 이들 BMP는 거의 동등한 골형성 기능을 가진다. 이러한 BMP로서는 BMP-2, BMP-4, BMP-5, BMP-6, BMP-7, BMP-8, BMP-9, BMP-10,BMP-11, BMP-12 및 BMP-13가 개발되었으며 모두 본 발명에 사용될 수 있다. 그리고, BMP를 구성하는 아미노산의 공이중결합체는 BMP-2의 아미노산과 BMP-4의 아미노산을 꼬아서 만든 결합체를 가리킨다.

이들 성장인자는 본 발명의 치조골 재생용 키트에 포함된 치아 성분과 함께 환자의 치조골에 작용하여 치조골의 재생을 촉진한다. 예컨대, BMP는 치유에 필요한 간엽줄기세포를 화학주성으로 결손부위에 이동시킨 후 줄기세포를 골아세포로 변형하여 치조골 조직을 재생한다.

또한, 상기 성장인자 유도체 중 하나인 폴리디옥시리보누클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide. PDRN)는 우회경로 (salvage pathway, 迂廻經路)를 활성화하고, A2 푸린성 수용체 (purinergic receptor)에 선택적으로 작용하는 이중작용을 통해 세포 나아가 조직을 재생한다. 먼저 우회경로를 활성화함으로써 DNA의 생합성을 촉진하고, 기질(matrix)의 재생을 촉진한다. 그리고, A2 푸린성 수용체에 선택적으로 작용하여 섬유모세포의 수를 증가시키고 분비를 활성화시키며, 그 결과 조직 손상 부위의 콜라겐 및 비 콜라겐 단백질과 기타 필요한 성분의 생성을 활성화한다. 구체적으로, 항염증 효과가 있는 A2A 수용체와 혈관 누출 및 부종 형성 예방 효과가 있는 A2B 수용체에 작용하여, 내피세포 이동, VEGF (vascular endothelial growth factor 혈관내피성장인자) 발현 증가 및 혈관신생촉진을 유도함으로써 세포 및 조직을 재생시키는 것이다.

본 발명의 치조골 재생용 키트는 이들 성장인자 또는 성장인자 유도체를 포함함으로써 종래 뼈를 주성분으로 한 치조골 재생재료보다 현저히 개선된 치조골 재생속도를 달성할 수 있다.

한편, 본 발명의 치조골 재생 키트는 치아 및 성장인자나 그 유도체 외에 친수성 폴리머를 추가로 포함할 수 있다. 이러한 폴리머는 치조골을 구성하는 칼슘 등의 무기물이 결합되는 뼈대를 이루어 치조골에 기계적 강도를 부가하고 재생속도를 높이는 효과를 부여한다.

여기서, 상기 친수성 폴리머는 알긴산, 키토산, 콜라겐, 히알루론산, 셀룰로즈, 폴리 (비닐리덴 플루오라이드) [poly (vinylidene fluoride)], 폴리(테트라플루오로에틸렌) [poly(tetrafluoroethylene)], 폴리(비닐알콜) [poly (vinyl alcohol)], 폴리(하이드록시알카노에이트) [poly(hydroxyalkanoate)], 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트) [poly (ethylene terephthalate)], 폴리 (부틸렌 테레프탈레이트) [poly (butylene terephthalate)], 폴리 (메틸 메타크릴레이트) [poly (methyl methacrylate)], 폴리 (하이드록시에틸 메타크릴레이트) [poly (hydroxyethyl methacrylate)], 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드) [poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리 (디메틸 실록산) [poly (dimethyl siloxane)], 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리 (글리콜산) [poly (glycolic acid)], 폴리 (락트산) [poly (lactic acids)], 폴리 (에틸렌 옥사이드) [poly (ethylene oxides)], 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) [poly(lactide-co-glycolides)], 폴리(s-카프로락톤) [poly(s-caprolactone)], 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리(오르토-에스테르) [poly(ortho-esters)], 폴리이미드(polyimides) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.

상기 친수성 폴리머와 동일한 취지로, 상기 치조골 재생 키트는 뼈, 탈회골, 칼슘인산염 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 무기물을 추가로 포함할 수 있다. 이들 물질들은 상기 성장인자 또는 성장인자 유도체)에 결합되어 치조골에 기계적 강도를 부가하고 재생속도를 높이는 효과를 부여한다.

또한, 상기 키트는 치조골 재생능력을 유지한 상태에서 정해진 기간 이상 보관하기 위해 냉동건조되는 것이 바람직하다. 보다 바람직하게는 상기 냉동건조 전에 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 방법, 예컨대 방사선 또는 에틸렌 옥사이드 가스 등으로 멸균하는 과정을 거치는 것이 권장된다.

그리고, 본 발명의 키트는 그 구성요소인 치아, 성장인자 또는 성장인자 유도체, 그리고 선택적 구성요소인 친수성 폴리머 및 무기물을 각각 따로따로 보관할 수도 있고 이들을 적절히 조합하여 보관할 수도 있다. 나아가, 성장인자, 성장인자 유도체, 친수성 폴리머를 액상화한 후 치아 또는 치아 및 무기물에 코팅하고 이를 동결건조하여 보관하거나, 상기 친수성 폴리머가 상기 치아와 교차결합되는 것도 가능하다. 또한, 겔 상태의 상기 친수성 폴리머에 상기 치아, 성장인자 또는 성장인자 유도체 등이 포함되는 것도 가능한데, 구체적으로, 치아나 성장인자 또는 모두를 겔상의 친수성 폴리머에 함유시켜 주사기나 바이알에 충전(充塡)시킨 후 동결건조시켜서 키트로 제공될 수 있다.

예컨대, 도 5는 치아가 보관된 바이알 (1)과 성장인자가 보관된 바이알 (2)로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트를 촬영한 사진이고, 도 6은 치아 (3)와 성장인자(4)가 함께 보관된 바이알로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이다.

도 7은 성장인자를 치아에 코팅하여 동결건조된 바이알 (5)로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이고, 도 8은 치아가 보관된 바이알 (6)과 칼슘인산염 및 성장인자가 함께 보관된 바이알 (7)로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이다.

도 9는 치아와 콜라겐 및 성장인자를 혼합하여 동결건조한 바이알 (8)로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이고, 도 10은 치아가 보관된 바이알 (9)과 성장인자 및 콜라겐이 함께 보관된 바이알 (10)로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이다.

도 11은 치아가 보관된 바이알 (11)과 성장인자가 보관된 바이알 (12) 및 콜라겐이 보관된 바이알 (13)로 구성된 본 발명의 키트를 촬영한 사진이다.

이하, 본 발명의 실시예에 대하여 설명한다.

실시예

실시예 1: 치아성분의 제조

환자 자신에서 발치된 치아를 준비하고, 충치나 염증과 같은 결손 부위를 제거하였다.

분말 형태의 치아는 -196 ℃ 이하의 액화 질소로써 40 분 간 냉동한 후 분쇄기로 분쇄(crushing)하여 도 1과 같은 평균입경 50 내지 800 ㎛의 분말로 가공했다. 분말은 40 분 간 증류수로 세척하여 오염물 및 잔여 연조직을 제거하고, 세척된 분말은 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)이 1 : 1 부피비의 비율로 혼합된 클로로포름 메탄올 용액으로 3 내지 12 시간 동안 탈지시켰다. 탈지된 분말은 원심분리에 의하여 부유 지방을 제거하고 그 후 증류수로 2 시간 세척하였다. 탈지된 분말은 중성 에틸알콜로 30 분 내지 2 시간 동안 탈수했다. 이후 20 배 부피의 0.2 내지 0.7 N 염산 수용액에 45 시간 탈회시켰다.

칩 형태의 치아는 우선 치아의 법랑질 및 연조직을 모두 제거하여 상아질만 남기고, 치근부 역시 신경 내 연조직을 모두 제거하는 단계부터 거쳤다. 이어서, 40 분 간 증류수로 세척하여 오염물 및 잔여 연조직을 제거하고, 세척된 치아는 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)이 1 : 1 부피비의 비율로 혼합된 클로로포름 메탄올 용액으로 12 내지 48 시간 동안 탈지시켰다. 탈지된 분말은 원심분리에 의하여 부유 지방을 제거하고 그 후 증류수로 2 시간 세척하였다. 탈지된 분말은 중성 에틸알콜로 30 분 내지 2 시간 동안 탈수했다. 이후 20 배 부피의 0.2 내지 0.7 N 염산 수용액에 24 시간 탈회시켰다. 탈회된 치아는 본 밀 (bone mill. Aceuropa, Spain)를 사용하여 도 2와 같은 평균장경 800 내지 2000 ㎛의 칩 형태로 제작했다.

막 형태의 치아 역시 치아의 법랑질 및 연조직을 모두 제거하여 상아질만 남기고, 치근부 역시 신경 내 연조직을 모두 제거하는 단계부터 거쳤다. 이어서, 40 분 간 증류수로 세척하여 오염물 및 잔여 연조직을 제거하고, 세척된 치아는 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)이 1 : 1 부피비의 비율로 혼합된 클로로포름 메탄올 용액으로 3 내지 12 시간 동안 탈지시켰다. 탈지된 분말은 원심분리에 의하여 부유 지방을 제거하고 그 후 증류수로 2 시간 세척하였다. 탈지된 분말은 중성 에틸알콜로 30 분 내지 2 시간 동안 탈수했다. 이후 20 배 부피의 0.2 내지 0.7 N 염산 수용액에 24 시간 탈회시켰다. 탈회된 치아를 조직절편기 (microtome knife. DS Global , 한국)를 이용하여 결손부의 모양과 형태에 따라 정해진 모양과 두께로 잘라 도 3과 같은 막 형태의 치아성분을 제조했다.

블럭 형태의 치아는 치아를 치관부와 치근부의 경계면(cemento enamel junction. CEJ)에서 잘라 두 부위로 분리하고 치관부는 법랑질과 신경 내 연조직을 모두 제거(trimming)하여 상아질만 남기고, 치근부 역시 신경 내 연조직을 모두 제거하여 제조했다. 치근 형태의 치아는 예컨대 도 4와 같으며, 도시된 바와 같이 각 면에 지름 0.8 mm의 관통 다공을 뚫을 수 있다. 블럭은 40 분 간 증류수로 세척하여 오염물 및 잔여 연조직을 제거하고, 세척된 블럭은 클로로포름(chloroform)과 메탄올(methanol)이 1 : 1 부피비의 비율로 혼합된 클로로포름 메탄올 용액으로 3 내지 12 시간 동안 탈지시켰다. 탈지된 블럭은 원심분리에 의하여 부유 지방을 제거하고 그 후 증류수로 2 시간 세척하였다. 탈지된 블럭은 중성 에틸알콜로 30 분 내지 2 시간 동안 탈수했다. 이후 20 배 부피의 0.2 내지 0.7 N 염산 수용액에 45 시간 탈회시켰다.

탈지와 탈수 및 탈회된 상기 치아성분들은 세척 및 냉동건조 후 에틸렌 옥사이드 가스로 멸균하였다.

실시예 2: rhBMP-2의 제조

1. rhBMP-2의 생산

(1) 대장균을 이용한 인간 BMP-2 유전자의 발현 및 정제

인간 BMP-2 유전자를 얻기 위하여 U2OS 세포 (Life technologies TM, 한국)에서 총세포 RNA를 Trizol (Gibco BRL. 미국) 용액으로 추출하여 역전사반응을 실시하였다. cDNA를 주형으로 sense primer로서 5'-AGAAGAACATATGCAAGCCAAACACAAACAGCGG-3, antisense primer로서 5'-AATTTTACAGCTTCTAGCGACACCCACAACCCT-3' 을 사용하여 중합효소 연쇄반응 (polymerase chain reaction. PCR)을 실시하였다. PCR 산물을 분리하여 pGEM-T vector(Promega, USA)에 삽입시킨 후 대장균(DH5α) (Life technologies TM, 한국)을 이용하여 클로닝하였다.

(2) 고밀도세포배양

발효조 (KoBioTec. 한국)를 이용하여 Fatemeh 등의 방법 (Tabandeh F, Shojaosadati SA, Zomorodipour A, et al. Heat-induced production of human growthhormone byhigh cell density cultivation of recombinant Escherichiacoli. Biotechnol Lett 2004;26:245-250. Korz DJ, Rinas U, Hellmuth K, Sanders EA, DeckwerW-D. Simple fed-batch technique for high cell density cultivationof Escherichia coli. J of Biotechnology 1995;39:59-65.)으로 고밀도로 배양하였다. 멸균된 영양배지 (포도당 33.3 g/L, 펩톤 10 g/L, 효모 추출물 5 g/L, MgSO₄ 1 g/L, CaCl₂ 0.048 g/L, ZnSO₄ 0.0176 g/L, CuSO₄ 0.008 g/L)를 첨가하면서 교반속도 250 rpm으로 교반하면서 24 시간 동안 배양하였다.

(3) 단백질정제

현탁액을 -80 ℃ 초저온냉동고 (Nihon Freezer. 일본)에 보관하였다. 냉동된 현탁액을 냉장온도에서 해동시킨 후 가압하여 세포를 파쇄한 다음 5,500 xg, 4 ℃에서 45 분 간 원심분리하였다. 재변성과정을 거친 mature rhBMP-2가 본래의 3 차구조를 가지게 되면 N-말단이 헤파린 결합부위 (heparin-binding site)를 가지게 된다.

2. 정제한 rhBMP-2의 생화학적특성

(1) rhBMP-2 원액의 순도 및 동정시험

SDS-PAGE 시험결과, 도 13에 도시한 바와 같이 rhBMP-2 원액은 표준액과 동일한 이동거리를 보였고, 95 % 이상의 순도를 나타내었다.

(2) HPLC (High performance Liquid Chromatography)분석

정제된 rhBMP-2 이량체를 0.1 % TFA(trifluoroaceticacid)에 1 ㎍/㎕의 농도로 녹여 C4 reversed-phase HPLC column (4.6 mm × 50 mm, 300 Å, 5 ㎛ particle size; Gracevydac. 미국)을 이용하여 각 분획의 단백질을 검출하고 모니터하였다. 도 14에 도시한 바와 같이 rhBMP-2 원액의 시험결과 표준액과 동등한 유지시간을 나타내어, 순수한 rhBMP-2로 정제되었음을 확인할 수 있었다.

3. rhBMP-2 단백질의 생산 및 정제 결과

이량화시켜 헤파린 컬럼 (시그마 다우. 이탈리아)으로 친화성 크로마토그래피를 실시하였다. 그 결과, 도 13에서 보여지는 바와 같이 0.3 M NaCl 분획에서 대부분의 단량체와 소량의 이량체가 용출되었고 0.5 M NaCl 분획에서 이량체들이 용출되었다. 정제된 rhBMP-2 단량체와 이량체를 SDS-PAGE로 분석하여 확인하였다. 생산된 단량체의 크기는 약 114 아미노산 잔기로 계산되며 단량체의 분자량은 약 14 kDa이고, 이량체는 두개의 단량체가 이황화결합으로 연결되므로 비환원조건에서 단량체와 같은 크기의 밴드로 나타났다. 이량체의 크기는 약 28 kDa으로 나타났다.

4. 정제한 rhBMP-2의 생물학적 활성 (in vitro test)

근육아세포인 C2C12 세포 (시그마 다우. 이탈리아)에 rhBMP-2 이량체를 적용하여 관찰한 결과, 3 일 배양 후 골아세포의 대표적 단백질인 알칼리성 인산효소가 분비되면서 (도 15), 세포형태가 골아세포로 변형됨을 현미경으로 확인하였다 (도 16). 따라서 rhBMP-2가 뼈형성단백질로서의 기능함을 확인하였다.

실시예 3 : 성장인자가 포함된 키트의 제조

실시예 1의 치아가 보관된 바이알 (1)과 실시예 2의 rhBMP-2가 보관된 바이알 (2)을 조합하여 본 발명의 치조골 재생용 키트 (도 5)를 제조하였고, 실시예 1의 치아 (3)와 실시예 2의 rhBMP-2 (4)가 함께 보관된 본 발명의 키트 (도 6)를 제조하였다. 그리고, 실시예 2의 rhBMP-2를 실시예 1의 치아에 코팅하고 동결건조시킨 바이알 (5)로 구성된 본 발명의 키트 (도 7)를 제조하였고, 실시예 1의 치아가 보관된 바이알 (6)과 Ca₃(PO₄)₂ 및 실시예 2의 rhBMP-2가 함께 보관된 바이알 (7)로 구성된 본 발명의 키트 (도 8)를 제조하였다.

또한, 실시예 1의 치아, 콜라겐 0.5 % 수용액 (시그마 알드리치. 미국) 및 실시예 2의 rhBMP-2를 혼합하여 동결건조한 블럭 (8) 형태의 키트 (도 9)를 제조하였고, 실시예 1의 치아가 보관된 바이알 (9)과 실시예 2의 rhBMP-2를 콜라겐 용액과 함께 동결건조한 블럭 (10)으로 구성된 본 발명의 키트 (도 10)를 제조하였다. 그리고, 실시예 1의 치아가 보관된 바이알 (11)과 실시예 2의 BMP-2가 동결건조된 바이알 (12) 및 콜라겐 0.5 % 수용액 (시그마 알드리치. 미국)이 동결건조된 블럭(13)으로 구성된 본 발명의 치조골 재생용 키트 (도 11)로 제조하였다.

실시예 1의 치아에 코팅하고 동결건조시키는 방법을 도 7의 키트를 예로 들어 설명하면 다음과 같다.

치아 이식재 1 g을 유리 바이알에 분주하고 실리콘 마개로 캡핑(capping)한 후 감마선으로 멸균하였다. 1 mg의 재조합 rhBMP-2를 글루탐산 5 mM, 글리신 2.5 중량%, 염화나트륨 5 mM, 트윈-80 0.015 중량%, D-소르비톨 0.5 중량%로 이루어진 용액에 용해시킨 후 치아과립이 담겨져 있는 유리 바이알에 첨가하여 치아를 침지하였다. 상기 유리 바이알을 초저온 냉동기에 넣고 즉시 냉동시키고 진공 동결건조기에 넣어 -40 ℃에서 3 시간 동안 유지한 후 점진적으로 20 ℃로 승온하였다. 동결건조된 유리 바이알을 무균환경에서 캡핑하였다.

실시예 4: 성장인자 유도체가 포함된 키트의 제조

실시예 3과 동일한 과정을 거치되, 실시예 2의 rhBMP-2 대신 PDRN (MASTELLI_SRL,Italy) 을 사용하여 제조하였다.

시험예

36 마리 무흉선 마우스 (평균무게: 30 g)가 사용되었다. 동물들을 12 마리씩 3개의 그룹 (2 주, 4 주 또는 5 주, 8 주)으로 나누고, 각 그룹을 다시 성장인자 투여군, 성장인자 유도체 투여군 및 대조군으로서 치아 투여군 및 합성골 투여군으로 나누어 실험했다. 전신마취는 무균조건에서 펜토바르티발(pentobartibal) 나트륨 (Nembutal, 43mg/kg, Dainabot Co., Japan)을 복강내 주사하여 이루어졌다. 각 샘플의 등을 절개하고, 본 발명의 치조골 재생용 키트 삽입을 위한 피하주머니를 만들기 위해 오른쪽과 왼쪽 피하조직을 10 mm 깊이로 절개하였다.

성장인자 투여군은 실시예 3의 본 발명의 키트 중 치아와 rhBMP-2가 별도 보관된 키트를 해동하고 치아 분말 0.2 g을 rhBMP-2 수용액 0.2 ㎖에 수화시켜 각 부위에 삽입하였다. 성장인자 유도체 투여군은 실시예 4의 본 발명의 키트를 해동하고 치아 분말 0.2 g을 PDRN 수용액 0.2 ㎖에 수화시켜 각 부위에 삽입하였다. 치아 투여군은 실시예 1의 치아 분말 0.2 g만 각 부위에 삽입하고, 합성골 투여군은 합성골 (코웰메디. 한국) 0.2 g만 각 부위에 삽입하였다. 각 이식재를 삽입한 후, 절개 부위를 나일론 봉합사로 봉합하였다. 감염으로부터 상처를 보호하기 위하여, 항생연고 (대웅제약. 한국)는 연구 전반에 걸쳐 사용되었다.

피하주머니 중의 치조골 재생용 키트 내용물을 포함하는 연조직 생검은 삽입한 지 2 주, 4 주 또는 5 주, 8 주 후의 무흉선 마우스로부터 수득하였다. 총 72 개의 생검이 10 % 포르말린에 24 시간 동안 고정되었다. 이어서 12 시간 동안 Calci-Clear Rapid (National Diagnostics, Atlanta, GA)에서 탈회 후, 검체를 증류수로 세척하였다. 그 다음 검체를 Hypercentre XP 조직 프로세서 (Shandon, 영국)로 처리하고, 파라핀에 함몰시키고, 4-5 μm 두께로 잘랐다. 분할된 검체는 hematoxylin (도 17 내지 도 25 및 도 27 내지 도 30) 및 eosin 염색 (도 26) 이후 광학현미경을 사용하여 관찰했다. 이미지는 MagnaFire digital camera system (Optronics, Goleta, CA)를 이용해 캡쳐하였다.

도 17 내지 도 20은 2 주 후의 검체 사진으로서 합성골 투여군 (도 20)에서 연조직 생성이 가장 활발하고, 성장인자 투여군 (도 17) 및 성장인자 유도체 투여군 (도 18)이 그 다음으로 활발하며, 치아 투여군 (도 19)에서 연조직 생성이 가장 느렸다.

그러나, 2 주 후의 검체를 확대촬영한 도 21 내지 도 22는 실제 치조골이 전혀 다른 양상으로 생성됨을 보여준다. 즉, 성장인자 투여군인 도 21 및 성장인자 유도체 투여군인 도 22는 원래 치아 입자보다 더 큰 재생골이 생성되고 있음에 반해, 도 23의 치아 투여군은 좌측면에만 일부 치조골이 재생되고 있을 뿐이다. 합성골 투여군인 도 24에서는 합성골 주위로 치조골 재생이 전혀 이루어지지 않음을 볼 수 있다.

도 25 내지 도 28은 4 주 또는 5 주 후의 검체를 촬영한 사진으로, 성장인자 투여군 (4 주 후)인 도 25 및 성장인자 유도체 투여군 (4 주 후)인 도 26은 치아 입자가 거의 보이지 않을 정도로 치조골 재생이 이루어졌음을 확인할 수 있다. 이에 반해 치아 투여군 (5 주 후)인 도 27은 실시예 1의 치아 일부가 아직 관찰되고 있어, 본 발명의 키트에 비해 치조골 재생속도가 떨어짐을 알 수 있으며, 합성골 투여군 (4 주 후)인 도 28은 여전히 치조골 재생이 이루어지지 않음을 볼 수 있다.

마지막으로, 8 주 후의 검체를 촬영한 사진인 도 29 및 도 30에서는 골유도의 증거인 연골 생성까지 확인할 수 있었다. 구체적으로, 성장인자 투여군인 도 29의 좌측에는 치아 투여군인 도 30의 좌측 하단에서와 마찬가지로 연골이 확인되고 있으며 이에 반해 치아 입자는 전혀 발견되지 않아, 치조골 재생에 이어 연골까지 완전히 복원되었음을 확인할 수 있다.

상기 도면들로부터 성장인자 또는 성장인자 유도체를 포함한 본 발명의 치조골 재생용 키트는 치조골을 전혀 재생시키지 못하는 합성골 투여군은 물론이고, 치아 투여군에 비해서도 치조골 재생속도가 월등함을 확인할 수 있다. 이런 신속한 치조골 재생은 환자의 불편을 크게 경감시키고, 장시간에 걸친 재생에 따른 감염을 예방하는 부수적인 효과도 있어 일선 의료현장에서의 효용이 몹시 크다.

이상에서는 본 발명의 바람직한 실시예에 대해서 설명하였으나, 본 발명은 상술한 특정의 실시예에 한정되지 아니하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본원 발명의 요지를 벗어남이 없이 다양한 변형 실시가 가능함은 물론이다. 따라서, 본 발명의 범위는 위의 실시예에 국한해서 해석되어서는 안되며, 후술하는 특허청구범위 뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야 할 것이다.

Claims

사람 또는 동물의 치아,
성장인자 (growth factor) 또는 성장인자 유도체, 및
알긴산, 키토산, 콜라겐, 히알루론산, 셀룰로즈, 폴리 (비닐리덴 플루오라이드) [poly (vinylidene fluoride)], 폴리(테트라플루오로에틸렌) [poly(tetrafluoroethylene)], 폴리(비닐알콜) [poly (vinyl alcohol)], 폴리(하이드록시알카노에이트) [poly(hydroxyalkanoate)], 폴리 (에틸렌 테레프탈레이트) [poly (ethylene terephthalate)], 폴리 (부틸렌 테레프탈레이트) [poly (butylene terephthalate)], 폴리 (메틸 메타크릴레이트) [poly (methyl methacrylate)], 폴리 (하이드록시에틸 메타크릴레이트) [poly (hydroxyethyl methacrylate)], 폴리(N-이소프로필아크릴아마이드) [poly(N-isopropylacrylamide)], 폴리 (디메틸 실록산) [poly (dimethyl siloxane)], 폴리디옥사논(polydioxanone), 폴리피롤(polypyrrole), 폴리 (글리콜산) [poly (glycolic acid)], 폴리 (락트산) [poly (lactic acids)], 폴리 (에틸렌 옥사이드) [poly (ethylene oxides)], 폴리(락타이드-코-글리콜라이드) [poly(lactide-co-glycolides)], 폴리(s-카프로락톤) [poly(s-caprolactone)], 폴리안하이드라이드(polyanhydrides), 폴리포스파젠(polyphosphazenes), 폴리(오르토-에스테르) [poly(ortho-esters)], 폴리이미드(polyimides) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 친수성 폴리머를 포함하는 치조골 재생용 키트.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 치조골 재생 키트는 뼈, 탈회골, 칼슘인산염 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
청구항 1에 있어서,
상기 성장인자는 재조합 인간 뼈형성 단백질 (recombinant human Bone Morphogenetic Protein. BMP), BMP를 구성하는 아미노산의 공이중결합체, 섬유아세포 성장인자, 성장분화인자 (Growth Differentiation Factor. GDF), 변형성장인자 (Transforming Growth Factor. TGF), 혈소판 유래 성장인자, 인슐린 유사 성장인자, 상피성장인자, 케라티노사이트성장인자 2 (KGF2), 형태형성단백질 52 (Morphogenic Protein 52. MP52), 이들의 유전자재조합단백질 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
청구항 1에 있어서,
상기 성장인자 유도체는 폴리디옥시리보누클레오타이드 (polydeoxyribonucleotide. PDRN)인 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
삭제
청구항 1에 있어서,
상기 치아는 평균입경 50 내지 800 ㎛의 분말, 평균장경 800 내지 2000 ㎛의 칩, 평균두께 0.2 내지 5.0 mm의 막, 치근 형태의 지지체(scaffold) 및 그 혼합물로 이루어진 군에서 선택된 형태인 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
청구항 1에 있어서,
상기 치아는 치수강 내 연조직을 제거하고, 탈지된 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
청구항 8에 있어서,
상기 치아는 탈회된 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.
청구항 1에 있어서,
상기 키트는 냉동건조된 것을 특징으로 하는 치조골 재생용 키트.