KR102104933B1

KR102104933B1 - 줄기세포 유래 엑소좀을 함유하는 치아 재강화 또는 치아골 이식재 조성물 및 그 제조방법

Info

Publication number: KR102104933B1
Application number: KR1020190138098A
Authority: KR
Inventors: 이우승; 이형기; 아케르케 베레케토바
Original assignee: 주식회사 라이프온
Priority date: 2019-10-31
Filing date: 2019-10-31
Publication date: 2020-04-27

Abstract

본 발명은 치아 재강화 및 치아골 이식재 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 유래 엑소좀, 다공성의 인산칼슘계 세라믹 및 친수성 고분자를 포함하는 치아 재강화 및 치아골 이식재 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 안정적인 제형으로 엑소좀을 담지할 수 있으며, 엑소좀 내의 유효성분이 안정하게 지속적으로 방출되어 치아의 결손부위에 부착되어 결손부위를 메꿀 수 있을 뿐 아니라 골 형성 및 재생 효과를 높일 수 있어 이식재로써 유용하게 사용될 수 있다.

Description

줄기세포 유래 엑소좀을 함유하는 치아 재강화 또는 치아골 이식재 조성물 및 그 제조방법 {Composition and manufacturing method of stem cell derived exosomes for teeth remineralization or dental bone graft comprising}

본 발명은 치아 재강화 또는 치아골 이식재 조성물에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 줄기세포 유래 엑소좀, 다공성의 인산칼슘계 세라믹 및 친수성 고분자를 포함하는 치아 재강화 또는 치아골 이식재 조성물 및 그 제조방법에 관한 것이다.

치아는 인체내 경조직이라고 불리며, 치아에서의 골무기물 함유율은 에나멜질 약 97%, 상아질 70%, 시멘트질 50% 정도의 함유율을 보이며, 이와 같이 무기물질의 조성은 동물의 종류, 부위, 연령 등에 따라 다소 차이가 있다. 구성 물질 중 유기물질은 대부분 콜라겐(collagen)으로 뼈의 생성과 인성 및 탄성을 유지하는데 관여할 뿐 아니라 골세포를 선택적으로 부착을 유도하여 골무기물입자를 배향시키는 matrix로서 존재한다. 자연 상태의 뼈, 즉 척추동물의 골무기물의 주성분은 인회석(Apatite) 광물이며 하이드록시아파타이트 (Hydroxyapatite, (Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂), 수산화인회석 (Hydroxylapatite), 수산화탄산아파타이트(carbonated hydroxy apatite, CHAp, A-type: Ca₁₀(PO₄)₆[(OH)_2-2x(CO₃)_x], B-type: Ca_10-x[(PO₄)_6-2x(CO₃)_2x](OH)₂)로 알려져 있으며 Ca² ⁺ 대신에 Mg² ⁺과 Na⁺가 미량 함유되며 OH^- 대신에 Cl^-, F^-가 미량 함유되는 것으로 알려져 있다. 치아골이식재는 치아골의 형태학적, 생리학적 기능을 복원시키는데 있으므로, 이 때 사용되는 아파타이트 치아골이식 재료는 즉시 사용이 가능하고, 면역반응을 일으키지 않으며, 빠른 골생성 및 재혈관화를 촉진하고 치아의 지지와 연속성을 유지하는 등의 기본적인 조건을 만족시킬 수 있어야 한다. 그러나 아파타이트는 자체가 골전도성을 가지는 매개체로서의 역할은 할 수 있어도 치료기간의 단축을 위해 필수적인 초기 치아골형성을 위한 골유도력은 지니고 있지 않다. 이러한 단점을 보완하기 위해 아파타이트에 세포외 기질 단백질, 조직성장인자나 골형성 단백질과 같은 화학 주성을 지니는 생리활성 물질에 대한 연구가 많이 진행되어 왔으며, 아파타이드 등과 동시에 적용하는 연구로 이루어지고 있다. 하지만, 치아골 형성이 아직 미비하고 장기간 동안 유효한 활성을 유지하고 재생효과를 낼 수 있도록 하는 새로운 치아골 이식재로써의 제제 개발이 요구되고 있다.

본 발명자들은 치아에 결손되거나 파절된 부분에 부착되어 결손 부분을 보호하면서 골 형성효과를 가질 수 있는 생체 적합재료로 구성된 새로운 이식재 조성물을 제공하고자 하며, 특히 치아 재생효과를 가진 성분과 이들 성분이 지속적으로 공급할 수 있도록 새로운 제형의 이식재 조성물을 제공하고자 하였다.

따라서, 본 발명자들은 새로운 성분 및 제형을 포함하는 치아골 이식재 조성물 및 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀, 다공성의 인산칼슘계 세라믹 및 친수성 고분자를 포함하는 치아골 이식재. 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 a) 다공성의 인산칼슘계 세라믹을 친수성 고분자 용액에 첨가하여 침지시키는 단계;

b) 상기 용액에 추가로 줄기세포 유래 엑소좀을 첨가하여 교반시키는 단계; 및

c) 상기 엑소좀과 혼합된 용액을 건조시키는 단계;를 포함하는 치아골 이식재 조성물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 조성물은 안정적인 제형으로 엑소좀을 담지할 수 있으며, 엑소좀 내의 유효성분이 안정하게 지속적으로 방출되어 치아의 결손부위에 부착되어 결손부위를 메꿀 수 있을 뿐 아니라 골 형성 및 재생 효과를 높일 수 있어 이식재로써 유용하게 사용될 수 있다. 특히, 인체 적합성의 물질로 구성되어 안정하며 다양한 유효성분이 함유된 엑소좀이 안정적으로 유지 및 방출될 수 있어 최적화된 제형을 제공할 수 있다.

도 1은 실시예 1-1에서 분리된 엑소좀의 SEM 현미경 이미지이다.
도 2는 실시예 1-2에서 제조된 다공성 세라믹의 SEM 현미경 이미지이다.
도 3은 실험예 2에 따른 조성물들의 혈관생성효과를 보여주는 것이다.((a): 실시예 1; (b) 비교예 1; (c) 비교예 2)
도4는 실험예 3에 따른 조성물들의 BMP-2의 발현양을 보여주는 그래프이다.

본 발명은 줄기세포 유래 엑소좀, 다공성의 인산칼슘계 세라믹 및 친수성 고분자를 포함하는 치아골 이식재. 조성물을 제공한다. 일 구현예에서, 상기 세라믹은 하이드록시 아파타이트(Hydroxy apatite, HA), 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘((tricalcium phosphate), 인산사칼슘 및 칼슘메타 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어진 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 세라믹은 하이드록시아파타이트와 인산삼칼슘의 혼합물의 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 다공성의 세라믹은 친수성 고분자로 코팅된 것인 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 친수성 고분자는 히알루론산, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 일 구현예에서는 상기 친수성 고분자는 히알루론산인 것이다. 일 구현예에서는 상기 세라믹은 0.1 내지 50 um의 기공을 가지는 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 줄기세포는 배아 유래 줄기세포 성체 유래 중간엽 줄기세포, 역분화 줄기세포 중 어느 하나 이상인 것이다.

c) 상기 엑소좀과 혼합된 용액을 건조시키는 단계;를 포함하는 치아골 이식재 조성물의 제조방법을 제공한다. 일 구현예에서는 상기 세라믹은 하이드록시 아파타이트(Hydroxy apatite, HA), 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘((tricalcium phosphate), 인산사칼슘 및 칼슘메타 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상으로 이루어진 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 세라믹은 하이드록시아파타이트와 인산삼칼슘의 혼합물의 다공성 세라믹인 것이다. 일 구현예에서는 상기 a)단계에서 친수성 고분자는 다공성의 세라믹을 코팅하는 것이다. 일 구현예에서는 상기 친수성 고분자는 히알루론산, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 일 구현예에서는 상기 c)단계에서의 건조는 -20 내지 -40℃에서 1 내지 3시간 동결시키고 추가로 -50 내지 -80℃에서 추가로 15 내지 36 시간을 동결건조시키는 것이다.

인산 칼슘계 세리믹은 하이드록시 아파타이트(Hydroxy apatite, HA), 인산일칼슘, 인산이칼슘, 인산삼칼슘((tricalcium phosphate), 인산사칼슘 및 칼슘메타 포스페이트로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상인 것이다. 이들 세라믹은 평균 직경 0.1 내지 50 um의 기공을 가지는 다공성 세라믹인 것이며, 바람직하게는 0.5 내지 30 um이다. 기공율은 50% 이상인 다공성인 것이 바람직하다. 공극이 너무 작으면 고분자가 코팅되기가 어렵고 너무 크면 강도가 약해지게 된다. 입자의 크기는 0.05 내지 5mm일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 1mm가 좋다. 입자가 너무 작으면 치아골 이식재로써 충진효과가 떨어지며, 입자가 클 경우 엑소좀과의 흡착효과가 떨어지고 치아의 파손부위의 부착되기가 어렵다.

친수성의 고분자는 히알루론산, 메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시프로필셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시 에틸셀룰로오스, 셀룰로오스 에테르, 소디움 카복시메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스(CMC) 및 하이드록시프로필메틸셀룰로오스으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상인 것이다.

다공성의 세라믹 입자는 소결에 의해 제조될 수 있으며, 구체적으로 템플레이팅법(templating), 스펀지법(sponge method), 발포법(foaming), 동결건조법 (freeze-drying), 겔 캐스팅주입법(gel-casting), 래피드 프로토타이핑법(rapid-prototyping), 필터 프레싱법(fillter-pressing), 압출법(extrusion) 등이 사용되어 왔다. 그 외에도 분무 건조한 구형의 입자를 몰드(mold)에 충진하고 바인더(binder)를 침투시켜 성형하고 고정하여 소결을 거쳐 다공체를 만드는 무가압분말충전성형법, PMMA비드를 웜프레싱(warm-pressing)하여 템플레이트를 만들고 내부로 졸(sol)을 침투시키고 중합반응을 일으켜 성형하여 다공체를 구현하는 방법, 그리고 슬러리(slurry)를 만들고 이것을 전자레인지를 이용하여 내부에 있는 물 분자를 급속히 기화시켜서 다공체를 제조하는 방법 등이 있다.

본 발명의 다공성 세라믹 입자는 스프레이 드라이를 통해 구형화된 후 800℃ 내지 1100℃의 범위에서 소결된 것임을 특징으로 한다. 800 ℃ 이하에서는 원형의 기공이 형성되지 않고, 1100 ℃ 이하에서 융용상태를 길게하여 균질화된 기공의 직경을 가질 수 있다.

본 발명에 화학적 조성이 골 무기질의 화학적 조성과 유사하고 석회화된 조직과 특이적이고 제어된 상호 작용을 나타내기 때문에 치아 재강화 및 골 이식 대체물로 사용되는 인산 칼슘계 세라믹이 사용된다. 본 발명의 인산 칼슘계 세라믹 입자는 점성제, 가소제, 윤활제 및 증류수를 혼합하여 페이스트를 제조한 후 최종 소결될 수 있으며, 최종 소결시, 본 발명에서는 하이드록시아파타이트와 인산삼칼슘이 70:30 내지 60:40의 비율로 혼합된 것일 수 있다. 하이드록시 아파타이트의 경우 기계적 강도는 우수하고 인산칼슘과 조합이 생물 작용 및 생체 흡수성 특징을 향상시켜 골 이식재나 치아 이식재로 사용에 적합하지만, 본 발명의 엑소좀의 효과적인 재생효과를 기대하기 위하여는 Ca 및 P 이온 농도를 증가하고 미네랄과의 화학적 구조가 유사한 인산칼슘계 세라믹의 사용이 적합하다. 따라서, 기계적 강도를 유지하면서 생체적합하며 엑소좀의 생체물질을 안정하게 담지할 수 있는 두가지 물질이 혼합되는 것이 바람직하며, 특히 하이드록시아파타이트와 인산삼칼슘이 70:30 내지 60:40의 비율로 혼합된 것이 좋다. 점성제는 메틸셀룰로오스(Methyl cellulose), 하이드록시프로필 메틸셀룰로오스(Hydroxypropyl methyl cellulose), 콜라겐(Collagen), 파라핀(Paraffin), 젤라틴(Gelatine), 알지네이트(Alginate), 스타치(Starch) 및 왁스(Wax)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 혼합인 것일 수 있다. 가소제는 폴리에틸렌글리콜(Polyethylene glycol), 글리세롤(Glycerol), 디부틸 프탈레이트(Dibutyl phthalate) 및 디메틸 프탈레이트(Dimethyl phthalate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 혼합인 것일 수 있다. 가소제의 비율은 인산 칼슘계 세라믹스를 포함하는 건식 혼합물 대비 0.1중량% 내지 10중량%일 수 있다. 윤활제는 캐스터오일(Castor oil), 스테애릭 애시드(Stearic acid), 올레익 에시드(Oleic acid) 및 올리브 오일(Olive oil)로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나 또는 이의 혼합인 것일 수 있다. 이때, 윤활제의 비율은 인산 칼슘계 세라믹스를 포함하는 건식 혼합물 대비 0.1중량% 내지 10중량%일 수 있다. 상기 인산 칼슘계 세라믹스와 바인더로 사용되는 점성제, 가소제 및 윤활류는 상술한 군으로부터 선택될 수 있으나, 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서는 a) 다공성의 인산칼슘계 세라믹을 친수성 고분자 용액에 첨가하여 침지시키는 단계로 고분자로 코팅된 세라믹을 얻을 수 있다. 상기 세라믹 입자 100 중량%에 대하여 친수성 고분자는 증류수 등의 용매에 용해시켜 제조할 수 있으며, 바람직하게는 1 내지 30 중량 %, 더욱 바람직하게는 5 내지 20 중량 %의 농도로 용해하여 사용하는 것이 좋다. 이는 고분자 용액이 건조 과정을 통하여 수분이 제거되면서 남은 고분자 성분을 의미한다. 히알루론산 등의 고분자는 다공성의 세라믹 입자를 코팅하며 내부에 형성된 기공을 따라 코팅되어 엑소좀 입자가 부착될 수 있도록 하고 안정하게 담지되도록 한다. 고분자가 너무 적게 함유될 경우 코팅효과가 떨어질 수 있으며, 너무 많은 함량이 첨가될 경우 엑소좀의 부착을 오히려 방해할 수 있다.

상기 고분자 용액의 용매제로서는 물, 증류수, 1,3-부틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜200 내지 20,000 등의 폴리에틸렌글리콜 등이 사용될 수 있다.

상기에서 제조된 용액에 추가로 줄기세포 유래 엑소좀을 첨가하여 교반시키는 단계로 엑소좀을 다공성 세라믹에 담지시킬 수 있다. 안정적으로 분산되고 세라믹에 고르게 담지되게 하기 위하여 1 시간 내지 3시간 동안 교반하여 안정화시키는 것이 바람직하다.

본 발명에서 줄기세포는 미분화된 세포로서 자기 복제 능력을 가지면서 두 개 이상의 서로 다른 종류의 세포로 분화하는 능력을 갖는 세포를 말한다. 본 발명의 줄기세포는 자가 또는 동종 유래 줄기세포일 수 있으며, 인간 및 비인간 포유류를 포함한 임의 유형의 동물 유래일 수 있고, 상기 줄기세포가 성체로부터 유래된 것이든 배아로부터 유래된 것이든 이에 한정되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 배아 줄기세포 또는 성체 줄기세포를 포함하며, 바람직하게는 성체 줄기세포이다. 상기 성체 줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell), 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포 또는 다분화능 줄기세포일 수 있으며, 바람직하게는 중간엽 줄기세포이나, 이에 한정되지 않는다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막 및 태반 등으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

줄기세포에서 유래된 엑소좀은 수용체 및 단백질뿐 아니라 핵 성분을 함유하고 있어 세포 간 커뮤니케이션 역할을 하는 것으로 세포 조직 재생의 치료, 면역 조절 등의 잠재력을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 또한 상기 줄기세포에서 유래된 엑소좀은 줄기세포에 비해 동물 혈청을 상대적으로 적게 함유하고 있어 동물 혈청 감염에 의한 증상(zoonosis)의 위험성 역시 배재할 수 있다.

본 발명에서 엑소좀(exosome)은 다양한 세포들로부터 분비되는 막 구조의 작은(대략 30-100 nm의 직경) 소낭을 의미하며, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나 세포 밖 환경으로 방출되는 소낭을 의미한다. 상기 엑소좀은 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 것을 포함한다. 즉, 다낭체와 원형질막의 융합이 일어나면 소낭들은 세포 밖 환경으로 방출되는데, 이것을 엑소좀이라고 한다. 이러한 엑소좀이 어떤 분자적 기작에 의해 만들어지는지 확실히 밝혀진 바가 없으나, 적혈구 세포뿐만 아니라, B-림프구, T-림프구, 수지상 세포, 혈소판, 대식 세포 등을 포함한 다양한 종류의 면역 세포들과 종양 세포, 줄기세포 등도 살아 있는 상태에서 엑소좀을 생산하여 분비한다고 알려졌다.

이와 같은 엑소좀 또는 세포외 소포체를 분리하는 종래 기술로는 초원심분리법(ultracentrifugation), 밀도구배원심법(density gradient centrifugation), 초미세여과법(ultrafiltration), 사이즈 배제 크로마토그래피(size exclusion chromatography), 이온교환 크로마토그래피(ion exchange chromatography), 면역친화성 분리법(immunoaffinity capture), 미세유체기술 분리법(microfluidics-based isolation), 침전법(exosome precipitation), 총엑소좀 추출 키트(total exosome isolation kit), 또는 폴리머 기반 침전법(polymer based precipitation) 등이 있다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, mRNA, miRNA 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다.

균질화된 직경을 가지는 다공성의 세라믹 이식재는 엑소좀을 효과적으로 담지할 수 있으며, 성분을 지속적으로 신생골의 성장과 주위 조직 및 혈관 생성에 도움이 되어 가장 바람직하다. 상기 세라믹 입자에 친수성 고분자를 코팅하여 엑소좀과의 흡착효과를 증가가시켜 엑소좀의 유효성분을 효과적으로 담지할 수 있으며 치아골에 그 유효성분을 안정하게 전달할 수 있다.

본 발명에서 c) 상기 엑소좀과 혼합된 용액을 건조시키는 단계로 최종 엑소좀이 담지된 분말 형태의 세라믹을 얻을 수 있다. c)단계에서의 건조는 -20 내지 -40℃에서 1 내지 3시간 동결시키고 추가로 -50 내지 -80℃에서 추가로 15 내지 36 시간을 동결건조시키는 것이 바람직하다.

상기 이식재 조성물에 추가로 치밀골조각, 트리칼슘인산, 다이칼슘인산, 펜타칼슘 하이드록시아파타이트(pentacalcium hydroxylapatite), 테트라칼슘 포스페이트 모녹사이드(tetracalcium phosphate monoxide), 무수칼슘설페이트, 칼슘 설페이트 헤미하이드레이트(calcium sulfate hemihydrate), 칼슘 설페이트 디하이드레이트(calcium sulfate dihydrate), 키토산, 콜라겐, 덱스트란, 스타치, 항진균제, 항바이러스제, 항박테리아제, 비타민, 아미노산, 펩티드, 파이브로넥틴, 면역억제제 또한 첨가 물질로 사용이 가능하며 2종 이상 첨가도 가능하다.

본 발명의 조성물은 분말 형태 그대로 사용하는 것도 가능하며, 치약, 가루 치약, 세정제, 가글링 제품, 쩜, 구강 스프레이 또는 구강 청결제이며, 바람직하게는 치약이다. 그 외에 액상 고상, 현탁액, 젤상, 에러로졸 형태일 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 조성물은 효과적인 양의 시간 동안 개인의 하나 이상의 치아에 조성물을 도포하는 단계를 포함하는 치아 결손 및 보강을 위한 방법에서 사용되며, 바람직하게는 상기 조성물은 하나 이상의 치아에 적어도 1 분, 적어도 15 분, 적어도 30 분, 적어도 1 시간, 적어도 2 시간, 적어도 12 시간 또는 적어도 24 시간 동안 잔존한다. 화학적 첨가물을 이용하여 겔, 과립, 페이스트, 정제, 펠렛 등의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상기 제형 외에 통상적으로 치과용 재료에 이용되는 다른 성분, 예를 들어 실리카, 인산마그네슘, 탄산칼슘, 지르코니아 등을 필요에 따라 본 발명의 효과를 해치지 않는 범위에서 배합할 수 있다. 또한, 예를 들어 피브린, 콜라겐, 젤라틴, 키토산, 키틴, 알기산염, 히알루론산, 덱스트란과 같이 생체적합성이 양호한 천연 고분자는 물론이고, 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(poly(glycolic acid), PGA), 폴리락틱코글리코산(poly(D,L-lactic-co-glycolic acid, PLGA), 폴리-e-(카프로락톤), 폴리아미노산, 폴리안하이드라이드, 폴리오르쏘에스테르, 폴리에틸렌옥사이드(PEO), 폴리비닐아코올(PVA), 폴리에틸렌글리콜(PEG), 폴리우레탄, 폴리아크릴산, 폴리-N-이소프로필아크릴아마이드 및 이들의 유도체 또는 이들의 공중합체로 이루어진 군에서 선택되는 합성 고분자 재료를 들 수 있다. 치아나 치주 질환의 예방 또는 치료용 조성물로 사용할 수 있으며, 치주질환은 치은염(gingivitis), 치주염(periodontitis), 치주낭(periodontal pocket) 또는 치주농양(periodontal abscess)인 것을 특징으로 한다. 치아 이식재로써 치아의 결손부위에 손상에 부착되어 결손부위를 보호하면서 골 형성을 촉진시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세하게 설명한다. 단 하기의 실시예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위해 제공되는 것일 뿐, 본 발명의 범위가 하기의 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

[실시예 1]

1-1. 줄기세포 유래 엑소좀의 분리

인간 제대혈 유래 중간엽 줄기세포(3x10⁵개)를 100 mm 배양접시(orange scientific cat# 4450200)에 분주 후 1주일간 배양하였다. 배양된 세포에서 줄기세포 유래 엑소좀을 분리하기 위하여, 초원심분리기(Ultracentrifuge)를 이용하였다. 배양액을 2 ml 원심 분리 튜브에 나누어 담아 4℃, 10000 g에서 30분간 원심분리하였으며, 상층액을 새 튜브에 옮겨 세포 부스러기(debris)를 제거하였다. 상기 상층액을 다시 4℃, 100,000 g에서 2시간 동안 초원심분리하였으며, 상층액을 제거하고 엑소좀을 분리하였다.(최종 농도: 18 μg/ml).

상기 과정을 통해 분리한 엑소좀을 SEM 이미지를 통해 관찰하였으며, 웨스턴 블랏을 이용하여 알려진 엑소좀 마커인 CD63 및 CD9(System Bioscience, Mountain View, CA, USA)의 발현을 확인하였다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 상기와 같은 방법을 통해 수득된 엑소좀은 정상적인 형태를 보임을 확인하였다.

1-2. 다공성 세라믹의 제조

하이드록시 아파타이트와 인산삼칼슘을 7:3의 비율로 총 20g이 되게 혼합한 건식 세라믹에 점성제로서 메틸셀룰로오스 2g, 가소제로써 폴리에틸렌글리콜 1g, 캐스터 오일의 윤활제 1g을 첨가하여 페이스트 상태로 교반한 후 증류수 10ml을 추가하여 반죽 형태의 페이스트를 제조하였다. 압출기가 연결된 실린지에 주입한 후 압력을 가하여 성형체를 제조한 후 60℃에서 24시간 동안 건조시켜 수분을 증발 시켰다. 건조된 성형체를 소결시정으로 500℃까지 온도를 높인 후 2시간 동안 유지함으로써 건조된 성형체에 포함된 유기 바인더들이 탈지되게 하였다. 이후 다시 1100℃까지 온도를 높인 후 3시간 동안 유지시키고 냉각하여 다공성 세라믹을 완성하였다. 도2는 SEM 이미지를 보여주는 것이다.

1-3. 코팅된 다공성 세라믹의 제조

히알루론산 용액(10 중량%)을 30℃의 증류수에 용해시켜 1시간동안 혼합하여 히알루론산 용액 10mL을 얻었다. 여기에 다공성 세리믹을 10g를 첨가하여 37℃에서 3시간 동안 침지시켰다.

1-4. 엑소좀을 담지한 다공성 세리막의 제조

상기 1-1의 공정에서 수득된 엑소좀을 상기 1-3에서 코팅된 세라믹이 침지된 용액에 첨가한 후 분산을 위하여 2시간 동안 교반하였다. 다음 -300℃의 온도에서 2시간 동결시키고, 수분제거를 위하여 -70℃에서 24시간동안 동결건조 시켰다. 최종 16.5g의 최종 세라믹 산물을 얻었다.

[실시예 2 내지 5]

상기 실시예 1-2의 다공성 세라믹 입자의 기계적 안정성 및 강도 등을 분석하기 위하여 인산칼슘계 세라믹의 비율 조성을 실시예 1-2의 7:3이 아닌 다음의 표1과 같이 달리하여 조성물을 제조하였다. 이 세라믹 혼합물로 강도를 측정하였으며, 그 이후에 실시예 3-2의 세라믹에 추가로 상기 실시예 1-3 및 1-4의 히알루론산의 코팅 및 엑소좀과의 반응공정을 수행하여 최종 코팅된 다공성 세라믹을 각각 실시예 3을 얻었다.

	인산칼슘계 세라믹
	하이드록시 아파타이트	인산삼칼슘
실시예 2-2	10	0
실시예 3-2	5	5
실시예 4-2	3	7
실시예 5-2	0	10

[비교예 1]

상기 실시예 1에서 1-2까지의 공정만으로 제조된 세라믹을 제조하였다. 이후 1-3의 코팅공정을 시행하지 않고 1-4의 엑소좀의 추가 공정을 시행하였다. 최종 엑소좀이 담지된 세라믹 입자를 얻었다.

[비교예 2]

상기 실시예 1에서 1-3까지의 코팅된 세라믹 입자를 제조한 후 1-4의 엑소좀을 담지하지 않고 최종 세라믹 입자를 제조하였다.

[실험예 1]

다공성 인산칼슘계 세라믹의 기계적 강도 분석

상기 실시예 1-2 및 실시예 2 내지 5에서 제조된 세라믹의 입자를 각각 5g으로 0.35cc의 증류수에 첨가하여 페이스트를 제조하였다. 스테인레스강 주형들(5 cylindrical stainless steel molds)에 고르게 적재할 수 있는데, 이 주형들의 직경은 5 mm이고 높이가 10 mm이다. 그 후 주형들을 두 시간 동안 37℃ 생리식염수 배스에 담근다. 다섯 개의 경화 샘플들을 주형에서 제거하고 유니버셜 시험 기계(Instron, Canton, MA)를 이용해서 분당 5 mm의 크로스헤드 속도로 압축강도를 실험하였다. 다음 표2는 그 결과를 보여주는 것이다. 그 결과 실시예 1-2의 조성, 실시예 2-2 및 3-2의 조성이 강한 압축강도를 보였다. 이는 골 결손부위에 부착되고 안정하게 유지되기 위하여 높은 강도를 가지고 있어 이식재로 적합함을 보여주는 것이다.

	강도(MPa)
실시예 1-2	2.3
실시예 2-2	3.2
실시예 3-2	2.4
실시예 4-2	1.5
실시예 5-2	1.2

[실험예 2]

혈관생성 능력 측정

골형성에 필수적인 혈관생성(Angiogenesis) 정도를 알아보기 위하여 Tube-like structure 형성 정도를 마트리젤 어세이를 이용하여 측정하였다. 세포로는 인간탯줄정맥내피세포(HUVEC)를 사용하였으며, 배양 배지로 EEGM-2 BulletKit (Lonza #cc3162)를 사용하였고, Matrigel은 BD Matrigel™ Basement Membrane Matrix Growth Factor Reduced, Phenol Red Free (BD Biosciences #356231)를 사용하였다. 먼저 4℃에서 밤새 마트리젤을 녹인 뒤, 마트리젤 200 유닛/웰을 24-웰 플레이트에 첨가하였다. 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 한 뒤, 마트리젤 상에 5x10⁴cell의 농도로 세포를 접종하였다. 이어서, 상기 실시예 1 및 비교예 1과 2에서 제조된 세라믹 입자를 첨가하였다. 각각의 세라믹 입자를 10 ㎍/㎖로 첨가하였으며, 24시간 동안 배양하고, PBS를 사용하여 2회 세척한 뒤, 4% 파라-포름알데하이드를 사용하여 세포를 고정하였다. 다시 PBS로 2회 세척하고, 0.1% crystal violet/50% 메탄올을 사용하여 10분 동안 염색한 뒤, 세척, 건조하고 위상차 현미경으로 관찰하였다. 도 3에 각각 실시예와 비교예들의 조성물들의 혈관생성효과를 나타내었다. 엑소좀이 코팅된 세라믹 입자에 담지된 실시예 1의 경우 내피세포에서 가장 많은 tube 구조를 형성하였으며, 혈관생성을 효과적으로 촉진할 수 있다는 것을 보여주었다. 반면, 엑소좀이 코팅되지 않은 세라믹 입자에 담지된 비교예 1의 경우는 일부 tube 형성을 보여주었지만 충분하지 않았고 엑소좀이 담지되지 않은 비교예 2의 경우 혈관 생성 효과를 기대하기 어려웠다.

[실험예 3]

골형성 단백질(BMP-2)의 발현 유도 측정

본 발명의 실시예 및 비교예의 세라믹 입자들이 실질적으로 골형성을 유도하는지를 확인하기 위하여 혈관내피세포의 골형성 단백질인 BMP-2의 발현 효과를 측정하였다. 실험예 1와 동일하게 HUVEC 세포를 사용하였으며, 배양 배지로 EGM-2 BulletKit (Lonza #cc3162)을 사용하였으며, 24-웰 플레이트에 5x10⁴cell/well의 농도로 세포를 접종한 뒤, 밤새 배양하였다. 각각에 실시예 1, 실시예 3 및 비교예 1과 2의 세라믹 입자를 10 ㎍/㎖로 처리하였다. 0, 3, 6, 12, 16, 24 시간 경과 후 각 샘플의 배지를 수거하고, BMP-2 ELISA assay (Peprotech #900-K255)를 사용하여 제공된 매뉴얼에 따라 BMP-2 발현 정도를 측정하였다. 본 실시예에 따른 측정 결과는 도 4의 그래프에 도시되어 있다. 실시예 1의 엑소좀이 코팅된 세라믹 입자에 담지된 경우 가장 높은 발현을 보였으며, 실시예 3의 경우 실시예 1에 비하여 초기 반응에서는 발현양이 유사하였으나 이후부터는 감소하였다. 비교예 1의 엑소좀이 코팅되지 않은 세라믹 입자에 담지된 경우 초기에는 발현양이 일부 증가하였으나 이후 증가되지 않았으며, 비교예 2의 엑소좀이 담지되지 않는 경우 발현양의 증가가 미비하였다. 따라서, 엑소좀이 코팅된 세라믹 입자에 효과적으로 담지되고 혈관내피세포의 BMP-2 발현 및 분비를 촉진하여, 골형성을 유도한다는 점을 확인하였다.

Claims

줄기세포 유래 엑소좀, 하이드록시 아파타이트와 인산삼칼슘이 7:3의 비율로 혼합된 다공성의 인산칼슘계 세라믹 및 히알루론산의 친수성 고분자를 포함하는 치아 재강화 및 치아골 이식재 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 다공성의 세라믹은 히알루론산의 친수성 고분자로 코팅된 것인 다공성 세라믹인 것인 조성물.
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제1항에 있어서, 상기 세라믹은 0.1 내지 50 um의 기공을 가지는 다공성 세라믹인 것인 조성물.
제1항에 있어서, 상기 줄기세포는 배아 유래 줄기세포 성체 유래 중간엽 줄기세포, 역분화 줄기세포 중 어느 하나 이상인 것인 조성물.
a) 하이드록시 아파타이트와 인산삼칼슘(tricalcium phosphate)이 7:3의 비율로 혼합된 다공성의 인산칼슘계 세라믹을 히알루론산의 친수성 고분자 용액에 첨가하여 침지시키는 단계;
b) 상기 용액에 추가로 줄기세포 유래 엑소좀을 첨가하여 교반시키는 단계; 및
c) 상기 엑소좀과 혼합된 용액을 건조시키는 단계;를 포함하는 치아골 이식재 조성물의 제조방법.
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제9항에 있어서, 상기 a)단계에서 히알루론산의 친수성 고분자는 다공성의 세라믹을 코팅하는 것인 제조방법.
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제9항에 있어서, 상기 c)단계에서의 건조는 -20 내지 -40℃에서 1 내지 3시간 동결시키고 추가로 -50 내지 -80℃에서 추가로 15 내지 36 시간을 동결건조시키는 것인 제조방법.