JP2018520750A - 骨形成性移植片形成ユニット - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、2015年6月9日出願の米国特許仮出願第62/172,808号に対する優先権を主張し、該出願の全内容が、参照により本明細書中に組み入れられる。
本開示は、骨形成前駆細胞(osteogenic precursor cell)および軟骨形成前駆細胞(chondrogenic precursor cell)、ならびに骨形成および骨修復を促進する該前駆細胞を含む組成物に関する。
(1) 理想的には生理的比率での、骨誘導性因子および/または骨促進性因子の天然に存在する混合物を提供し;
(2) (1)に記載される混合物および濃度に関して極端なロット間変動の対象ではなく;
(3) 始原細胞(progenitor cell)および/もしくは前駆細胞(precursor cell)および/またはそれらの生物活性物質が豊富であり;
(4) 長い保存寿命を有し;
(5) 保存および輸送するのが容易であり;かつ/または
(6) 滅菌に適している
べきである。
1. 以下の構成要素:
(a) 骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物、および
(b) 生物学的担体
を含む組成物であって、
該骨形成前駆細胞は、間葉系幹細胞ではない、上記組成物。
2. 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、実施形態1に記載の組成物。
3. 前記骨形成前駆細胞が、始原細胞の分化により取得される、実施形態1または2のいずれかに記載の組成物。
4. 前記始原細胞がクローン性胚性始原細胞である、実施形態3に記載の組成物。
5. 前記骨形成前駆細胞が、SM30、MEL2およびSK11からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、実施形態1または2のいずれかに記載の組成物。
6. 前記骨形成前駆細胞が、TGF-β3、BMP-2、またはその両方の存在下で始原細胞を培養することにより取得される、実施形態5に記載の組成物。
7. 前記始原細胞が、以下のマーカー:MMP1、MYL4、ZIC2、DIO2、DLK1、HAND2、SOX11、COL21A1、PTPRNおよびZIC1のうちの1種以上を発現する、実施形態3〜6のいずれか1つに記載の組成物。
8. 前記骨形成前駆細胞が、インテグリン結合性シアロタンパク質(IBSP)、オステオポンチン(SPP1)、アルカリホスファターゼ組織非特異型アイソザイム(ALPL)、およびBMP-2から選択される1種以上のマーカーを発現する、実施形態1〜7のいずれか1つに記載の組成物。
9. 前記骨形成前駆細胞がヒト細胞である、実施形態1〜8のいずれか1つに記載の組成物。
10. 前記骨形成前駆細胞が胚様体の一部分ではない、実施形態1〜9のいずれか1つに記載の組成物。
11. 前記骨形成前駆細胞がクローン性細胞集団のメンバーである、実施形態1〜10のいずれか1つに記載の組成物。
13. 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 軟骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 軟骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 軟骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 軟骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 軟骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、実施形態12に記載の組成物。
14.前記軟骨形成前駆細胞が、4D20.8、7PEND24、7SMOO32およびE15からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、実施形態12または13のいずれかに記載の組成物。
15. 前記始原細胞が、以下のマーカー:DIO2、DLK1、FOXF1、GABRB1、COL21A1、およびSRCRB4Dのうちの1種以上を発現する、実施形態12〜14のいずれか1つに記載の組成物。
16. 前記軟骨形成前駆細胞が、II型コラーゲンα1(COL2A1)およびアグレカン(aggrecan;ACAN)から選択される1種以上のマーカーを発現する、実施形態12〜15のいずれか1つに記載の組成物。
17. 前記生物学的担体が、コラーゲン、セラミックでコーティングされたコラーゲン、ヒドロゲル、またはセラミックが添加されたヒドロゲルである、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の組成物。
18. 前記生物学的担体が、脱灰骨基質(DBM)ではない、実施形態1〜16のいずれか1つに記載の組成物。
19. 滅菌される、実施形態1〜18のいずれか1つに記載の組成物。
21. 前記被験体がヒトである、実施形態20に記載の方法。
22. 前記被験体が非ヒト動物である、実施形態20に記載の方法。
23. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCを生物学的担体と組み合わせるステップ;および
(d) ステップ(c)の組み合わせを凍結乾燥させるステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
24. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCを生物学的担体と組み合わせるステップ;および
(d) 該生物学的担体上に存在する該細胞を溶解して移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
25. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCの溶解物を取得するステップ;および
(d) 該溶解物を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
26. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCの抽出物を取得するステップ;および
(d) 該抽出物を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
27. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCからエキソソームを調製するステップ;および
(d) 該エキソソームを生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
28. 以下のステップ:
(a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該培養物由来の馴化培地を取得するステップ;および
(d) 該馴化培地を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。
29. ステップ(d)に続いて、
(e) ステップ(d)の移植片形成ユニットを凍結乾燥させるステップ
をさらに含む、実施形態24〜28のいずれか1つに記載の方法。
31. 前記始原細胞が、SM30、MEL2およびSK11細胞株からなる群より選択される、実施形態23〜30のいずれか1つに記載の方法。
32. 前記始原細胞が、以下のマーカー:MMP1、MYL4、ZIC2、DIO2、DLK1、HAND2、SOX11、COL21A1、PTPRNおよびZIC1のうちの1種以上を発現する、実施形態23〜31のいずれか1つに記載の方法。
33. TGF-β3、BMP-2、またはその両方の存在下で前記始原細胞を培養することにより、該始原細胞をOPCへと分化させる、実施形態23〜32のいずれか1つに記載の方法。
34. 前記OPCが、骨シアロタンパク質II(IBSP)、オステオポンチン(SPP1)およびアルカリホスファターゼ組織非特異型アイソザイム(ALPL)から選択される1種以上のマーカーを発現する、実施形態23〜33のいずれか1つに記載の方法。
35. 前記OPCがヒト細胞である、実施形態23〜34のいずれか1つに記載の方法。
36. 前記OPCの培養物が胚様体を含まない、実施形態23〜35のいずれか1つに記載の方法。
37. 前記OPCの培養物がクローン性培養物である、実施形態23〜36のいずれか1つに記載の方法。
38. 前記生物学的担体が、コラーゲン、セラミックでコーティングされたコラーゲン、ヒドロゲル、またはセラミックが添加されたヒドロゲルである、実施形態23〜37のいずれか1つに記載の方法。
39. 前記コラーゲンがゼラチンである、実施形態38に記載の方法。
40. 前記生物学的担体が、脱灰骨基質(DBM)ではない、実施形態23〜39のいずれか1つに記載の方法。
(a) 軟骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物、および
(b) 生物学的担体
を含む組成物であって、
該軟骨形成前駆細胞は、間葉系幹細胞ではない、上記組成物。
42. 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 軟骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 軟骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 軟骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 軟骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 軟骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、実施形態41に記載の組成物。
43. 前記軟骨形成前駆細胞が、始原細胞の分化により取得される、実施形態41または42のいずれかに記載の組成物。
44. 前記始原細胞がクローン性胚性始原細胞である、実施形態43に記載の組成物。
45. 前記軟骨形成前駆細胞が、4D20.8、7PEND24、7SMOO32およびE15からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、実施形態41または42のいずれかに記載の組成物。
46. 前記軟骨形成前駆細胞が、TGF-β3、GDF5、BMP-4、またはそれらの組み合わせの存在下で始原細胞を培養することにより得られる、実施形態45に記載の組成物。
47. 前記始原細胞が、以下のマーカー:DIO2、DLK1、FOXF1、GABRB1、COL21A1、およびSRCB4Dのうちの1種以上を発現する、実施形態43〜46のいずれか1つに記載の組成物。
48. 前記軟骨形成前駆細胞が、COL2A1およびACANから選択される1種以上のマーカーを発現する、実施形態41〜47のいずれか1つに記載の組成物。
49. 前記軟骨形成前駆細胞がヒト細胞である、実施形態41〜48のいずれか1つに記載の組成物。
50. 前記軟骨形成前駆細胞が胚様体の一部分ではない、実施形態41〜49のいずれか1つに記載の組成物。
51. 前記軟骨形成前駆細胞がクローン性細胞集団のメンバーである、実施形態41〜50のいずれか1つに記載の組成物。
SK11、SM30、MEL2、4D20.8(X4D20.8と称される場合もある)、7PEND24(X7PEND24と称される場合もある)、7SMOO32(XSMOO32と称される場合もある)およびE15ヒト胚性始原(hEP)細胞株の誘導および特性決定は、例えば、West et al., 2008 Regenerative Medicine 3(3), pp. 287-308、米国特許出願公開第2010/0184033号、Sternberg et al., (2013) Regen. Med. 8(2):125-144および米国特許出願公開第2014/0234964号(これらのすべてが、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる)に記載されている。
SK11細胞は、以下のマーカーに関して陽性であり:BEX1、COL21A1、FST、ICAM5、IL1R1、TMEM199、PTPRN、SERPINA3、SFRP2およびZIC1、かつ以下のマーカーに関して陰性である:ACTC、AGC1、ALDH1A1、AQP1、ATP8B4、C6、C20orf103、CCDC3、CDH3、CLDN11、CNTNAP2、DIO2、DKK2、EMID1、GABRB1、GSC、HOXA5、HSPA6、IF127、INA、KRT14、KRT34、IGFL3、LOC92196、MEOX1、MEOX2、MMP1、MX1、MYH3、MYH11、IL32、NLGN4X、NPPB、OLR1、PAX2、PAX9、PDE1A、PENK、PROM1、PTN、RARRES1、RASD1、RELN、RGS1、SMOC1、SMOC2、STMN2、TAC1、TFPI2、RSPO3、TNFSF7、TNNT2、TRHおよびTUBB4。SK11細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
SM30細胞は、以下のマーカーに関して陽性であり:COL15A1、CRYAB、DYSF、FST、GDF5、HTRA3、TMEM119、MMP1、MSX1、MSX2、MYL4、POSTN、SERPINA3、SRCRB4DおよびZIC2、かつ以下のマーカーに関して陰性である:ACTC、AGC1、AKRIC1、ALDH1A1、ANXA8、APCDD1、AQP1、ATP8B4、CFB、C3、C6、C7、C20orf103、CD24、CDH3、CLDN11、CNTNAP2、COMP、DIO2、METTL7A、DKK2、DLK1、DPT、FGFR3、TMEM100、FMO1、FMO3、FOXF2、GABRB1、GJB2、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSPA6、ID4、IF127、IL1R1、KCNMB1、KIAA0644、KRT14、KRT17、KRT34、IGFL3、LOC92196、MEOX1、MEOX2、MGP、MYBPH、MYH3、MYH11、NLGN4X、NPPB、OGN、OLR1、OSR2、PAX2、PAX9、PDE1A、PENK、PRG4、PROM1、PRRX1、PTN、RARRES1、RASD1、RELN、RGS1、SLITRK6、SMOC1、SMOC2、SNAP25、STMN2、TAC1、RSPO3、TNFSF7、TNNT2、TRH、TUBB4、UGT2B7およびWISP2。SM30細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
細胞株MEL2は、以下のマーカーに関して陽性であり:AKR1C1、AQP1、COL21A1、CRYAB、CXADR、DIO2、METTL7A、DKK2、DLK1、DLX5、HAND2、HSD17B2、HSPB3、MGP、MMP1、MSX2、PENK、PRRX1、PRRX2、S100A4、SERPINA3、SFRP2、SNAP25、SOX11、TFPI2およびTHY1、かつ以下のマーカーに関して陰性である:ACTC、ALDH1A1、AREG、CFB、C3、C20orf103、CD24、CDH3、CDH6、CNTNAP2、COL15A1、COMP、COP1、CRLF1、FGFR3、FMO1、FMO3、FOXF2、FST、GABRB1、GAP43、GDF5、GDF10、GJB2、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSPA6、ICAM5、KCNMB1、KRT14、KRT17、KRT19、KRT34、MASP1、MEOX1、MEOX2、MYBPH、MYH3、MYH11、TAGLN3、NPAS1、NPPB、OLR1、PAX2、PDE1A、PITX2、PRG4、PTN、PTPRN、RASD1、RELN、RGS1、SMOC1、STMN2、TACT、TNFSF7、TRH、TUBB4、WISP2、ZIC1およびZIC2。MEL2細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
細胞株4D20.8は、以下のマーカーに関して陽性であり:BEX1、CDH6、CNTNAP2、COL21A1、CRIP1、CRYAB、DIO2、DKK2、GAP43、ID4、LAMC2、MMP1、MSX2、S100A4、SOX11およびTHY1、かつ以下のマーカーに関して陰性である:AGC1、ALDH1A1、AREG、ATP8B4、CFB、C3、C7、C20orf103、CDH3、CLDN11、COP1、CRLF1、DLK1、DPT、FMO1、FMO3、GDF10、GJB2、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSD17B2、HSPA6、HSPB3、ICAM5、IFI27、IGF2、KRT14、KRT17、KRT34、MASP1、MEOX2、MSX1、MX1、MYBPH、MYH3、MYH11、TAGLN3、NPAS1、NPPB、OGN、OLR1、PAX2、PDE1A、PRG4、PROM1、PTN、PTPRN、RARRES1、RGS1、SNAP25、STMN2、TAC1、TNNT2、TRH、TUBB4、WISP2、ZIC1およびZIC2。4D20.8細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
細胞株7PEND24は、以下のマーカーに関して陽性であり:AQP1、BEX1、CDH3、DIO2、DLK1、FOXF1、FST、GABRB1、IGF2、IGFBP5、IL1R1、KIAA0644、MSX1、PODN、PRRX2、SERPINA3、SOX11、SRCRB4DおよびTFPI2、かつ以下のマーカーに関して陰性である:ACTC、AGC1、AKR1C1、ALDH1A1、ANXA8、APCDD1、AREG、CFB、C3、C6、C7、PRSS35、CCDC3、CD24、CLDN11、COMP、COP1、CXADR、DKK2、EMID1、FGFR3、FMO1、FMO3、GAP43、GDF10、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSPA6、HTRA3、ICAM5、ID4、IFI27、IFIT3、INA、KCNMB1、KRT14、KRT17、KRT34、IGFL3、LOC92196、MFAP5、MASP1、MEOX1、MEOX2、MMP1、MX1、MYBPH、MYH3、MYH11、MYL4、IL32、NLGN4X、NPPB、OGN、OSR2、PAX2、PAX9、PENK、PITX2、PRELP、PRG4、PRRX1、RARRES1、RELN、RGMA、SFRP2、SMOC1、SMOC2、SOD3、SYT12、TAC1、TNFSF7、TRH、TSLP、TUBB4、UGT2B7、WISP2、ZD52F10、ZIC1およびZIC2。7PEND24細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
細胞株7SMOO32は、以下のマーカーに関して陽性であり:ACTC、BEX1、CDH6、COL21A1、CRIP1、CRLF1、DIO2、DLK1、EGR2、FGFR3、FOXF1、FOXF2、FST、GABRB1、IGFBP5、KIAA0644、KRT19、LAMC2、TMEM119、MGP、MMP1、MSX1、MSX2、PODN、POSTN、PRG4、PRRX2、PTN、RGMA、S100A4、SERPINA3、SOX11およびSRCRB4D、かつ以下のマーカーに関して陰性である:AGC1、AKR1C1、ALDH1A1、ANXA8、APCDD1、AREG、ATP8B4、BMP4、C3、C6、C7、PRSS35、C20orf103、CCDC3、CD24、CLDN11、CNTNAP2、COL15A1、COP1、CXADR、METTL7A、DKK2、DPT、EMID1、TMEM100、FMO1、FMO3、GDF5、GDF10、GJB2、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSD17B2、HSPA6、HSPB3、HTRA3、ICAM5、ID4、IFI27、IL1R1、INA、KCNMB1、KRT14、KRT17、KRT34、IGFL3、LOC92196、MFAP5、MASP1、MEOX1、MEOX2、MYBPH、MYH3、MYH11、MYL4、IL32、NLGN4X、NPPB、OGN、OLR1、OSR2、PAX2、PAX9、PDE1A、PITX2、PRELP、PROM1、PTPRN、RASD1、RGS1、SFRP2、SMOC1、SMOC2、SOD3、STMN2、SYT12、TAC1、RSPO3、TNFSF7、TNNT2、TRH、TSLP、TUBB4、UGT2B7、WISP2、ZD52F10、ZIC1およびZIC2。7SMOO32細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
細胞株E15は、以下のマーカーに関して陽性であり:ACTC、BEX1、PRSS35、CRIP1、CRYAB、GAP43、GDF5、HTRA3、KRT19、MGP、MMP1、POSTN、PRRX1、S100A4、SOX11、SRCRB4DおよびTHY1、かつ以下のマーカーに関して陰性である:AGC1、AKR1C1、ALDH1A1、ANXA8、APCDD1、AQP1、AREG、ATP8B4、CFB、C3、C6、C7、C20orf103、CDH3、CNTNAP2、COP1、CXADR、METTL7A、DLK1、DPT、EGR2、EMID1、TMEM100、FMO1、FMO3、FOXF1、FOXF2、GABRB1、GDF10、GJB2、GSC、HOXA5、HSD11B2、HSD17B2、HSPA6、HSPB3、IFI27、IFIT3、IGF2、INA、KRT14、TMEM119、IGFL3、LOC92196、MFAP5、MASP1、MEOX1、MEOX2、MSX1、MX1、MYBPH、MYH3、MYL4、NLGN4X、TAGLN3、NPAS1、NPPB、OGN、OLR1、PAX2、PAX9、PDE1A、PENK、PITX2、PRG4、PROM1、PTPRN、RARRES1、RASD1、RELN、RGS1、SLITRK6、SMOC1、SMOC2、SNAP25、STMN2、TAC1、TFPI2、RSPO3、TNFSF7、TNNT2、TRH、TSLP、TUBB4、UGT2B7、WISP2、ZD52F10およびZIC1。E15細胞は、MSCマーカーであるCD74の発現に関して陰性である。
骨形成前駆細胞(OPC)は、例えば、SM30、MEL2およびSK11細胞株などの始原細胞のin vitro分化により、取得される。例えば、TGF-βスーパーファミリーからの1種以上のタンパク質の存在下でのSM30細胞またはMEL2細胞の培養は、始原細胞から骨形成前駆細胞への分化を誘導する。例示的なTGF-βスーパーファミリーのメンバーとしては、限定するものではないが、BMP-2、BMP-4、BMP-7およびTGF-β3が挙げられる。始原細胞を骨形成前駆細胞へと変換するために用いることができる例示的な培養条件は、米国特許出願公開第2014/0234964号に記載されている。
特定の実施形態では、本明細書中に開示される組成物は、単独で、または骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物に加えて、軟骨形成前駆細胞から取得される細胞由来調製物を含有することができ、それにより、複合移植片が提供される。例示的な軟骨形成前駆細胞は、米国特許出願公開第2010/0184033号、国際公開第2013/010045号および米国特許第8,695,386号(これらのすべてが、軟骨形成前駆細胞およびその性質を開示する目的のために、その全体で参照により本明細書中に組み入れられる)に記載されている。軟骨形成細胞から取得される生物活性因子もまた、複合移植片中の軟骨形成細胞由来の細胞由来調製物の代替物として、またはそれに加えて、用いることができる。
骨形成前駆細胞および軟骨形成前駆細胞の両方に由来する細胞由来調製物、またはそれらから誘導される生物活性因子を含有する複合移植片を、様々な筋骨格疾患の治療のために用いることができる。これらとしては、限定するものではないが、離断性骨軟骨症(OCD)および他の深部骨軟骨関節の損傷(例えば、病的状態、傷害または骨軟骨移植片を回収する処置に由来する外科的に生じた損傷)が挙げられる。
移植に先立って、それに対して細胞および生物活性物質を吸着させることができる、移植可能な生物学的担体は、当技術分野で公知である。例えば、米国特許出願公開第2004/0062753号(参照により組み入れられる)を参照されたい。開示される組成物の製造での使用のための例示的な生物学的担体としては、コラーゲン(例えば、コラーゲンスポンジ)、ヒアルロナン、フィブリン、エラスチン、ヒドロゲル(例えば、Ahmed (2015) “Hydrogel: Preparation, Characterization and Applications: A Review,” J. Advanced Res. 6(2):105-121を参照されたい)、ゼラチン、天然に存在する細胞外マトリックス(ECM)(例えば、マトリゲル(登録商標)、羊膜、脱灰骨基質)、合成ECM(例えば、組み換え的に産生されたコラーゲン)、ならびに、例えば、ポリグリコール酸(PGA)、ポリ乳酸(PLA)、ポリカプロラクトン(PCL)およびそれらの組み合わせなどの合成担体が挙げられる。例えば、ヒドロキシアパタイトおよびリン酸三カルシウムなどの種々のセラミック、ならびにコラーゲン/セラミック複合材料もまた、生物学的担体として用いることができる。
本明細書中に開示される通りの移植片形成ユニットは、骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物および/または軟骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物と組み合わされた生物学的担体を含む。細胞由来調製物は、例えば、凍結乾燥物、溶解物、抽出物、エキソソーム調製物および/または馴化培地の調製物であり得る。そのような細胞由来調製物は、互いに対して正常な生理的割合で生物活性物質の混合物を含有するであろう。骨化などのプロセスは、それぞれが最適な濃度で存在する複数の因子にしばしば依存するので、生理的割合の生物活性因子を含有する、本明細書中に記載されるものなどの組成物は、最大限有効であろう。
細胞溶解物の調製方法は、当技術分野で周知である。物理的方法としては、例えば、ブレンダーまたはホモジナイザー、超音波破砕、凍結融解および手動によるすり潰しを用いるものなどの、細胞膜の機械的破壊が挙げられる。化学的方法としては、例えば、SDS、Triton X-100、Triton N-101、Triton X-114、Triton X-405、Triton X-70S、Triton DF-16、モノラウリン酸エステル(Tween 20)、モノパルミチン酸エステル(Tween 40)、モノオレイン酸エステル(Tween 30 80)、ポリオキシエチレン-23-ラウリルエーテル(Brij 35)、ポリオキシエチレンエーテルW-l(Polyox)、コール酸ナトリウム、デオキシコール酸塩、CHAPS、サポニン、n-デシル〜-D-グルコピラノシド(glucopuranoside)、n-ヘプチル〜-D-グルコピラノシド、n-オクチル a-D-グルコピラノシドおよびNonidet P-40などの界面活性剤を用いて細胞を処理することが挙げられる。
凍結乾燥(lyophilization、すなわち、フリーズドライ(freeze-drying))は当技術分野で公知であり、低圧および低温にサンプルを供するステップを含む。
追加の実施形態では、骨形成前駆細胞および/または軟骨形成前駆細胞の溶解物を、さらに精製または分画して、細胞抽出物を得る。哺乳動物細胞の抽出物を作製するための方法は、当技術分野で公知である。続いて、抽出物を生物学的担体に添加することができ、抽出物播種担体を任意により凍結乾燥させる。
追加の実施形態では、馴化培地は、骨形成前駆細胞および/または軟骨形成前駆細胞の培養物から調製され、かつ馴化培地は、任意により、さらに精製または分画される。馴化培地、またはその画分を、生物学的担体に添加し、飽和した担体を、任意により凍結乾燥させる。
エキソソームは、30〜120nmの膜結合小胞であり、かつ広範囲の哺乳動物細胞タイプから分泌される。Keller et al., (2006) Immunol. Lett. 107 (2): 102;Camussi et al., (2010) Kidney International 78:838。エキソソームは、in vitroならびにin vivoで生育している細胞の両方に見出される。エキソソームは、組織培養培地から、ならびに血漿、尿、母乳および脳脊髄液などの体液から、単離することができる。George et al., (1982) Blood 60:834;Martinez et al., (2005) Am J. Physiol. Health. Cir. Physiol 288: H1004。エキソソームは、mRNAおよびmiRNAなどの核酸ならびに種々の増殖因子および/または分化因子などのタンパク質をはじめとする、細胞により合成される様々な分子を収容している。
上述の細胞由来調製物のいずれかを、当技術分野で周知の方法により(例えば、相分配、遠心分離、サイズ排除、クロマトグラフィー、HPLC)、かつ/または分子量、電荷密度、もしくは種々の溶液中での相対的溶解度に従って分子を分離する方法により、さらに分画することができ、それにより、1種以上の生物活性因子を含有する画分が得られる。そのような画分を、移植片形成ユニットを提供するために、生物学的担体と組み合わせることができる。
本発明の組成物は、(1)骨形成前駆細胞および/または軟骨形成前駆細胞の細胞由来調製物と(2)生物学的担体との組み合わせ、ならびに(1) 1種以上の生物活性物質と(2)生物学的担体との組み合わせを含む。組み合わせは、細胞、溶解物、抽出物、馴化培地、エキソソームまたは生物活性物質の担体への添加、および任意により、それに続く、例えば、溶解および/もしくは凍結乾燥により簡潔に組み立てることができ、または、担体を、細胞を含む培養物中に配置し、所定の時間後に取り出すことができる。次に、細胞播種担体を保存用に調製するか(例えば、凍結乾燥により)、または担体に吸着したままの細胞内の内容物を放出させる様式で処理することができる。後者の場合には、任意により、膜タンパク質を、保存および使用前に担体から除去し;これは、膜タンパク質が移植レシピエントでの炎症応答の一因となり得るからである。
本明細書中に開示される方法および組成物は、とりわけ、骨移植脊椎固定術を補助するために、または外傷および整形外科的骨再建に対して、用いることができる。本明細書中に記載される通りの移植片形成ユニットは、単独で損傷を治療するために、または、例えば自家骨移植片を補強するために組み合わせて、利用することができる。例えば、骨シェービング切片から局部的に誘導される自家骨移植片は、腸骨稜から誘導される自家骨よりも品質が低い。つまり、本明細書中に開示される移植片形成ユニットは、整形外科的骨修復処置のための自家骨移植片の使用を補助するであろう、そのまま使える骨移植用生成物を提供し、それにより、痛みおよびリスクを伴う自家骨回収プロセスを回避させる。あるいは、開示される組成物は、骨の治癒および固定を補強するために、自家骨シェービング切片と組み合わせて用いることができる。
特定の実施形態では、任意により凍結乾燥または安定化された細胞由来調製物および/または生物活性物質は、医療現場で生物学的担体に添加される。したがって、本開示は、(1)骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物および/または軟骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物ならびに(2)生物学的担体を含むシステムおよびキットを提供する。システムおよびキットは、本明細書中に記載される通りの、研究および/または治療用途に対する、細胞の増殖および使用のための試薬および材料をさらに含むことができる。
本出願中に記載される細胞株は、ブダペスト条約の下にAmerican Type Culture Collection(「ATCC」;P.O. Box 1549, Manassas, Va. 20108, USA)に寄託されている。細胞株4D20.8(ACTC84としても知られる)は第11継代で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10231を有する。細胞株SM30(ACTC256としても知られる)は第12継代で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10232を有する。細胞株7SM0032(ACTC278としても知られる)は第12継代で2009年7月23日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10233を有する。細胞株E15(ACTC98としても知られる)は継代数20で2009年9月15日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-10341を有する。細胞株MEL2(ACTC268としても知られる)は継代数22で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-11150を有する。細胞株SK11(ACTC250としても知られる)は継代数13で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-11152を有する。細胞株7PEND24(ACTC283としても知られる)は継代数11で2010年7月1日にATCCに寄託され、ATCC受託番号PTA-11149を有する。
hEP細胞株であるSM30、4D20.8、およびMEL2は、下記の例示的方法に記載される通り、in vitroで骨形成前駆体へと変換することができる。
組織培養プレートを、12μg/mLのI型コラーゲン(ゼラチン)および12μg/mLのビトロネクチンに24時間曝露した。続いて、ゼラチン/ビトロネクチン溶液を吸引除去し、細胞(SM30またはMEL2)を、コンフルエント密度で加えた。以下の成分を含む骨形成培地:DMEM(低グルコース)(L-グルタミン含有)、10%胎児ウシ血清、0.1μMデキサメタゾン、0.2mMアスコルビン酸2-リン酸塩、10mMグリセロール-2-リン酸、および100nM BMP7を添加し、細胞をさらに15〜21日間培養した。
本明細書中に開示される細胞株は、ヒアルロン酸およびゼラチンを含有する架橋型ゲルをはじめとするヒドロゲル中で、増殖因子および/もしくは分化因子の添加ありまたはなしでも分化させることができる(例えば、米国特許出願公開第2014/0234964号を参照されたい)。この方法では、細胞をトリプシン処理し、続いて、1〜30×106細胞/mLの濃度でHyStem-CSS(Glycosan Hydrogel Kit GS319)中に製造業者の指示に従って懸濁する。
細胞を、1.4mLのHystem:Gelin-Sミックス中に2×107細胞/mLの密度で懸濁する。続いて、0.35mLのPEGSSDA溶液を加え、気泡を作らずにピペットで出し入れし、100μLのアリコートを、複数の24ウェルインサート(Corning社、カタログ番号3413)へと素早く載せる。約20分間のうちにゲル化が起こったら、封入された細胞に2mLの完全軟骨形成培地(Lonza不完全培地+TGF-β3(Lonza社、PT-4124))を加える。不完全軟骨形成培地は、hMSC Chondro BulletKit(PT-3925)と、これに加えられた添加物 (Lonza, Basel, Switzerland;Poietics Single-Quots、カタログ番号PT-4121)からなる。不完全軟骨形成培地を調製するために加えられる添加物は、以下の通りである:デキサメタゾン(PT-4130G)、アスコルビン酸塩(PT-4131G)、ITS+サプリメント(4113G)、ピルビン酸塩(4114G)、プロリン(4115G)、ゲンタマイシン(4505G)、およびグルタミン(PT-4140G)。無菌凍結乾燥TGF-β3を、無菌の4mM HCl(1mg/mLウシ血清アルブミン(BSA)含有)の添加により、20μg/mLの濃度に再調製し、アリコートに分けて−80℃で保存する。完全軟骨形成培地は、1μLの再調製されたTGF-β3をそれぞれ2mLの不完全軟骨形成培地に添加することにより、使用直前に調製する(最終的なTGF-β3濃度は10ng/mL)。細胞に、週3回、再度培地を加え、合計で14日間培養する。続いて、細胞を溶解させて、所望であれば、RNeasy microキット(Qiagen社、カタログ番号74004)を用いてRNAを回収することができる。
骨形成前駆細胞を含有する移植片の骨形成能力を試験するために、ヌードラット骨誘導モデルを用いた。簡潔には、コラーゲンスポンジスキャホールドと組み合わせた、記載される通りに以前に単離および特性決定されている細胞株SM30またはMEL2(West et al., Regen. Med. 3: 287-308 (2008))由来の溶解物から構成される移植片形成ユニットを、ヌードラットの背中の筋内の空隙(intramuscular pouch)に移植し、異所的な骨形成の程度を評価した。
細胞株SM30(第22継代)を、10ng/mLのTGF-β3の存在下で14日間、製造業者の説明書に従って(Glycosan社)、ヒアルロン酸およびゼラチンのPEGDA架橋型ポリマーであるHyStemヒドロゲル中で分化させた。SM30細胞を、in vitroで21倍を超えて増殖させ、コンフルエンスまで生育させ、かつ血清および本明細書中に記載される通りの他のマイトジェンを10分の1まで減少させて添加した培地を用いて培地を交換することにより同期して休眠させるか(CTRL)、または本明細書中に記載される通りの微量培養条件(micromass condition)で分化させるか(MM)、または10ng/mLのTGF-β3、25ng/mL TGF-β3、10ng/mL BMP4、30ng/mL BMP6、100ng/mL BMP7、100ng/mL GDF5、もしくはこれらの増殖因子の組み合わせのいずれかの存在下で14日間、製造業者の説明書に従って(Glycosan社)、ヒアルロン酸およびゼラチンのPEGDA架橋型ポリマーであるHyStemヒドロゲル中で分化させた。簡潔には、ヒドロゲル/細胞製剤は、以下の通りに調製した:HyStem(Glycosan, Salt Lake, Utah;HyStem-CSSカタログ番号GS319)を製造業者の説明書に従って再構成させた。簡潔には、Hystem(チオール修飾型ヒアルロナン、10mg)を1mLの脱気した脱イオン水中に溶解させ(約20分間かかる)、1%溶液を調製した。Gelin-S(チオール修飾型ゼラチン、10mg)を1mLの脱気した脱イオン水中に溶解させ、1%溶液を調製し、PEGSSDA(ジスルフィド含有ジアクリル酸PEG、10mg)を0.5mLの脱気した脱イオン水中に溶解させ、2%溶液を調製した。続いて、HyStem(1mL、1%)を、使用の直前に、気泡を作らずにGelin-S(1mL、1%)と混合する。ペレット化した細胞を、調製したばかりの上記HyStem:Gelin-S(1:1)ミックス中に再懸濁した。架橋型PEGSSDA(ジスルフィド含有ジアクリル酸ポリエチレングリコール)の添加時に、100μLの細胞懸濁物を、最終濃度20×106細胞/mLで、複数の24ウェルプレート、6.5mmポリカーボネート(0.4μM孔径)トランスウェルインサート(Corning 3413)へとアリコートに分ける。約20分間のゲル化に続いて、軟骨形成培地を各ウェルに加える。続いて、プレートを、37℃、周囲O2濃度、10%CO2で加湿インキュベーターに入れ、細胞に週3回、培地を添加した。これらの条件下で、SM30は、50.0ng/mL BMP2および10ng/mL TGF-β3、ならびに10mg/mL BMP4および10ng/mL TGF-β3の存在下で、比較的高レベルの骨シアロタンパク質II(IBSP、骨形成性細胞の分子マーカー)ならびに非常に高レベルのCOL2A1およびCOL10A1を発現し、このことは、中間的な肥大軟骨細胞形成(すなわち、軟骨内骨化)を示唆した。それらよりは低いが、それでもなお上昇したレベルのIBSP発現が、10ng/mL TGF-β3でのペレット培養中の細胞株MEL2でも観察された。
SM30、4D20.8またはMEL2細胞は、実施例1に記載される通りに骨形成前駆細胞へと分化するために誘導される。エキソソームは、37℃、5%CO2および1%O2で16時間、加湿組織培養インキュベーター中で培養された骨形成前駆細胞により馴化された培地から単離される。リン酸緩衝生理食塩液(PBS)を、最終濃度0.1mL/cm2まで培養物に添加し、馴化培地を作製する。あるいは、胎児ウシ血清または増殖因子添加剤を含有しない基礎EGM培地(Promocell, Heidelberg, Germany)が、PBSの代わりになる。この培地は、37℃、5%CO2および1%O2で16時間、加湿組織培養インキュベーター中で細胞により馴化される。リン酸緩衝生理食塩液(PBS)を、最終濃度0.1mL/cm2まで培養物に添加し、馴化培地を作製する。あるいは、胎児ウシ血清または増殖因子添加剤を含有しない基礎EGM培地(Promocell, Heidelberg, Germany)が、PBSの代わりになる。
エキソソーム(新鮮または解凍)を、支持体へとエキソソーム懸濁物を1滴ずつ添加することにより、コラーゲンゲルもしくはスポンジなどの生物学的担体、または合成生体材料に(任意により、無菌的に)添加し、続いて凍結乾燥させる。様々な範囲のエキソソーム濃度、例えば、1×106〜1×109エキソソーム/cc生物学的または合成担体を用いることができる。ラット異所的移植片に関しては、合計約0.5ccの担体が用いられる。エキソソーム粒子濃度に応じて、合計で8×105〜1×106個の粒子が、200〜500μLの滴下添加により、担体に付加される。
馴化培地(例えば、骨形成前駆細胞および/または軟骨形成前駆細胞由来)を、限定するものではないが、エキソソームをはじめとする分泌因子の混合物を含有する移植片形成ユニットを調製するために用いることができる。馴化培地は、上記の通り、骨形成誘導または軟骨形成誘導後の細胞から回収される。
実施例7で上記に説明された通りに取得される5mLの濃縮された馴化培地を、HPLCにより分画する。移植に先立って、特定のHPLC画分を、単独で、または他の画分と組み合わせて、上記の通りに生物学的担体に添加する。
4D20.8細胞、7PEND24細胞、7SMOO32細胞、またはE15細胞を、以前に記載された条件を用いて単層で生育させ、増殖させる(Sternberg et al., Regen. Med., vol. 8, no. 2, pp. 125-144, 2013;米国特許出願公開第2014/0234964号)。組織培養増殖後、細胞を(例えば、トリプシン-EDTAまたはAccutaseを用いて)37℃で3〜5分間、分散させ、DMEM(高グルコース)、ペニシリン/ストレプトマイシン(100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン)、GlutaMAXTM(2mM)、ピルビン酸塩(10mM)、デキサメタゾン(0.1μM)、L-プロリン(0.35mM)、2-ホスホ-L-アスコルビン酸(0.17mM)、ITS(6.25μg/mLトランスフェリン、6.25ng/mL亜セレン酸、1.25mg/mL血清アルブミンおよび5.35μg/mLリノール酸)+10ng/mL TGF-β3および10ng/mL BMP-4または100ng/mL GDF5のいずれかからなる軟骨形成分化培地中に再懸濁させる。次に、細胞を組織培養ディッシュに播種し、1週間から4週間の範囲の期間、維持する。軟骨形成分化後、細胞、またはそれに由来する細胞由来調製物を、生物学的担体に付加して、軟骨層を形成させる。担体への軟骨形成性細胞(またはそれに由来する細胞由来調製物)の付加の前、または後に、骨形成性細胞(またはそれに由来する細胞由来調製物)を同じ担体に付加して、骨形成層を形成させる。
Claims (51)
- (a) 骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物、および
(b) 生物学的担体
を含む組成物であって、
該骨形成前駆細胞は、間葉系幹細胞ではない、上記組成物。 - 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、請求項1に記載の組成物。 - 前記骨形成前駆細胞が、始原細胞の分化により取得される、請求項1または2のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記始原細胞がクローン性胚性始原細胞である、請求項3に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞が、SM30、MEL2、SK11および4D20.8からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、請求項1または2のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞が、TGF-β3、BMP-2、またはその両方の存在下で始原細胞を培養することにより取得される、請求項5に記載の組成物。
- 前記始原細胞が、以下のマーカー:MMP1、MYL4、ZIC2、DIO2、DLK1、HAND2、SOX11、COL21A1、PTPRNおよびZIC1のうちの1種以上を発現する、請求項3〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞が、インテグリン結合性シアロタンパク質(IBSP)、オステオポンチン(SPP1)、アルカリホスファターゼ組織非特異型アイソザイム(ALPL)、およびBMP-2から選択される1種以上のマーカーを発現する、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞がヒト細胞である、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞が胚様体の一部分ではない、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記骨形成前駆細胞がクローン性細胞集団のメンバーである、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 軟骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物をさらに含み、該軟骨形成前駆細胞は、始原細胞の分化により取得される、請求項1〜11のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 軟骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 軟骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 軟骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 軟骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 軟骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、請求項12に記載の組成物。 - 前記軟骨形成前駆細胞が、4D20.8、7PEND24、7SMOO32およびE15からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、請求項12または13のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記始原細胞が、以下のマーカー:DIO2、DLK1、FOXF1、GABRB1、COL21A1、およびSRCRB4Dのうちの1種以上を発現する、請求項12〜14のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞が、II型コラーゲンα1(COL2A1)およびアグレカン(aggrecan;ACAN)から選択される1種以上のマーカーを発現する、請求項12〜15のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生物学的担体が、コラーゲン、セラミックでコーティングされたコラーゲン、ヒドロゲル、またはセラミックが添加されたヒドロゲルである、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記生物学的担体が、脱灰骨基質(DBM)ではない、請求項1〜16のいずれか1項に記載の組成物。
- 滅菌される、請求項1〜18のいずれか1項に記載の組成物。
- 請求項1〜19のいずれか1項に記載の組成物を被験体に移植するステップを含む、被験体での骨および/または軟骨の形成を促進するための方法。
- 前記被験体がヒトである、請求項20に記載の方法。
- 前記被験体が非ヒト動物である、請求項20に記載の方法。
- (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCを生物学的担体と組み合わせるステップ;および
(d) ステップ(c)の組み合わせを凍結乾燥させるステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCを生物学的担体と組み合わせるステップ;および
(d) 該生物学的担体上に存在する該細胞を溶解して移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCの溶解物を取得するステップ;および
(d) 該溶解物を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCの抽出物を取得するステップ;および
(d) 該抽出物を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該OPCからエキソソームを調製するステップ;および
(d) 該エキソソームを生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - (a) 培養物中で始原細胞を生育させるステップ;
(b) 培養物中で該始原細胞を骨形成前駆細胞(OPC)へと分化させるステップ;
(c) 該培養物由来の馴化培地を取得するステップ;および
(d) 該馴化培地を生物学的担体と組み合わせて移植片形成ユニットを生成するステップ
を含む、骨形成を促進するための治療用組成物の作製方法。 - ステップ(d)に続いて、
(e) ステップ(d)の移植片形成ユニットを凍結乾燥させるステップ
をさらに含む、請求項24〜28のいずれか1項に記載の方法。 - 前記始原細胞がクローン性胚性始原細胞である、請求項23〜29のいずれか1項に記載の方法。
- 前記始原細胞が、SM30、MEL2、SK11および4D20.8細胞株からなる群より選択される、請求項23〜30のいずれか1項に記載の方法。
- 前記始原細胞が、以下のマーカー:MMP1、MYL4、ZIC2、DIO2、DLK1、HAND2、SOX11、COL21A1、PTPRNおよびZIC1のうちの1種以上を発現する、請求項23〜31のいずれか1項に記載の方法。
- TGF-β3、BMP-2、またはその両方の存在下で前記始原細胞を培養することにより、該始原細胞をOPCへと分化させる、請求項23〜32のいずれか1項に記載の方法。
- 前記OPCが、骨シアロタンパク質II(IBSP)、オステオポンチン(SPP1)およびアルカリホスファターゼ組織非特異型アイソザイム(ALPL)から選択される1種以上のマーカーを発現する、請求項23〜33のいずれか1項に記載の方法。
- 前記OPCがヒト細胞である、請求項23〜34のいずれか1項に記載の方法。
- 前記OPCの培養物が胚様体を含まない、請求項23〜35のいずれか1項に記載の方法。
- 前記OPCの培養物がクローン性培養物である、請求項23〜36のいずれか1項に記載の方法。
- 前記生物学的担体が、コラーゲン、セラミックでコーティングされたコラーゲン、ヒドロゲル、またはセラミックが添加されたヒドロゲルである、請求項23〜37のいずれか1項に記載の方法。
- 前記コラーゲンがゼラチンである、請求項38に記載の方法。
- 前記生物学的担体が、脱灰骨基質(DBM)ではない、請求項23〜39のいずれか1項に記載の方法。
- (a) 軟骨形成前駆細胞由来の細胞由来調製物、および
(b) 生物学的担体
を含む組成物であって、
該軟骨形成前駆細胞は、間葉系幹細胞ではない、上記組成物。 - 前記細胞由来調製物が、以下の調製物:
(a) 軟骨形成前駆細胞の凍結乾燥物;
(b) 軟骨形成前駆細胞の溶解物;
(c) 軟骨形成前駆細胞の抽出物;
(d) 軟骨形成前駆細胞由来のエキソソーム懸濁物;および
(e) 軟骨形成前駆細胞由来の馴化培地
のうちの1種以上からなる群より選択される、請求項41に記載の組成物。 - 前記軟骨形成前駆細胞が、始原細胞の分化により取得される、請求項41または42のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記始原細胞がクローン性胚性始原細胞である、請求項43に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞が、4D20.8、7PEND24、7SMOO32およびE15からなる群より選択されるクローン性始原細胞株の分化により取得される、請求項41または42のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞が、TGF-β3、GDF5、BMP-4、またはそれらの組み合わせの存在下で始原細胞を培養することにより得られる、請求項45に記載の組成物。
- 前記始原細胞が、以下のマーカー:DIO2、DLK1、FOXF1、GABRB1、COL21A1、およびSRCB4Dのうちの1種以上を発現する、請求項43〜46のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞が、COL2A1およびACANから選択される1種以上のマーカーを発現する、請求項41〜47のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞がヒト細胞である、請求項41〜48のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞が胚様体の一部分ではない、請求項41〜49のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記軟骨形成前駆細胞がクローン性細胞集団のメンバーである、請求項41〜50のいずれか1項に記載の組成物。
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