CN110684710A - 一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开的属于骨膜生物支架技术领域，具体为一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，该培养方法如下：步骤一：选取骨膜；步骤二：对骨膜进行冲洗和消化获得生物支架；步骤三：测定细胞成分残留；步骤四：测定骨膜细胞外基质中胶原和糖胺多糖的保留情况；步骤五：用空白DBM材料将细胞植入，并对原细胞冻存后复苏，测量生长曲线，对其增值能力的变化进行观察；步骤六：将DBM复合物植入实验体皮下，对不同时间点取材进行HE、VG、Masson染色观察，通过运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜去细胞生物支架细胞去除彻底，细胞外基质的结构及主要成分保留完好且生物相容性良好，有效的减少了排异反应。
Description
技术领域
本发明涉及骨膜生物支架技术领域，具体为一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法。
背景技术
骨膜具有较强的成骨能力,在骨折愈合修复方面扮演着重要角色，骨膜也被认为是促进骨移植材料在移植区域发挥修复作用的始动因素。然而自体骨膜移植存在供体不足、供区结构功能损害等问题，而异体骨膜移植则存在严重的免疫排斥反应等问题。因此解决异体骨膜中的免疫排斥问题将是实现骨膜移植的重要环节。组织中具有主要免疫源性的成份为细胞，在去除细胞的同时也意味着免疫源性的去除。目前去除细胞的方法主要包括物理方法、化学方法和酶法。
骨膜组织通过物理、化学及相关酶的作用后虽然可以有效去除具有免疫源性的细胞成份，然而处理过程中势必会对细胞外基质的成份和结构造成不可避免的破坏，进而影响该支架的生物相容性，令细胞难以与其复合。因此，通过优化脱免疫源性的处理所获取的理想的无免疫源性骨膜生物支架应是在去除细胞成份的同时又尽可能完整地保留支架细胞外基质的主要生物活性成份及结构，为异体种子细胞地长入提供一个合适的、天然的生长空间。另一方面，支架材料和种子细胞是骨组织工程中必不可少的两个核心环节，支架材料在体外复合种子细胞可以保证其植入靶位置后具有更强的修复重建能力。
现有的骨膜生物支架在与异体种子细胞培养复合时，会产生排异的情况，造成复合的时间缓慢，影响效率。
发明内容
本部分的目的在于概述本发明的实施方式的一些方面以及简要介绍一些较佳实施方式。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。
鉴于上述和/或现有骨膜生物支架与异体种子细胞复合方法中存在的问题，提出了本发明。
因此，本发明的目的是提供一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，能够对原骨膜生物支架上的细胞去除彻底，同时提高与异体种子细胞的复合相容性。
为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：
一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，该培养方法如下：
步骤一：选取骨膜；
步骤二：对骨膜进行冲洗和消化获得生物支架；
步骤三：测定细胞成分残留；
步骤四：测定骨膜细胞外基质中胶原和糖胺多糖的保留情况；
步骤五：用空白DBM材料将细胞植入，并对原细胞冻存后复苏，测量生长曲线，对其增值能力的变化进行观察；
步骤六：将DBM复合物植入实验体皮下，对不同时间点取材进行HE、VG、Masson染色观察。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤一中骨膜选取实验体的游离双侧胫骨近端内侧骨膜。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤二中生物支架的主要获取方式如下：
步骤一：将收到的骨膜进行物理冻融，在零下80oC的环境中存放24h；
步骤二：通过Triton-X100、SDS去污剂对骨膜进行洗脱；
步骤三：通过DNA酶和RNA酶进行酶解消化获得细胞生物支架。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤三中细胞成分测定残留的方法为通过DNA定量分析、HE染色、DAPI染色测定细胞成分残留。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤四中胶原和糖胺多糖的保留情况的测定方法为通过天狼星红染色和阿里新蓝染色观察测定。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤五中原细胞冻存复苏时间为30天。
作为本发明所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的一种优选方案，其中：所述步骤六中不同时间点分别为术后1、3、6月。
与现有技术相比：现有的骨膜生物支架在与异体种子细胞培养复合时，会产生排异的情况，造成复合的时间缓慢，影响效率，本申请文件中，运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜去细胞生物支架细胞去除彻底，细胞外基质的结构及主要成分保留完好且生物相容性良好，有效的减少了排异反应。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将结合附图和详细实施方式对本发明进行详细说明，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：
图1为本发明一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法的流程结构示意图。
具体实施方式
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施方式做详细的说明。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施方式的限制。
其次，本发明结合示意图进行详细描述，在详述本发明实施方式时，为便于说明，表示器件结构的剖面图会不依一般比例作局部放大，而且所述示意图只是示例，其在此不应限制本发明保护的范围。此外，在实际制作中应包含长度、宽度及深度的三维空间尺寸。
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的实施方式作进一步地详细描述。
本发明提供一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，该培养方法如下：
步骤一：选取骨膜；
步骤二：对骨膜进行冲洗和消化获得生物支架；
步骤三：测定细胞成分残留；
步骤四：测定骨膜细胞外基质中胶原和糖胺多糖的保留情况；
步骤五：用空白DBM材料将细胞植入，并对原细胞冻存后复苏，测量生长曲线，对其增值能力的变化进行观察；
步骤六：将DBM复合物植入实验体皮下，对不同时间点取材进行HE、VG、Masson染色观察。
其中，所述步骤一中骨膜选取实验体的游离双侧胫骨近端内侧骨膜。
其中，所述步骤二中生物支架的主要获取方式如下：
步骤一：将收到的骨膜进行物理冻融，在零下80oC的环境中存放24h；
步骤二：通过Triton-X100、SDS去污剂对骨膜进行洗脱；
步骤三：通过DNA酶和RNA酶进行酶解消化获得细胞生物支架。
其中，所述步骤三中细胞成分测定残留的方法为通过DNA定量分析、HE染色、DAPI染色测定细胞成分残留。
其中，所述步骤四中胶原和糖胺多糖的保留情况的测定方法为通过天狼星红染色和阿里新蓝染色观察测定。
其中，所述步骤五中原细胞冻存复苏时间为30天。
其中，所述步骤六中不同时间点分别为术后1、3、6月。
按照以上方法，运用物理冻融、去污剂洗脱和酶消化等方法所获取的骨膜去细胞生物支架细胞去除彻底，细胞外基质的结构及主要成分保留完好且生物相容性良好，有效的减少了排异反应。
虽然在上文中已经参考实施方式对本发明进行了描述，然而在不脱离本发明的范围的情况下，可以对其进行各种改进并且可以用等效物替换其中的部件。尤其是，只要不存在结构冲突，本发明所披露的实施方式中的各项特征均可通过任意方式相互结合起来使用，在本说明书中未对这些组合的情况进行穷举性的描述仅仅是出于省略篇幅和节约资源的考虑。因此，本发明并不局限于文中公开的特定实施方式，而是包括落入权利要求的范围内的所有技术方案。
Claims (7)
1.一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：该培养方法如下：
步骤一：选取骨膜；
步骤二：对骨膜进行冲洗和消化获得生物支架；
步骤三：测定细胞成分残留；
步骤四：测定骨膜细胞外基质中胶原和糖胺多糖的保留情况；
步骤五：用空白DBM材料将细胞植入，并对原细胞冻存后复苏，测量生长曲线，对其增值能力的变化进行观察；
步骤六：将DBM复合物植入实验体皮下，对不同时间点取材进行HE、VG、Masson染色观察。
2.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤一中骨膜选取实验体的游离双侧胫骨近端内侧骨膜。
3.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤二中生物支架的主要获取方式如下：
步骤一：将收到的骨膜进行物理冻融，在零下80oC的环境中存放24h；
步骤二：通过Triton-X100、SDS去污剂对骨膜进行洗脱；
步骤三：通过DNA酶和RNA酶进行酶解消化获得细胞生物支架。
4.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤三中细胞成分测定残留的方法为通过DNA定量分析、HE染色、DAPI染色测定细胞成分残留。
5.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤四中胶原和糖胺多糖的保留情况的测定方法为通过天狼星红染色和阿里新蓝染色观察测定。
6.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤五中原细胞冻存复苏时间为30天。
7.根据权利要求1所述的一种骨膜生物支架与异体种子细胞复合的培养方法，其特征在于：所述步骤六中不同时间点分别为术后1、3、6月。
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